劉慧，徐薇，王永生

(南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽 421001)

鳥苷是嘌呤核苷類物質(zhì)的一種，在藥品和食品行業(yè)中是一種非常重要的中間體，并且它在制造無環(huán)鳥苷、三氮唑核苷、三磷酸鳥苷鈉等藥物當(dāng)中充當(dāng)主要原料。同時(shí)，鳥苷還在當(dāng)今一些癌癥的確診中也突顯出了其重要意義［1-2］。目前，檢測鳥苷的主要手段有高效液相色譜法［3］、分子印跡固相微萃?。?］、毛細(xì)管電泳法［5］、薄層掃描法［6］等。雖然這些方法都有其優(yōu)點(diǎn)，但普遍存在操作費(fèi)時(shí)和設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)。本研究基于鳥苷與金納米間的相互作用可改變吸光度的原理，建立了檢測鳥苷的金納米分光光度的新方法。該方法不僅操作簡單，而且還具備快速、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鳥苷、氯金酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉、Britton-Robinson(BR)緩沖溶液等試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸滅菌水。

島津UV2550紫外-可見分光光度計(jì);TG16-WS離心機(jī);AB204-S電子分析天平;PB-20酸度計(jì)。

1.2 金納米粒子制備

根據(jù)文獻(xiàn)［7-8］，金納米粒子可用檸檬酸還原法制得，再用0.22 μm的濾膜過濾。紫外-可見吸收光譜下520 nm 處消光系數(shù)為2.7 ×108(mol·cm－1)，濃度約為8.1 nmol/L，粒徑大小約(15±2)nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在2 mL EP管中，依次加入pH 3.6 BR緩沖液100 μL，金納米溶液 40 μL，放置 10 min，待反應(yīng)完全后，加入鳥苷及氯化鈉70 μL，并用雙蒸滅菌水加至500 μL，放置5 min。在UV-2550紫外可見分光光度計(jì)上200～700 nm進(jìn)行掃描，得到紫外吸收光譜。取λ630和λ530處的吸光度比值為檢測信號，用ΔA630/A530與不同濃度鳥苷建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜特征

圖1b為制得金納米粒子(AuNPs)溶液的吸收光譜，其溶液為酒紅色，最大吸收峰在530 nm附近加入鳥苷后，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，530 nm吸收強(qiáng)度減小，而在630 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰(見圖1c)。將鳥苷加入AuNPs溶液后，引起了AuNPs的聚集，從而在630 nm出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰。

圖1 鳥苷檢測體系的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of guanosine system

圖2為鳥苷-AuNPs體系紫外-可見圖譜。

圖2 AuNPs中加入不同濃度鳥苷的吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectra of AuNPs with different concentration of guanosinea.金納米 +鳥苷1.41 ×10－6mol/L;b.金納米 +鳥苷1.13 ×10－6mol/L;c.金納米 +鳥苷8.47 ×10－7mol/L;d.金納米 +鳥苷5.64 ×10－7mol/L;e.金納米 + 鳥苷2.82 ×10－7mol/L;f.金納米 +鳥苷1.76 ×10－7mol/L;g.金納米

由圖2可知，在pH 3.6 BR緩沖液中，隨著加入鳥苷的體積增加，不同濃度鳥苷體系ΔA630/A530比值也不斷增加且在一定范圍內(nèi)與吸收強(qiáng)度成線性關(guān)系。金納米粒子由帶負(fù)電荷的檸檬酸根保護(hù)，使得金納米粒子在溶液中均勻分散。加入鳥苷后，金納米粒子間的靜電斥力減弱，使得金納米粒子聚集，粒徑增大，導(dǎo)致溶液顏色發(fā)生變化，同時(shí)體系的吸收光譜也發(fā)生變化。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 體系酸度及用量的優(yōu)化 由圖3可知，在BR緩沖液中，隨著pH增大，ΔA630/A530也相應(yīng)增大，當(dāng)pH在3.0～4.0時(shí)ΔA630/A530先緩慢增加后又會(huì)降低，當(dāng)pH 達(dá)到3.6時(shí)，ΔA630/A530也達(dá)到最大，故本研究選定pH為3.6的BR緩沖溶液控制體系的酸度。另外，用量為100 μL時(shí)，ΔA630/A530最大。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們選定BR緩沖液用量為100 μL。

圖3 pH值對體系的影響Fig.3 The effect of pH value on the system

2.2.2 AuNPs用量的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，隨著AuNPs用量的增加，體系的吸光度也會(huì)隨之發(fā)生一系列變化。當(dāng)加入40 μL的金納米時(shí)，ΔA630/A530最大。因此，本研究選定金納米的加入量為40 μL。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 將鳥苷加入金納米溶液后，每間隔2 min用紫外分光光度計(jì)掃描一次。當(dāng)兩者反應(yīng)10 min時(shí)，溶液顏色不再改變，再加入一定量的 NaCl溶液，并靜置6 min，ΔA630/A530比值以及金納米粒子顏色變化趨于穩(wěn)定。因此，選擇金納米與鳥苷的反應(yīng)時(shí)間為10 min，加入氯化鈉靜置時(shí)間為6 min。

2.2.4 試劑加入順序的優(yōu)化 在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，做試劑加入順序?qū)Ψ磻?yīng)體系影響的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，以BR→AuNPs→鳥苷→NaCl的加入順序所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果最好，且穩(wěn)定時(shí)間長，故本實(shí)驗(yàn)選用BR→AuNPs→鳥苷→NaCl加入順序。

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，鳥苷濃度為2.58×10－6mol/L，實(shí)驗(yàn)了可能共存的多種離子和物質(zhì)對體系的影響。結(jié)果表明，當(dāng)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤±5%時(shí)，50 倍的 Al3+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、F－、Cl－、Br－、HC、N、HS、S、腺苷、葡萄糖、EDTA，10倍的脫氧鳥苷等對本體系沒有影響。說明這種方法有良好的選擇性，取樣后只需通過離心去除大分子物質(zhì)便能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，通過加入不同體積的鳥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制校正工作曲線。當(dāng)鳥苷濃度在1.75×10－8～6.27 ×10－6mol/L 時(shí)，與體系 ΔA630/A530有較好的線性關(guān)系，線性方程為ΔA630/A530=1.33c×10－6mol/L+0.017 5，相關(guān)系數(shù) r=0.997。根據(jù)11次空白樣品的平行測定，按公式LOD=3Sb/k(Sb和k分別為空白管的標(biāo)準(zhǔn)差和直線回歸方程的斜率)計(jì)算可得本研究的檢出限為5.26×10－9mol/L。在最佳條件下，平行配制11管濃度分別為1.372×10－7，2.744 ×10－7，1.098 ×10－6mol/L 的鳥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.75%，2.98%和 1.42%。

2.5 樣品分析

采集衡陽市南華大學(xué)第二附屬醫(yī)院尿樣3份和南華大學(xué)健康學(xué)生尿樣1份，樣品通過離心機(jī)(2 000 r/min)離心10 min，取上清液測定樣品中的鳥苷含量和加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

表1 尿樣分析結(jié)果(n=6)Table 1 The determination results of guanosine in human urine samples

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)條件下，鳥苷與AuNPs結(jié)合，屏蔽了金納米粒子間的靜電斥力，使金納米聚集，導(dǎo)致體系的顏色及吸光度值發(fā)生變化，且在一定的濃度范圍，體系吸光度比值與鳥苷的濃度具有良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立了金納米分光光度法測定尿樣中痕量鳥苷的新方法。該新方法具有簡單、快速、廉價(jià)、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)。

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