邢智芹

（煙臺(tái)職業(yè)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264670）

葡萄糖氧化酶可以加快β-D-葡萄糖的氧化，形成過(guò)氧化氫和葡萄糖酸，具有較高的專(zhuān)一性和選擇性，目前已經(jīng)被批準(zhǔn)作為飼料添加劑在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用[1]。大量研究表明，動(dòng)物飼料中添加葡萄糖氧化酶可以提升飼料質(zhì)量和品質(zhì)，保證動(dòng)物消化系統(tǒng)健康，減少飼料中霉菌毒素對(duì)動(dòng)物的危害，因此葡萄糖氧化酶可作為飼用抗生素替代品在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用[2-4]。在飼料無(wú)抗背景下，斷奶仔豬腸道健康問(wèn)題凸顯，成為制約生豬養(yǎng)殖發(fā)展的核心問(wèn)題，開(kāi)發(fā)飼用抗生素替代產(chǎn)品對(duì)改善仔豬腹瀉、促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)具有重要意義[5-6]。目前，葡萄糖氧化酶在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用已經(jīng)初具成效[7]，但葡萄糖氧化酶對(duì)改善斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的作用機(jī)制仍未完全明確，并且缺乏葡萄糖氧化酶對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益影響的研究。因此，本試驗(yàn)研究不同水平葡萄糖氧化酶對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的影響，為其在斷奶仔豬養(yǎng)殖中應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)材料

斷奶仔豬為28日齡、體重接近的“杜×長(zhǎng)×大”三元豬，總計(jì)200 頭。試驗(yàn)場(chǎng)地為煙臺(tái)惠牧養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)合作社。葡萄糖氧化酶購(gòu)自湖南福來(lái)格生物技術(shù)有限公司，酶活力為1×104U/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照隨機(jī)分組原則，將試驗(yàn)仔豬分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭斷奶仔豬。對(duì)照組斷奶仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧，分別在基礎(chǔ)日糧中添加50、100、150 mg/kg 的葡萄糖氧化酶。斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧依據(jù)《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 65—2004）制定。基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。預(yù)試期3 d，正式試驗(yàn)期28 d。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)管理

正式試驗(yàn)開(kāi)始與結(jié)束前12 h禁食，對(duì)仔豬進(jìn)行稱(chēng)重。試驗(yàn)期間，保證試驗(yàn)仔豬自由采食、飲水。每日7：30記錄飼糧投喂量和剩余量，每間隔4 h觀察豬舍內(nèi)溫濕度和豬健康狀況，詳細(xì)記錄和及時(shí)采取措施。其他管理參考養(yǎng)殖場(chǎng)規(guī)章制度。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)最后1 d，以重復(fù)為單位，統(tǒng)計(jì)斷奶仔豬試驗(yàn)期間采食量、試驗(yàn)?zāi)┲亍⒏篂a及死亡數(shù)，計(jì)算斷奶仔豬平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）、腹瀉率、成活率（SR）及料重比（F/G）。

1.4.2 樣品采集

每個(gè)重復(fù)中選擇1 頭接近該組平均體重的仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血，獲取約5 mL 靜脈血，靜置10 min，3 000 r/min離心5 min，將上清液置于-20 ℃冰箱中保存。采血完畢后，將仔豬放血致死，并取背最長(zhǎng)肌樣品約5 g置于液氮罐中保存，用于基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。

1.4.3 血清抗氧化指標(biāo)

血清抗氧化指標(biāo)包括：血清總抗氧化能力（T-AOC），過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。相關(guān)試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4.4 血清免疫指標(biāo)

免疫指標(biāo)包括：血清中免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、補(bǔ)體C3、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）。相關(guān)試劑盒購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4.5 生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)量

使用qPCR 對(duì)豬背最長(zhǎng)肌IGF-1 和豬背最長(zhǎng)肌IGF-2基因進(jìn)行定量。將液氮罐中肌肉樣品取出，通過(guò)TRIzol法提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA，使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線、溶解曲線和對(duì)應(yīng)的Ct值計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，基因引物序列見(jiàn)表2。引物通過(guò)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站進(jìn)行設(shè)計(jì)，參考基因組為Sus scrofa11.1。

表2 基因引物序列

1.4.6 經(jīng)濟(jì)指標(biāo)

本研究以各組每頭仔豬試驗(yàn)階段創(chuàng)造的養(yǎng)殖利潤(rùn)為主要指標(biāo)，對(duì)葡萄糖氧化對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。

其中，斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧價(jià)格約為5 438 元/t，葡萄糖氧化酶價(jià)格約為82.46 元/kg，仔豬銷(xiāo)售價(jià)格約為42.09元/kg。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 9.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），若差異顯著則使用Duncan's 進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。各性能指標(biāo)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，經(jīng)濟(jì)效益指標(biāo)以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表3）

表3 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表3 可知，100 mg/kg 組和150 mg/kg 組仔豬ADG顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），100 mg/kg 組仔豬ADG 平均值為各組最高；100 mg/kg 組和150 mg/kg 組仔豬F/G 顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），且100 mg/kg組仔豬F/G為各組最低；試驗(yàn)組仔豬腹瀉率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表4）

表4 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，100 mg/kg組仔豬血清T-AOC、GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。各試驗(yàn)組仔豬血清SOD活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。100 mg/kg 組仔豬血清MDA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬血清免疫指標(biāo)的影響（見(jiàn)表5）

表5 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表5 可知，100 mg/kg 組仔豬血清中IgG 和TNF-α含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)組仔豬血清IL-6含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響（見(jiàn)表6）

表6 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由表6 可知，日糧中不同水平的葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬背最長(zhǎng)肌IGF-1 基因的表達(dá)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。100 mg/kg組和150 mg/kg 組仔豬背最長(zhǎng)肌IGF-2 基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.5 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的影響（見(jiàn)表7）

表7 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的影響

由表7 可知，日糧中添加葡萄糖氧化酶使仔豬試驗(yàn)階段采食量上升，各試驗(yàn)組仔豬飼糧成本分別比對(duì)照組高0.78%、1.70%、0.89%。各試驗(yàn)組仔豬葡萄糖氧化酶使用成本分別為0.06、0.11、0.17 元/頭。葡萄糖氧化酶可通過(guò)提高仔豬ADG，從而提高試驗(yàn)階段的仔豬增重收入，各試驗(yàn)組仔豬增重收入分別比對(duì)照組高2.57%、9.34%、5.17%，試驗(yàn)組仔豬養(yǎng)殖利潤(rùn)分別比對(duì)照組高7.80、29.28、16.14元/頭。

3 討論

3.1 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

葡萄糖氧化酶可以直接改善仔豬腸道pH值和腸道組織形態(tài)，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[8]。何佳[9]分別在斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加75 mg/kg 金霉素+160 mg/kg 土霉素鈣（B 組）、150 g/t 葡萄糖氧化酶（C 組）和金霉素75 mg/kg+土霉素鈣60 mg/kg+100 g/t 葡萄糖氧化酶（D組），結(jié)果表明，B組和C組仔豬試驗(yàn)?zāi)┲仫@著高于對(duì)照組；C 組和D 組仔豬ADG 和ADFI 顯著高于對(duì)照組和B組；試驗(yàn)組仔豬的F/G均顯著高于對(duì)照組。馬菲璐等[10]分別在斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加100、200 mg/kg 的葡萄糖氧化酶，發(fā)現(xiàn)200 mg/kg 組仔豬ADG 和F/G 顯著上升；100 mg/kg組仔豬生長(zhǎng)性能優(yōu)于對(duì)照組。侯振平等[11]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶可以顯著降低斷奶仔豬腹瀉率。本研究結(jié)果表明，葡萄糖氧化酶可以提高仔豬ADG，降低F/G和腹瀉率。因此，日糧中添加葡萄糖氧化酶有助于提高仔豬生長(zhǎng)速度和飼料報(bào)酬，降低仔豬腹瀉率，有助于改善仔豬生長(zhǎng)性能。

3.2 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

血清T-AOC、CAT、GSH-Px 和SOD 活性可以有效反映機(jī)體抗氧化能力[12]。SOD 和GSH-Px 是清除體內(nèi)自由基的重要酶，CAT主要是催化過(guò)氧化氫分解，3種酶對(duì)機(jī)體避免氧化損傷具有重要作用[13]。T-AOC反映機(jī)體非酶性和酶性抗氧化物的總體水平，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，可以反映體內(nèi)氧化反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷程度[14]。何佳[9]研究表明，150 g/t 葡萄糖氧化酶可以顯著提高仔豬血清SOD活性，降低MDA含量。陳銘嘉[8]研究表明，日糧中添加500～2 000 g/t 的葡萄糖氧化酶可以顯著提高仔豬血清中GSH-Px 和SOD 活性。Dang 等[15]在斷奶仔豬日糧中分別添加0.01%、0.03%、0.05%的葡萄糖氧化酶添加劑（1 000 U/g），結(jié)果表明，斷奶仔豬ADG、GSH-Px 活性和谷胱甘肽含量隨著葡萄糖氧化酶添加量的上升呈顯著增加趨勢(shì)。Sun等[16]在仔豬日糧中添加40 U/kg葡萄糖氧化酶、50 U/kg過(guò)氧化氫酶、40 U/kg葡萄糖氧化酶+50 U/kg過(guò)氧化氫酶，結(jié)果表明，單獨(dú)添加葡萄糖氧化酶或過(guò)氧化氫酶與兩者同時(shí)使用無(wú)顯著差異，添加葡萄糖氧化酶可提高SOD或CAT活性，降低腸道和血液中MDA含量。本研究表明，日糧中添加適量的葡萄糖氧化酶可以顯著提高T-AOC、GSH-Px 和SOD 活性，減少血清中MDA含量，與上述研究結(jié)果一致，說(shuō)明日糧中添加葡萄糖氧化酶可以提高斷奶仔豬機(jī)體抗氧化能力。

3.3 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

免疫球蛋白是仔豬體內(nèi)發(fā)揮免疫功能的重要活性物質(zhì)[17]，補(bǔ)體C3是由巨噬細(xì)胞合成的免疫介質(zhì)，幫助殺死細(xì)菌和病毒[18]。TNF-α、IL-6 是體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)和T 細(xì)胞活化過(guò)程中具有重要作用[19]。王敏等[20]在仔豬基礎(chǔ)日糧中添加750 U/kg 葡萄糖氧化酶+300 mg/kg 博落回散，結(jié)果表明，試驗(yàn)組仔豬F/G 顯著下降，血清IgG 和IL-6 含量顯著上升。馬菲璐等[10]研究認(rèn)為，日糧中添加葡萄糖氧化酶還可以提高仔豬血清中IgA、IgM、TNF-α 和IL-6 含量。穆淑琴等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加400 g/t 葡萄糖氧化酶，仔豬血清IgG、IgA、IgM、TNF-α 含量顯著高于抗生素組和對(duì)照組，且IL-2、IL-4平均含量高于抗生素組和對(duì)照組。陳瑾等[22]在川藏黑豬商品仔豬的基礎(chǔ)日糧中分別添加抗生素（陽(yáng)性對(duì)照組）、葡萄糖氧化酶（50 U/kg），結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，葡萄氧化酶組仔豬血清IgG、TNF-α和IL-6含量顯著低于IL-2含量。結(jié)合本研究結(jié)果，可以認(rèn)為日糧中添加適量的葡萄糖氧化酶可以提高仔豬體內(nèi)免疫水平，從而保證仔豬健康發(fā)育。

3.4 葡萄糖氧化酶對(duì)IGF-1和IGF-2基因表達(dá)的影響

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）和胰島素樣生長(zhǎng)因子-2（IGF-2）與動(dòng)物生長(zhǎng)相關(guān)[23]。IGF-1蛋白的作用與胰島素類(lèi)似，在促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育方面具有重要作用[24]。有研究表明，IGF-1參與體內(nèi)葡萄糖代謝，且不同豬品種表達(dá)量存在差異[25]。IGF-2是生長(zhǎng)激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要成員，其表達(dá)量與肌肉合成和ADG呈正相關(guān)[26]，尤其是在骨骼肌生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用[27]。葉幫同[28]分別使用玉米-豆粕型日糧、玉米-豆粕型日糧+1 000 IU/kg、玉米-淀粉-豆粕型日糧+1 000 IU/kg葡萄糖氧化酶對(duì)肉雞進(jìn)行飼喂，結(jié)果表明，與基礎(chǔ)日糧組相比，日糧中添加葡萄糖氧化酶可以顯著促進(jìn)IGF-1 的合成。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加100、150 mg/kg 葡萄糖氧化酶可以顯著促進(jìn)IGF-2基因的表達(dá)，與上述研究不同的原因可能是物種不同所引起的差異，但可以說(shuō)明日糧中添加葡萄糖氧化酶可以上調(diào)肌肉中IGF家族基因的表達(dá)而改善仔豬生長(zhǎng)性能。

3.5 葡萄糖氧化酶對(duì)仔豬養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的影響

分析試驗(yàn)階段養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益有助于尋找葡萄糖氧化酶在斷奶仔豬日糧中的最適添加量，指導(dǎo)斷奶仔豬實(shí)際生產(chǎn)。本研究中，添加葡萄糖氧化酶使飼料成本有所上升，但仔豬增重收入獲得更大的提升。因此各試驗(yàn)組養(yǎng)殖利潤(rùn)整體高于對(duì)照組，試驗(yàn)組仔豬養(yǎng)殖利潤(rùn)隨著添加量的上升呈先上升后下降的趨勢(shì)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在斷奶仔豬日糧中添加葡萄糖氧化酶可以提高仔豬生長(zhǎng)性能、血清抗氧化能力和免疫能力，促進(jìn)生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)。綜合養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，建議在日糧中添加100 mg/kg為葡萄糖氧化酶。