呂娟，張?jiān)葡迹卓?，蒲曉薇，戴恩?lái)（.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

腎小球足細(xì)胞作為終末分化的上皮細(xì)胞，覆蓋于腎小球毛細(xì)血管外表面，與腎小球基底膜和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞一起形成腎小球?yàn)V過(guò)屏障。足細(xì)胞功能障礙或損傷引起腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能受損，出現(xiàn)蛋白尿，是導(dǎo)致腎病綜合征的重要原因[1-3]。

自噬機(jī)制已被確定為將受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器輸送到溶酶體以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要途徑，足細(xì)胞關(guān)鍵自噬蛋白缺失導(dǎo)致蛋白尿，誘導(dǎo)自噬是防止足細(xì)胞衰老和腎小球損傷的主要保護(hù)機(jī)制[4]。足細(xì)胞高水平的自噬可減輕足細(xì)胞損傷[5-6]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin，mTOR）被認(rèn)為是自噬和細(xì)胞代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子[7]。mTOR 激活足細(xì)胞自噬，從而減少足細(xì)胞的凋亡[8]。研究[9-10]表明，PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在腎組織調(diào)節(jié)自噬中發(fā)揮著不可或缺的作用。同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）可通過(guò)激活脂質(zhì)磷酸酶使磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)榱字＜〈级姿岫Щ?，?fù)性調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，增強(qiáng)自噬[11-12]。

課題組前期體內(nèi)研究[13]已證實(shí)，淫羊藿苷聯(lián)合激素可以有效保護(hù)阿霉素腎病綜合征足細(xì)胞的損傷，延緩病理進(jìn)程。本研究旨在從細(xì)胞層面，基于PTEN/PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，探討淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型大鼠足細(xì)胞自噬水平的影響，以揭示其對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠腎足細(xì)胞株（Rat podocyte），編號(hào)：338697，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 藥物及試劑 鹽酸阿霉素（批號(hào)：427D022）、淫羊藿苷（批號(hào)：1128F021）、地塞米松（批號(hào)：320E056），均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；氯喹，批號(hào)：C843545，購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；synaptopodin 抗體（批號(hào)：224491）、LC3-Ⅱ抗體（批號(hào)：192890）、PETN 抗體（批號(hào)：32199）、mTOR 抗體（批號(hào)：32028）、PI3K 抗體（批號(hào)：151549）、p62抗體（批號(hào)：ab109012）、GAPDH 抗體（批號(hào)：37168）、山羊抗兔IgG（批號(hào)：150182），均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Akt 抗體，批號(hào)：128414，美國(guó)GeneTex公司；HBAD-mRFP-GFP-LC3 腺病毒，貨號(hào)：HB-AP210 0001，上海漢恒生物科技有限公司；胎牛血清，批號(hào)：504110916，上海元升生物科技有限公司；RIPA 裂解液，批號(hào)：20180913，北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器 SW-CJ-1FD 型超凈工作臺(tái)，美國(guó)AIRTHCH 公司；FV1000 型共聚焦顯微鏡，日本Olympus 公司；ICX41 型倒置熒光顯微鏡，浙江舜宇光學(xué)股份有限公司；HT7700 型透射電鏡，韓國(guó)COXEM 公司；DYCZ-40G 型轉(zhuǎn)膜儀、DYCZ-25D 型電泳儀，均購(gòu)自北京六一生物科技公司；5424R 型低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.4 模型的建立、分組及給藥 將大鼠足細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，觀察足細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取分化成熟、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用2 μmol·L-1阿霉素干預(yù)足細(xì)胞24 h 建立阿霉素足細(xì)胞損傷模型。地塞米松、淫羊藿苷、氯喹給藥劑量均為10 μmol·L-1。將實(shí)驗(yàn)分為4 組：空白組、模型組（阿霉素2 μmol·L-1）、淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組（阿霉素2 μmol·L-1+淫羊藿苷10 μmol·L-1+地塞米松10 μmol·L-1）、氯喹組（阿霉素2 μmol·L-1+淫羊藿苷10 μmol·L-1+地塞米松10 μmol·L-1+氯喹10 μmol·L-1）。氯喹組預(yù)先加入氯喹處理1 h，阿霉素與治療藥物（淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松）同時(shí)加入，作用24 h 后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.5 免疫熒光法檢測(cè)synaptopodin 的表達(dá) 收集足細(xì)胞， PBS 漂洗，4%多聚甲醛固定，加synaptopodin一抗，過(guò)夜；PBS 洗滌3 次，加二抗，孵育1 h。加DAPI 染液，37 ℃孵育，防熒光淬滅劑封片，拍照分析處理。觀察各組synaptopodin 的表達(dá)水平。

1.6 激光共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞的自噬流水平 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠足細(xì)胞接種到6 孔板，待細(xì)胞融合程度達(dá)到70%時(shí)，加入自噬雙標(biāo)腺病毒mRFPGFP-LC3；感染24 h， PBS 洗2～3 次；加4%多聚甲醛，固定30 min；PBS 漂洗3 次；DAPI 避光染色，室溫靜置15 min；PBS 漂洗3 次，封片、拍照分析。觀察足細(xì)胞內(nèi)GFP 和RFP 熒光信號(hào)，判斷足細(xì)胞內(nèi)自噬流水平的變化。

1.7 透射電鏡觀察足細(xì)胞內(nèi)自噬體及自噬溶酶體變化 收集足細(xì)胞，加5%戊二醛室溫固定3 h；加1%鋨酸固定，PBS 洗滌3 次，依次用50%、70%、90%乙醇脫水各20 min，90%乙醇+90%丙酮（1∶1）脫水20 min，90%、100%丙酮脫水各20 min，丙酮脫水20 min，重復(fù)3 次；室溫下依次采用純丙酮+包埋液（2∶1）處理4 h，純丙酮+包埋液（1∶1）過(guò)夜，純包埋液37 ℃處理3 h；依次37 ℃烘箱內(nèi)過(guò)夜，45 ℃烘箱內(nèi)12 h，60 ℃烘箱內(nèi)24 h；超薄切片機(jī)切片，每片厚度50 nm；透射電鏡觀察足細(xì)胞自噬體及自噬溶酶體并拍攝照片。

1.8 Western Blot 法檢測(cè)LC3-Ⅱ、p62 和PTEN、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的蛋白表達(dá) 收集足細(xì)胞，提取總蛋白，加入相應(yīng)劑量RIPA 裂解液，以離心半徑8 cm，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清液。根據(jù)BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，計(jì)算各組足細(xì)胞蛋白濃度。配置好濃縮膠及分離膠后，電泳轉(zhuǎn)膜。封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌后放入二抗工作液中，置于搖床1 h。漂洗后加入發(fā)光液，成像儀曝光。采用ImageJ 軟件分析灰度值，觀察自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。符合正態(tài)性要求采用單因素方差分析組間差異，方差齊時(shí)兩兩比較用LSD 法，方差不齊時(shí)則采用Grames-Howell 法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠足細(xì)胞synaptopodin 表達(dá)的影響 見(jiàn)圖 1、圖2。與空白組比，模型組大鼠足細(xì)胞synaptopodin 的表達(dá)量下降（P＜0.01）；與模型組比，淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組足細(xì)胞synaptopodin 的表達(dá)量增加（P＜0.05）；與淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組比，氯喹組足細(xì)胞synaptopodin 的表達(dá)量下降（P＜0.05）。

圖1 大鼠足細(xì)胞synaptopodin 蛋白表達(dá)的免疫熒光染色圖（×400）Figure 1 Immunofluorescence staining results of synaptophodin protein expression in rat podocytes（×400）

圖2 大鼠足細(xì)胞synaptopodin 蛋白的相對(duì)表達(dá)量（±s，n=3）Figure 2 Relative expression of synaptophodin protein in rat podocytes（±s，n=3）

2.2 對(duì)腺病毒mRFP-GFP-LC3 轉(zhuǎn)染足細(xì)胞自噬的影響 見(jiàn)圖3、圖4。自噬體與溶酶體結(jié)合后形成自噬溶酶體，自噬溶酶體由于溶酶體內(nèi)部的酸性環(huán)境，可以導(dǎo)致pH 下降，GFP 淬滅。而mRFP 是穩(wěn)定的熒光表達(dá)基團(tuán)，不受外界影響。顯微鏡下成像后紅色的斑點(diǎn)指示自噬溶酶體，紅綠熒光Merge 后出現(xiàn)的黃色斑點(diǎn)即是自噬體。空白組足細(xì)胞中可見(jiàn)紅色斑點(diǎn)和黃色斑點(diǎn)表達(dá)，自噬水平正常。與空白組比，模型組紅色斑點(diǎn)和黃色斑點(diǎn)明顯減少（P＜0.01），自噬流減弱。與模型組比，淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組紅色斑點(diǎn)和黃色斑點(diǎn)明顯增加（P＜0.01），自噬流增強(qiáng)。與淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組比，氯喹組紅色斑點(diǎn)明顯減少（P＜0.01），黃色的斑點(diǎn)增加（P＜0.05），自噬流被抑制。

圖3 大鼠足細(xì)胞中自噬流的變化（×400）Figure 3 Changes of autophagic flow in rat podocytes（×400）

圖4 共聚焦顯微鏡下大鼠足細(xì)胞中自噬體及自噬溶酶體的比較（±s，n=3）Figure 4 Comparison of autophagosomes and autophagic lysosomes in rat podocytes under confocal microscope（± s，n=3）

2.3 對(duì)足細(xì)胞中自噬體及自噬溶酶體數(shù)量的影響 見(jiàn)圖5。透射電鏡下吞噬泡形狀為新月形或杯形，雙層或多層膜，具有包繞胞漿中組織成分的趨勢(shì)；自噬小體具有雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)含胞漿組織成分，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等；自噬溶酶體為單層膜，液泡狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的胞漿細(xì)胞器成分已降解，其內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊，輪廓不清晰?？瞻捉M見(jiàn)自噬體2 個(gè)，自噬溶酶體4 個(gè)；模型組只見(jiàn)1 個(gè)自噬溶酶體；淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組見(jiàn)自噬體1 個(gè)，自噬溶酶體2 個(gè)；氯喹組見(jiàn)自噬體3 個(gè)，自噬溶酶體1 個(gè)。

圖5 透射電鏡下大鼠足細(xì)胞中自噬體及自噬溶酶體的變化（×15 000）Figure 5 Changes of autophagosome and autophagic lysosome in rat podocytes under transmission electron microscope（×15 000）

2.4 對(duì)LC3-Ⅱ、p62 和PTEN、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖6、圖7。與空白組比，模型組LC3-Ⅱ、PTEN 的表達(dá)減少，p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)增加（P＜0.01）。與模型組比，淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組LC3-Ⅱ、PTEN的表達(dá)量增加（P＜0.01），p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)減少（P＜0.01）。與淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松組比，氯喹組LC3-Ⅱ和p62 的表達(dá)量均升高（P＜0.05，P＜0.01），PTEN、p-PI3K、p-Akt、pmTOR 的表達(dá)量均未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05）。

圖6 Western Blot 法檢測(cè)各組LC3-Ⅱ、p62、PTEN、p-mTOR、p-PI3K、p-Akt 的蛋白表達(dá)Figure 6 Protein expressions of LC3-Ⅱ，p62，PTEN，p-mTOR，p-PI3K，p-Akt detected by Western Blot

圖7 各組LC3-Ⅱ、p62、PTEN、p-mTOR、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)量的比較（±s，n=3）Figure 7 Comparison of the protein expressions of LC3-Ⅱ，p62，PTEN，p-mTOR，p-PI3K and p-Akt among each group（±s，n=3）

3 討論

阿霉素是一種腎毒素，誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷表現(xiàn)為足細(xì)胞通透性增加，細(xì)胞骨架破壞，凋亡增加。阿霉素?fù)p傷導(dǎo)致的足細(xì)胞足突消失，代表了臨床腎病綜合征的特征[14-16]。地塞米松能夠增加足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲的穩(wěn)定性[17]。淫羊藿苷可降低足細(xì)胞凋亡、維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，在保護(hù)足細(xì)胞損傷中具有潛在的作用[18]。自噬激活對(duì)足細(xì)胞處理各種應(yīng)激至關(guān)重要，可以保護(hù)細(xì)胞免受多種有害應(yīng)激而引起的凋亡，維持足細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[19]。課題組前期研究[20]已證實(shí)淫羊藿苷可以提高激素的敏感性，增加治療阿霉素腎病綜合征的有效性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)淫羊藿苷聯(lián)合激素使用效果優(yōu)于單獨(dú)使用[21]，但其有效性的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究進(jìn)一步探討了其聯(lián)合使用的作用機(jī)制。

足細(xì)胞是腎小球基底膜最外層的上皮細(xì)胞，由胞體和足突組成，兩相鄰足突之間的裂隙稱(chēng)為裂孔，其上覆有一層拉鏈狀蛋白結(jié)構(gòu)——裂孔隔膜，為足細(xì)胞特有的細(xì)胞間連接，在維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的完整性方面起著關(guān)鍵作用[22]。Synaptopodin 是一種富含脯氨酸的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，存在于分化足細(xì)胞的足突中[23]。Synaptopodin 結(jié)構(gòu)突變或表達(dá)缺失導(dǎo)致足細(xì)胞裂孔隔膜疏松、穩(wěn)定性下降，蛋白尿發(fā)生[24-25]。

本研究結(jié)果表明，阿霉素可以降低足細(xì)胞synaptopodin 的表達(dá)，淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松可以有效地增加synaptopodin 的表達(dá)，發(fā)揮足細(xì)胞的保護(hù)作用；加入自噬抑制劑后，synaptopodin 的表達(dá)被明顯地抑制。

自噬相關(guān)蛋白LC3 在自噬形成過(guò)程中發(fā)生聚集。無(wú)自噬時(shí)，LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜。但是LC3 升高增多并不一定代表自噬活性增強(qiáng)，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻。因此為了鑒定真正自噬水平高低，可以進(jìn)一步鑒定與LC3 相互作用的蛋白p62。p62 能調(diào)節(jié)自噬并與LC3 相互結(jié)合[26]。p62 和LC3 最終被自噬溶酶體內(nèi)的溶酶體降解[27]。因此當(dāng)自噬溶酶體降解途徑受阻時(shí)，體內(nèi)LC3、p62 均升高。氯喹作為經(jīng)典的自噬抑制劑，通過(guò)改變?nèi)苊阁w的酸性環(huán)境阻斷自噬體與溶酶體的結(jié)合，使得大量的待降解蛋白在細(xì)胞中堆積。氯喹的親溶酶體性使其進(jìn)入細(xì)胞后特異性地作用于溶酶體，這導(dǎo)致溶酶體內(nèi)pH 升高，喪失了與自噬體結(jié)合的能力，發(fā)揮對(duì)自噬的抑制作用[28]。

本文的激光共聚焦研究結(jié)果表明，阿霉素可以明顯降低足細(xì)胞內(nèi)自噬流水平，自噬體及自噬溶酶體均降低。淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松可增加足細(xì)胞自噬流水平，自噬體及自噬溶酶體均增加。氯喹可抑制自噬體與溶酶體的結(jié)合，使足細(xì)胞內(nèi)自噬流水平降低，自噬溶酶體減少，但明顯增加自噬體的數(shù)量。本文的透射電鏡研究結(jié)果與此一致，進(jìn)一步說(shuō)明了淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松是通過(guò)調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬水平，從而發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。

PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞自噬的經(jīng)典通路，PI3K 激活后能夠產(chǎn)生磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），PIP3 使Akt 磷酸化從而使其活化，Akt 能夠進(jìn)一步激活mTOR 激酶[29-30]。mTOR 是自噬啟動(dòng)階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，mTOR 信號(hào)通路包括兩種功能蛋白復(fù)合物，即mTOR 復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR 復(fù)合物2（mTORC2），二者均參與自噬的調(diào)節(jié)。其中mTORC1 是蛋白質(zhì)翻譯和核糖體合成的重要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)磷酸化作用抑制ULK1 的活性進(jìn)而抑制自噬[31]。本研究的Western Blot 結(jié)果顯示，阿霉素?fù)p傷足細(xì)胞后，LC3-Ⅱ、PTEN 的表達(dá)減少，p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)增加，說(shuō)明阿霉素?fù)p傷大鼠足細(xì)胞后，PTEN 活性被抑制，PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路被激活，足細(xì)胞的自噬活性降低。淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松干預(yù)后，LC3-Ⅱ、PTEN 的表達(dá)量增加，p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)減少。說(shuō)明藥物聯(lián)合治療后PTEN 的活性被抑制，激活了PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，上調(diào)了足細(xì)胞異常降低的自噬水平。加入自噬抑制劑氯喹后，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ和p62 的表達(dá)量同步升高，而PTEN、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)量均未見(jiàn)明顯變化。這是因?yàn)槁揉钄嘧允审w與溶酶體的結(jié)合，導(dǎo)致LC3-Ⅱ病理性堆積，自噬系統(tǒng)受損，p62 也發(fā)生堆積。但是自噬信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)不受氯喹抑制。

淫羊藿又名仙靈脾，具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，其主要活性化合物為淫羊藿苷，具有抑制腎纖維化、保護(hù)腎臟的功能[32]，同樣也具有溫陽(yáng)的效果[33]。黃貴華等[34]認(rèn)為，自噬是對(duì)機(jī)體正虛邪實(shí)作出的一種自我調(diào)節(jié)方式。劉杰民等[35]認(rèn)為自噬是機(jī)體在正氣虧虛下的自救方式。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷協(xié)同地塞米松治療增加了阿霉素足細(xì)胞中自噬活性。進(jìn)一步闡明分子層面的細(xì)胞自噬現(xiàn)象仍然與中醫(yī)陰陽(yáng)理論相契合。

基于上述研究，提示淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，體現(xiàn)在上調(diào)足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin 的表達(dá)。通過(guò)激活PTEN，抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬水平可能是其足細(xì)胞保護(hù)作用的內(nèi)在機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)主要為體外研究，通過(guò)阿霉素足細(xì)胞株模型探討淫羊藿苷聯(lián)合地塞米松的治療效果及可能的機(jī)制。不足之處為未觀察單獨(dú)藥物對(duì)自噬的影響，且體外研究有它的局限性，阿霉素足細(xì)胞株模型并不能完全代表阿霉素腎病綜合征模型。今后有待從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)其機(jī)制。