吳樟樺， 胡莉， 李錦妍， 張林， 黃月純，3， 李運(yùn)容， 魏剛

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西南寧 530201）

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimuraetMigo 的干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，為傳統(tǒng)名貴珍稀中藥材[1]。北宋蘇頌編撰具官修性質(zhì)的《本草圖經(jīng)》記載：“石斛，生六安山谷水傍石上，今荊湖、川、廣州郡及溫、臺州亦有之，以廣南者為佳?！贝撕螅髑宓闹饕静莼狙赜昧耸耙詮V南者為佳”的記載，此處的“廣南”意為宋朝時期的“廣南路”，意指今天的廣東、廣西兩省[2]。本課題組前期進(jìn)行了大量的本草考證和實(shí)地考察，本草記載應(yīng)用最廣、最久的藥用石斛應(yīng)為鐵皮石斛，且廣西、廣東為鐵皮石斛的主要道地產(chǎn)區(qū)之一，已有1 000年以上的應(yīng)用歷史[3]。

核苷類物質(zhì)是生命活動過程中的重要代謝產(chǎn)物，在抗腫瘤、保護(hù)心肌損傷、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗炎等生命調(diào)節(jié)過程中起著重要的作用[4-6]。一直以來，人們利用核苷類物質(zhì)特性，研發(fā)了多種核苷類藥物用于人類疾病等領(lǐng)域中。與此同時，天然核苷類物質(zhì)在醫(yī)藥領(lǐng)域也持續(xù)受到科學(xué)關(guān)注。近年來，它不僅被作為人類疾病診斷的生物標(biāo)志物，在中藥材品質(zhì)評價及質(zhì)量研究中也是重要的生物活性成分檢測指標(biāo)，甚至作為質(zhì)量標(biāo)記用于名貴藥材品質(zhì)評價。如2020 年版《中國藥典》中規(guī)定，冬蟲夏草腺苷的含量不得少于0.01%[7]。因此，分析廣西鐵皮石斛核苷類成分具有重要的研究意義。

中藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂、抗輻射、抗蟲害等作用[8]。多糖是鐵皮石斛的重要成分，鐵皮石斛因含有較高的多糖含量而區(qū)別于其他品種的石斛，《中國藥典》對鐵皮石斛中D-甘露糖、D-葡萄糖的含量和比值作了明確規(guī)定[7]。已有研究表明，鐵皮石斛中D-甘露糖與D-葡萄糖高效液相色譜（HPLC）含量測定方法重復(fù)性較好，用兩者含量之和替代具有較大誤差的總多糖含量作為測定指標(biāo)具有可行性[9]。但針對廣西產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛以及生長年限、種植模式對多糖含量影響尚不清楚。

本研究建立了鳥苷、尿苷、腺苷以及多糖類成分（D-甘露糖和D-葡萄糖）HPLC 含量測定方法，并選取24 批不同生長年限和種植模式的廣西鐵皮石斛進(jìn)行含量測定，分析廣西鐵皮石斛核苷類及多糖類成分的范圍，并探討生長年限與種植模式對這些成分含量的影響，為廣西鐵皮石斛的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 儀器與試劑MS-204S（d=0.1 mg）電子天平（瑞士Mettler Teledo公司）；MS-105 Du（d=0.01 mg）電子天平（瑞士Mettle Toledo 公司）；KQ-400KDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；金剛手提式多功能粉碎機(jī)（上海市廣沙工貿(mào)有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；予華SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，HP1260）；TDZ4-WS 型離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；鹵素水分測定儀（HB43-S）。乙睛（色譜純），甲醇（色譜純）均購自德國Merck 公司；水為屈臣氏蒸餾水，三氯甲烷、鹽酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 核苷類成分（尿苷、鳥苷、腺苷）含量測定研究

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取尿苷對照品2.1 mg、鳥苷對照品2.4 mg、腺苷對照品2.3 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，分別制成尿苷對照品溶液（0.084 mg/mL）、鳥苷對照品溶液（0.096 mg/mL）、腺苷對照品溶液（0.092 mg/mL）。

2.1.2 供試品溶液制備 石斛鮮品洗凈，去除其根、葉，取其莖，切碎后冷凍干燥或采用60 ℃低溫?zé)犸L(fēng)干燥，干品粉碎，過65 目篩（四號篩），所有樣品低溫干燥保存。精密稱取樣品粉末（過四號篩）各1 g，精密稱定，加入50 mL 80%甲醇，超聲處理1 h，取出，放冷至室溫，濾過，用甲醇適量洗滌濾渣，合并濾液，揮干溶劑，殘渣加60%甲醇使其溶解，置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液，用于含量測定。

2.1.3 色譜條件 Zorbax SB Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，99%～95%B；10～15 min，95%～85%B；15 ～20 min，85%～80%B；20 ～30 min，80%～80%B；30 ～35 min，80%～99%B）；流速1.2 mL/min；柱溫20 ℃；檢測波長260 nm；進(jìn)樣量4 μL。分離度良好，如圖1所示。

圖1 核苷類成分對照品及廣西鐵皮石斛樣品（S13）高效液相色譜（HPLC）圖譜Figure 1 High performance liquid chromatography（HPLC）chromatogram of Dendrobium nucleoside components control and the sample of Dendrobium officinale from Guangxi（S13）

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液（S13）4 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示：尿苷平均峰面積為99.093，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.98%；鳥苷平均峰面積為87.700，RSD為0.62%；腺苷平均峰面積為187.279，RSD 為1.66%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液（S13）4 μL，分別在0、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示：尿苷平均峰面積為100.850，RSD為0.74%；鳥苷平均峰面積為88.184，RSD 為0.73%；腺苷平均峰面積為186.824，RSD為1.15%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3．3 本研究的臨床意義 心理理論是兒童重要的社會技能之一，而愿望和信念理解又是兒童心理理論發(fā)展中的兩項(xiàng)重要能力。孤獨(dú)癥兒童的社會交往障礙與其心理理論缺失有很大關(guān)系。本研究顯示智齡在3～5歲的孤獨(dú)癥兒童能理解愿望，卻在信念推理與錯誤信念理解方面存在困難。這說明對智齡較小的孤獨(dú)癥來說愿望理解更容易。因此，在臨床康復(fù)訓(xùn)練時，應(yīng)該針對孤獨(dú)癥兒童心理理論自身發(fā)展的特點(diǎn)，從愿望理解方面著手，訓(xùn)練兒童區(qū)分自己和他人的愿望，了解愿望－情緒－行為之間的關(guān)系，并以此為基礎(chǔ)訓(xùn)練兒童對信念的理解。

2.1.4.3 重復(fù)性考察 取同一樣品（S13）6 份，依法制備，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示：尿苷平均含量為0.727 1 mg/g，RSD 為0.88%；鳥苷平均含量為0.122 2 mg/g，RSD 為0.79%；腺苷平均含量為0.257 9 mg/g，RSD 為0.33%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.4 線性范圍考察 分別從“2.1.1”項(xiàng)下各對照品溶液中取出1 mL 置于5 mL 容量瓶，加60%甲醇定容至刻度，制成尿苷（0.016 73 mg/mL）、鳥苷（0.019 20 mg/mL）、腺苷（0.018 40 mg/mL）混合對照溶液。依照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件入液相色譜儀，進(jìn)樣體積依次為0.5、1、2、5、7.5、10、12.5、15 μL，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，對照品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各對照品的回歸方程。各對照品的回歸方程如表1所示。

表1 尿苷、鳥苷、腺苷線性關(guān)系Table 1 Linear relation test results of uridine，guanosine，adenosine

2.1.4.5 加樣回收率考察 稱取已知含量的廣西鐵皮石斛樣品（S13）各6 份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.1.2 ”項(xiàng)下方法提取，進(jìn)行測定，記錄峰面積，并計算回收率和RSD。結(jié)果顯示：尿苷平均回收率102.08%，RSD 為1.92%；鳥苷的平均回收率99.79%，RSD 為2.00%；腺苷的平均回收率100.39%，RSD 為2.28%。結(jié)果如表2所示。

表2 尿苷、鳥苷、腺苷平均加樣回收率結(jié)果Table 2 Average recovery results of uridine，guanosine，adenosine

2.1.5 樣品的測定 取不同批次的廣西鐵皮石斛樣品粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄尿苷、鳥苷、腺苷的峰面積，計算含量及三者含量之和。所有樣品的含量測定結(jié)果如表3所示。

表3 24批廣西鐵皮石斛核苷類成分含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of the contents of nucleosides in 24 batches of Dendrobium officinale from Guangxi

2.2D-甘露糖、D-葡萄糖HPLC柱前衍生含量測定

2.2.1 對照品與供試品溶液的制備 同文獻(xiàn)研究[10]的制備方法。

2.2.2 色譜條件 同文獻(xiàn)研究[10]的色譜條件。結(jié)果分離度良好，如圖2所示。

圖2 混合單糖對照品與廣西鐵皮石斛樣品（S14）高效液相色譜（HPLC）圖譜Figure 2 HPLC chromatogram of mixed monosaccharide reference substance control and the sample of Dendrobium officinale from Guangxi（S14）

2.2.3 相對校正因子的計算 同文獻(xiàn)研究[10]的校正因子計算。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液（S14）10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示：D-甘露糖平均峰面積為2 897.85，RSD 為0.93%；D-葡萄糖平均峰面積為408.74，RSD 為2.33%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液（S14）10 μL，分別在0、2、4、6、8、16、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示：D-甘露糖平均峰面積為2 875.46，RSD 為1.35%；D-葡萄糖平均峰面積為408.41，RSD 為1.01%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.3 重復(fù)性考察 取同一樣品（S14）6 份，依法制備，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示：D-甘露糖平均含量為31.61%，RSD 為1.43%；D-葡萄糖平均含量為4.76%，RSD 為1.32%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.4 線性范圍考察 同文獻(xiàn)研究[10]的線性考察結(jié)果。

2.2.4.5 加樣回收率考察 稱取已知含量的廣西石斛樣品（S14）各6 份，每份約0.06 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法提取。揮干后的濾紙筒拆開剪碎連同濾渣置于燒杯中，加水100 mL，并加入相當(dāng)于樣品D-甘露糖、D-葡萄糖含量的對照品。再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL（12.016 mg/mL），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)行測定，記錄峰面積，并計算回收率和RSD。結(jié)果顯示：D-甘露糖平均回收率99.74%，RSD 為2.08%；D-葡萄糖的平均回收率100.79%，RSD為2.37%。

2.2.5 含量測定 取不同批次的廣西石斛樣品粉末，按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄D-甘露糖、D-葡萄糖和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。以內(nèi)標(biāo)法計算各樣品中D-甘露糖含量、D-葡萄糖含量，并計算兩者含量之和。結(jié)果見表4。

表4 廣西鐵皮石斛D-甘露糖、D-葡萄糖的含量及兩者含量之和Table 4 Contents and the sum of D-mannose and D-glucose in Dendrobium officinale from Guangxi

3 討論

3.1 廣西鐵皮石槲核苷類成分含量測定分析比較供試品不同溶媒（70%甲醇，80%甲醇，90%甲醇，甲醇）、不同提取時間（50、60、70 min）、料液比（1∶50、1∶75、1∶100）的提取效果，分析表明，因?yàn)楹塑疹惓煞值挠H水性，采用含醇量較高的溶媒會降低提取效率，但采用70%甲醇溶液作為溶媒時會提取出更多水溶性物質(zhì)，造成供試品雜質(zhì)過多，極易堵塞儀器與色譜柱，故最后采用80%甲醇作為提取溶媒。對于不同的提取時間和料液比，都能達(dá)到較好的分離度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以60 min、料液比1∶50 條件下，提取效率更高。

本研究測得的廣西仿野生鐵皮石斛的尿苷、鳥苷、腺苷平均含量以及這3種核苷成分總平均含量分別為0.075 6 ～0.160 0 mg/g（均值為0.109 1 mg/g）、0.070 4 ～0.195 4 mg/g（均值為0.124 1 mg/g）、0.096 4 ～0.217 3 mg/g（均值為0.147 3 mg/g）和0.242 4 ～0.564 6 mg/g（均值為0.380 4 mg/g）；廣西大棚種植鐵皮石斛的尿苷、鳥苷、腺苷平均含量以及這3 種核苷成分總平均含量分別為0.040 6 ～0.147 2 mg/g（均值為0.086 4 mg/g）、0.039 5 ～0.153 9 mg/g（均值為0.085 6 mg/g）、0.079 8 ～0.197 9 mg/g（均值為0.118 1 mg/g）和0.159 9 ～0.490 7 mg/g（均值為0.290 1 mg/g）。結(jié)果表明，廣西鐵皮石斛核苷類成分含量相對較高，仿野生鐵皮石斛3種核苷成分的平均含量比大棚種植的高，由此可見，核苷類成分在仿野生種植樣品更有優(yōu)勢。

在仿野生種植樣品中，根據(jù)生長年限一共分為1 ～2 年生和2 年及以上兩組。1 ～2 年生樣品的尿苷、鳥苷、腺苷平均含量以及這3 種核苷類成分總平均含量分別為0.110 1 ～0.160 0 mg/g（均值為0.136 8 mg/g）、0.135 3 ～0.195 4 mg/g（均值為0.166 3 mg/g）、0.129 5 ～0.217 3 mg/g（均值為0.184 9 mg/g）和0.386 4 ～0.564 6 mg/g（均值為0.488 1 mg/g）；2 年及以上生樣品的尿苷、鳥苷、腺苷平均含量以及這3種核苷類成分總平均含量分別為0.075 6 ～0.093 4 mg/g（均值為0.081 3 mg/g）、0.070 4 ～0.094 4 mg/g（均值為0.081 9 mg/g）、0.096 4 ～0.125 4 mg/g（均值為0.109 6 mg/g）和0.242 4 ～0.311 2 mg/g（均值為0.272 7 mg/g）。結(jié)果表明，隨著生長年限的增加，廣西仿野生鐵皮石斛核苷類成分含量有降低趨勢。

3.2 多糖（D-甘露糖、D-葡萄糖）含量的測定本研究參考課題組前期霍山石斛含量的測定方法，采用HPLC 柱前衍生的方法并進(jìn)行了方法學(xué)的驗(yàn)證，結(jié)果表明此方法穩(wěn)定可靠，可以用于廣西鐵皮石斛多糖含量的測定。

所有的廣西鐵皮石斛樣品D-甘露糖含量范圍17.71%～35.04%（均值為24.08%）、D-葡萄糖含量范圍2.63%～14.02%（均值為5.84%）、D-甘露糖與D-葡萄糖含量之和范圍20.34% ～44.35%（均值為29.92%）均符合藥典相關(guān)含量限度要求。其中：仿野生廣西鐵皮石斛的D-甘露糖的平均含量為17.71%～35.04%（均值為23.72%），D-葡萄糖的平均含量為2.63%～5.73%（均值為4.18%），D-甘露糖與D-葡萄糖含量之和為20.34%～40.29%（均值為27.91%）；大棚栽培廣西鐵皮石斛的D-甘露糖的平均含量為18.51% ～32.54%（均值為24.81%），D-葡萄糖的平均含量為5.87% ～14.02%（均值為9.14%），D-甘露糖與D-葡萄糖平均含量之和為25.32% ～44.35%（均值為33.95%）。從整體趨勢來看，大棚種植廣西鐵皮石斛的多糖含量比仿野生樣品高，這可能是因?yàn)樵谝巴猸h(huán)境下，植物需要消耗更多的糖分等供能物質(zhì)來維持自身代謝以及抵御惡劣環(huán)境的脅迫。

仿野生廣西鐵皮石斛1～2 年生樣品的D-甘露糖的平均含量為20.36%～35.04%（均值為27.29%），D-葡萄糖的平均含量為3.93～5.73%（均值為4.75%），D-甘露糖與D-葡萄糖含量之和為24.43%～40.29%（均值為32.05%）；2 年及以上樣品的D-甘露糖的平均含量為17.71%～24.44%（均值為20.15%），D-葡萄糖的平均含量為2.63%～5.06%（均值為3.61%），D-甘露糖與D-葡萄糖平均含量之和為20.34%～27.97%（均值為23.76%）。在不同生長年份的仿野生鐵皮石斛中，呈現(xiàn)出1～2 年生樣品的多糖含量高于2～3 年生樣品。

綜上所述，廣西鐵皮石斛具有一定含量的核苷類成分和多糖成分，有一定的優(yōu)越性，其核苷類和多糖成分的含量與種植模式和生長年限相關(guān)，可以為廣西鐵皮石斛的質(zhì)量評價提供一定的依據(jù)。