盧淇平，趙敏，崔輝，趙鐘祥（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)潛在藥物分子是創(chuàng)新藥物研制的重要方式之一。海洋因其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，孕育著豐富的生物資源。自2008 年以來，新發(fā)現(xiàn)的海洋天然產(chǎn)物數(shù)量每年均超過1 000 個[1]，這些化合物結(jié)構(gòu)新穎，而且具有廣泛而顯著的生物活性[2]。20 世紀(jì)60 年代頭孢菌素C 被成功開發(fā)上市，作為海洋天然產(chǎn)物重要來源之一的海洋真菌次級代謝產(chǎn)物，逐漸引起了科學(xué)界的重視。青霉屬真菌（Penicilliumsp.）廣泛分布于自然界[3]，可代謝產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣且具有如抗腫瘤、抗炎、酶抑制作用等[4-6]生物活性的次級代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已成為發(fā)掘活性化合物最具潛力的菌屬之一。

本課題組[7-9]從廣東徐聞海域的石磺科（Onchidiidae）石 磺 屬（Onchidium）動 物 瘤 背 石 磺（Onchidium struma）的腸道內(nèi)獲得一株青霉屬真菌Penicillium sclerotiorumGZU-XW03-2，在前期的研究中，已經(jīng)從該真菌大米固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到30 余個35-二甲基苔色酸（DMOA）途徑衍生合成的雜萜類化合物和一些聚酮類化合物，藥理活性篩選中發(fā)現(xiàn)其中一些雜萜化合物表現(xiàn)出強(qiáng)于陽性藥吲哚美辛的NO 釋放抑制活性，為先導(dǎo)化合物的篩選提供了科學(xué)依據(jù)。

為了探究不同培養(yǎng)條件對真菌代謝產(chǎn)物多樣性的影響，我們對真菌Penicillium sclerotiorumGZUXW03-2 的液體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了研究，從其乙酸乙酯部位分離得到8 個聚酮類化合物（圖1），通過理化性質(zhì)和現(xiàn)代波譜技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)對比分別鑒定為peniazaphilone J（1）、5-chloroisorotiorin（2）、（+）-sclerotiorin（3）、deacetylsclerotiorin（4）、isochromophiloneⅢ（5）、penazaphilone E（6）、2，4-dihyroxy-6-（5，7-dimethyl-2-oxo-trans-3-trans-5-nonadienyl）-3-methylbenzaldehyde（7）、6-（（1E，3E）-35-dimethylhepta-13-dien-1-yl）-2，4-dihydroxy-3-methylbenzaldehyde（8）。其中化合物1 為新的嗜氮酮類化合物，化合物2～8 為首次從該真菌中分離得到。

圖1 聚酮類化合物1～8 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structures of compounds 1-8

1 儀器與材料

Bruker AVANCE400 超導(dǎo)核磁共振儀，瑞士布魯克公司；AB SCIEX Triple TOFTM5600+四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜，美國AB 質(zhì)譜公司；Bruker Tensor-27紅外分光光度計(jì)，德國布魯克公司；Chirascan 圓二色譜儀，英國應(yīng)用光物理公司；POLARTRONIC HH W5 旋光儀，德國SCHMIDT+HAENSCH 公司；LC-100 半制備液相色譜儀，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；IKA-RU8 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，IKA 儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-2F 單人單面超凈臺，南京貝登電子商務(wù)有限公司；HZP-250 恒溫培養(yǎng)搖床，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SQ5 10C 高壓滅菌鍋，深圳市塞亞泰克儀器設(shè)備公司。

柱層析硅膠（100～200 目、200～300 目），青島海洋化工廠；GF254 硅膠薄層板，德國默克公司；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠，日本GE 醫(yī)療集團(tuán)；RP-C18硅膠，日本春日井富士硅業(yè)有限公司；色譜甲醇，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；分析純石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇，天津致遠(yuǎn)試劑公司。

菌株采集于廣東徐聞海域的瘤背石璜Onchidium struma的胃腸道中，根據(jù)ITS 序列與BLAST 序列比對，鑒定該菌種為Penicillium sclerotiorum（GenBank：MT071304），菌種樣品保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院（菌種編號：2018-GZU-XW03-2）。

2 提取與分離

菌株液體發(fā)酵完成后，以紗布過濾發(fā)酵液，分離得到菌絲和濾液。菌絲體經(jīng)甲醇浸泡超聲提取3 次后，減壓回收溶劑至無醇味得粗提物浸膏，浸膏加水分散，用乙酸乙酯等體積萃取得到中等極性部位浸膏。菌液減壓濃縮后用等體積乙酸乙酯萃取3 次，與菌絲體乙酸乙酯部位合并得總乙酸乙酯浸膏90.0 g。乙酸乙酯浸膏經(jīng)硅膠柱層析初步分離，經(jīng)過石油醚-乙酸乙酯（100∶1→0∶1）體系進(jìn)行梯度洗脫，TLC 分析合并得到3 個粗組分（Fr.A→C）。Fr. B 中析出黃色粉末，為化合物3（30.3 g）。Fr. A 經(jīng)過ODS柱層析甲醇-水（40∶60→60∶40）梯度洗脫，得化合物1（6.4 mg）、化合物7（7.3 mg）和Fr.A-1。Fr.A-1 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫得化合物5（14.9 mg）和化合物6（24.1 mg）。Fr.C 經(jīng)過正相硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（100∶1→20∶1）體系梯度洗脫以及半制備HPLC（80% 甲醇-水）分離純化得到化合物4（14.6 mg）、化合物2（33.0 mg）和化合物8（3.9 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

1H-NMR 數(shù)據(jù)顯示低場區(qū)存在1 個活潑氫信號δH14.46，7 個芳香質(zhì)子δH7.71，6.99，6.60，6.52，6.32，6.09，5.60，2 個被氧化的亞甲基質(zhì)子δH5.20，4.91，2 個甲氧基δH3.94，3.84。13C-NMR 數(shù)據(jù)提示結(jié)構(gòu)中共29 個碳信號，結(jié)合DEPT-135 譜分析可知，包括11 個季碳信號（包括2 個羰基碳信號，1 個乙?；驶夹盘?，7 個芳香碳信號和1 個sp3雜化的季碳信號），9 個次甲基信號，2 個亞甲基，2 個甲氧基信號，1 個乙?；谆? 個甲基碳信號。以上數(shù)據(jù)與已知嗜氮酮類化合物peniazaphilone B[10]大體相似。

對化合物1 核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行全歸屬（見表1），與peniazaphilone B 比較差別較大的核磁數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，化合物1 中缺少1 個芳香次甲基，而存在1 個被氧化的亞甲基信號（δH5.20，4.91；δC64.2），推測Δ1，2被飽和，且2 號位為氧原子。在異核多鍵相關(guān)（HMBC）譜信號中，H-1 與C-3/C-4a/C-8a/C-8 相關(guān)，結(jié)合peniazaphilone B 分子式（C29H33N3O6）和化合物1 分子式（C29H34N2O7），證實(shí)是1 號位被飽和，且2 號位為氧原子取代的推測。其余部分與peniazaphilone B 相同，以上數(shù)據(jù)闡明了化合物1 的平面結(jié)構(gòu)，其1H-1H COSY 同核化學(xué)位移相關(guān)譜（1H-1H COSY）及HMBC 信號見圖2。

表1 化合物1 的1H-NMR（400 MHz，CDCl3）和13C-NMR（100 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)歸屬Table 11H-NMR（400 MHz，CDCl3）and13C-NMR（100 MHz，CDCl3）data of compound 1

圖2 化合物1 的1H-1H COSY、HMBC 信號Figure 2 Key 1H-1H COSY，HMBC correlations of compound 1

據(jù)該類化合物的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10]， CH3-17 位均為β 構(gòu)型，考慮到它們生源合成途徑相同，故將化合物1 的CH3-17 暫定為β 構(gòu)型。在NOE 增強(qiáng)譜中，C-7 和C-13 處兩個手性中心相距較遠(yuǎn)，無法進(jìn)行CH3-18 處相對構(gòu)型判斷?；衔? 的實(shí)驗(yàn)ECD 光譜（見圖3）與文獻(xiàn)報(bào)道化合物peniazaphilone B 的ECD譜線比較，二者在相同波長范圍內(nèi)具有相同的Cotton效應(yīng)，故推斷化合物1 的絕對構(gòu)型為7R，13S。最終，將化合物1 命名為peniazaphilone J。

圖3 化合物1 的實(shí)驗(yàn)ECD 光譜Figure 3 Experimental ECD spectrum of compound 1

化合物 2：酒紅色固體。HR-ESI-MSm/z：415.130 1[M+H]+（計(jì)算值C23H23O5Cl，415.130 6）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.82（1H，s，H-1），7.11（1H，d，J= 15.6 Hz，H-10），6.60（1H，s，H-4），6.08（1H，d，J= 15.6 Hz，H-9），5.72（1H，d，J= 9.8 Hz，H-12），2.58（1H，s，H-4′），2.46（H，m，H-13），1.83（3H，s，CH3-16），1.70（3H，s，CH3-18），1.42（1H，m，H-14a），1.29（1H，m，H-14b），1.00（3H，d，J= 6.6 Hz，CH3-17），0.86（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：194.3（C-6），183.2（C-3′），168.0（C-1′），163.9（C-8），158.2（C-3），152.2（C-1），149.5（C-12），143.7（C-10），139.8（C-4a），132.1（C-11），123.8（C-2′），115.7（C-9），110.3（C-5），108.6（C-8a），105.7（C-4），87.6（C-7），35.2（C-13），30.1（C-14），30.1（C-4′），26.4（C-18），20.2（C-17），12.4（C-16），12.0（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[11]基本一致，故鑒定化合物2 為5-chloroisorotiorin。

化 合 物 3： 黃 色 粉 末。 HR-ESI-MSm/z：391.099 8[M+H]+（計(jì)算值C21H23O5Cl，391.123 4）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.91（1H，s，H-1），7.04（1H，d，J= 15.7 Hz，H-10），6.62（1H，s，H-4），6.06（1H，d，J= 15.7 Hz，H-9），5.61（1H，d，J= 9.8 Hz，H-12），2.46（1H，m，H-13），2.15（1H，s，H-20），1.82（3H，s，CH3-16），1.55（3H，s，CH3-18），1.42（1H，m，H-14a），1.30（1H，m，H-14b），0.99（3H，d，J=6.6 Hz，CH3-17），0.84（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：191.8（C-6），186.0（C-8），170.1（C-19），158.2（C-3），152.7（C-1），148.9（C-12），142.9（C-10），138.8（C-4a），132.1（C-11），115.8（C-9），114.6（C-5），110.8（C-8a），106.4（C-4），84.7（C-7），35.2（C-13），30.1（C-14），22.6（C-18），20.6（C-20），20.1（C-17），12.4（C-16），12.0（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[12]基本一致，因此，確定化合物3 為（+）-sclerotiorin。

化 合 物 4： 橙 色 粉 末。 HR-ESI-MSm/z：349.449 9[M+H]+（計(jì)算值C19H21O4Cl，349.120 1）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.93（1H，s，H-1），7.09（1H，d，J= 15.7 Hz，H-10），6.62（1H，s，H-4），6.08（1H，d，J= 15.7 Hz，H-9），5.73（1H，d，J= 9.8 Hz，H-12），2.48（H，m，H-13），1.85（3H，s，CH3-16），1.58（3H，s，CH3-18），1.43（1H，m，H-14a），1.33（1H，m，H-14b），1.01（3H，d，J= 6.6 Hz，CH3-17），0.86（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：194.1（C-8），189.8（C-6），158.7（C-3），151.8（C-1），149.5（C-12），143.5（C-4a），140.1（C-10），132.1（C-11），115.7（C-9），115.3（C-8a），109.1（C-5），106.1（C-4），84.0（C-7），35.3（C-13），30.2（C-14），28.9（C-18），20.3（C-17），12.5（C-16），12.1（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[13]基本一致，故鑒定化合物4 為deacetylsclerotiorin。

化 合 物 5： 橙 色 粉 末。 HR-ESI-MSm/z：353.151 1[M+H]+（計(jì)算值C19H25O4Cl，353.151 4）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.01（1H，d，J= 15.5 Hz，H-10），6.09（1H，s，H-4），5.99（1H，d，J= 15.5 Hz，H-9），5.63（1H，d，J= 9.8 Hz，H-12），4.85（1H，dd，J= 10.9，5.2 Hz，H-1a），3.81（1H，dd，J= 13.6，10.9 Hz，H-1b），3.46（1H，d，J= 9.6 Hz，H-8），3.12（1H，m，H-8a），2.44（1H，m，H-13），1.81（3H，s，CH3-16），1.55（3H，s，CH3-18），1.42（1H，m，H-14a），1.30（1H，m，H-14b），0.99（3H，d，J = 6.6 Hz，CH3-17），0.84（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：189.2（C-6），164.2（C-3），147.4（C-12），146.7（C-4a），142.2（C-10），132.4（C-11），119.2（C-9），108.3（C-5），101.8（C-4），75.1（C-7），73.5（C-8），68.9（C-1），37.8（C-8a），35.1（C-13），30.3（C-14），21.3（C-18），20.4（C-17），12.5（C-16），12.1（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]基本一致，故鑒定化合物5 為isochromophiloneⅢ。

化合物 6：酒紅色粉末。HR-ESI-MSm/z：390.146 7[M+H]+（計(jì)算值C21H24NO4Cl，390.146 6）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.08（1H，s，H-1），7.20（1H，d，J= 16.1 Hz，H-10），6.99（1H，s，H-4），6.25（1H，d，J= 16.1 Hz，H-9），5.74（1H，d，J= 9.7 Hz，H-12），2.46（1H，m，H-13），2.14（1H，s，H-20），1.85（3H，s，CH3-16），1.59（3H，s，CH3-18），1.41（1H，m，H-14a），1.29（1H，m，H-14b），1.00（3H，d，J = 6.6 Hz，CH3-17），0.85（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-15）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：193.4（C-6），183.8（C-6），170.5（C-19），148.9（C-12），148.3（C-4a），147.2（C-3），143.5（C-10），139.0（C-1），132.2（C-11），116.7（C-9），114.8（C-8a），110.9（C-4），101.0（C-5），85.1（C-7），35.2（C-13），30.2（C-14），23.8（C-18），20.6（C-20），20.3（C-17），12.5（C-16），12.1（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]基本一致，故鑒定化合物6 為penazaphilone E。

化合物 7：黑褐色固體。HR-ESI-MSm/z：315.160 4 [M+H]+（計(jì)算值C19H24O4，315.159 0）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：12.58（1H，s，H-2），9.81（1H，s，1-CHO），7.35（1H，d，J= 15.6 Hz，H-4′），6.19（1H，d，J= 15.6 Hz，H-3′），6.12（1H，s，H-5），5.82（1H，d，J= 9.8 Hz，H-6′），4.06（2H，s，H-1′），2.47（1H，m，H-7′），2.00（3H，s，CH3-3），1.79（3H，s，CH3-10′），1.37（2H，m，H-8′），0.99（3H，d，J= 6.6 Hz，CH3-11′），0.84（3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-9′）；13C-NMR（100 MHz， CDCl3）δ： 198.3（C-2′）， 192.5（1-CHO），164.5（C-2），162.3（C-4），152.4（C-4′），151.0（C-6′），137.2（C-6），132.0（C-5′），122.4（C-3′），111.5（C-5），112.7（C-3），111.1（C-1），43.8（C-1′），35.4（C-7′），30.0（C-8′），20.1（C-10′），12.5（C-11′），12.0（C-9′），7.1（CH3-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]基本一致，故鑒定化合物7 為2，4-dihyroxy-6-（5，7-dimethyl-2-oxo-trans-3-trans-5-nonadienyl）-3-methylbenzaldehyde。

化合物 8：淺黃色粉末。HR-ESI-MSm/z：275.163 9 [M+H]+（計(jì)算值C17H22O3，275.164 1）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：12.66（1H，s，H-2），10.15（1H，s，1-CHO），6.81（1H，d，J=15.7 Hz，H-1′），6.62（1H，d，J = 15.7 Hz，H-2′），6.46（1H，s，H-5），5.56（1H，s，H-4），5.46（1H，d，J= 9.6 Hz，H-4′），2.46（1H，m，H-5′），2.11（3H，s，CH3-3），1.87（3H，s，CH3-8′），1.41（1H，m，H-6′a），1.33（1H，m，H-6′b），1.00（3H，d，J= 6.7 Hz，CH3-9′），0.87（3H，t，J=7.4 Hz，CH3-7′）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：193.2（1-CHO），163.6（C-2），163.6（C-6），160.8（C-4），143.3（C-4′），140.6（C-2′），132.2（C-3′），119.3（C-1′），112.1（C-1），109.7（C-3），105.9（C-5），34.7（C-5′），30.3（C-6′），20.5（C-9′），12.7（C-8′），12.0（C-7′），7.1（CH3-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[17]基本一致，故鑒定化合物8 為6-（（1E，3E）-3，5-dimethylhepta-1，3-dien-1-yl）-2，4-dihydroxy-3-methylbenzaldehyde。

4 討論

本研究對采自中國南海湛江徐聞海域的瘤背石璜胃腸道中提取得到的一株真菌Penicillium sclerotiorumGZU-XW03-2 進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵物甲醇提取物的乙酸乙酯部位進(jìn)行分離純化，從中分離并鑒定了8 個聚酮類化合物，其中新化合物1為罕見的具有氮-氮鍵的聚酮類化合物。本研究發(fā)現(xiàn)，該真菌液體發(fā)酵后代謝產(chǎn)物類型主要為聚酮類化合物，與大米固體發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的眾多雜萜類化合物相比，產(chǎn)物類型存在較大差異。以上研究成果豐富了青霉屬真菌的化學(xué)成分，為該屬真菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考。