楊紅梅,陳敏潔,鄒 昕,虞 茜,馬思飛,張建偉

江蘇省常州市中心血站/常州市臨床輸血重點(diǎn)?？茖?shí)驗(yàn)室,江蘇常州 213004

ABO血型系統(tǒng)是輸血醫(yī)學(xué)中最重要的一個(gè)血型系統(tǒng),在臨床輸血、器官移植和產(chǎn)前診斷中具有重要意義[1-2]。正確的血型鑒定是臨床輸血安全的重要保障。在ABO血型血清學(xué)鑒定時(shí)常常因正反不一致、抗原表達(dá)減弱、抗體減弱或消失及混合視野等現(xiàn)象導(dǎo)致定型困難,出現(xiàn)疑似亞型。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于ABO亞型的研究報(bào)道多見于個(gè)案[3-6],本研究對(duì)38例血清學(xué)檢測(cè)抗原異常表達(dá)的血型標(biāo)本進(jìn)行ABO基因第1～7外顯子編碼區(qū)測(cè)序,探討ABO血型抗原表達(dá)減弱的分子機(jī)制及常州地區(qū)基因多態(tài)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月至2021年12月來(lái)自常州市各醫(yī)療機(jī)構(gòu)及本站檢測(cè)中心血清學(xué)鑒定正反不一致送輸血研究室進(jìn)行疑難血型鑒定標(biāo)本38例,其中獻(xiàn)血者11例(微孔板法),患者27例(凝膠卡法)。血樣于靜脈采集5 mL,4 ℃保存于EDTA抗凝管中。本研究已通過(guò)常州市中心血站醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查(20230102)。

1.2儀器與試劑 AB公司9700型PCR擴(kuò)增儀、DNA濃度測(cè)定儀、凝膠成像系統(tǒng)、貝克曼高速離心機(jī)、久保田KA-2200血清學(xué)專用離心機(jī)、37 ℃恒溫水浴箱?？?A/B單克隆抗體(上海血液生物)、抗-D(IgM)單克隆抗體(上海血液生物)、抗-H抗體(德國(guó)CE)、抗-AB抗體(德國(guó)CE)、抗-A1抗體(上海血液生物)、ABO血型反定型紅細(xì)胞(北京金豪)、抗體篩選細(xì)胞(匈牙利REAGENS)、ABO-特異性序列引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)基因分型試劑盒(天津秀鵬生物)、DNA提取試劑(Invitrogen)、瓊脂糖(北京沃比森)、溴化乙錠(10 mg/mL,捷世康)。

1.3方法

1.3.1血清學(xué)檢測(cè) 采用鹽水試管法對(duì)38例標(biāo)本進(jìn)行ABO血型血清學(xué)鑒定。取被檢者和對(duì)照A、B、O型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞少許,生理鹽水洗滌3次,均配制成2%～4%紅細(xì)胞生理鹽水懸液進(jìn)行抗-H、抗-A1和抗-AB試驗(yàn),離心判讀凝集強(qiáng)度;同時(shí)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行抗體篩查。所有試驗(yàn)均嚴(yán)格按照AABB技術(shù)手冊(cè)第18版[7]和文獻(xiàn)[8]方法及試劑操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2PCR-SSP基因組DNA提取及ABO基因擴(kuò)增、電泳跑膠后的膠圖比對(duì)分析 使用Invitrogen DNA提取試劑盒提取患者外周血基因組DNA,調(diào)整DNA模板水平為30～35 ng/μL,A260/A280比值為1.60～1.80,根據(jù)人類ABO血型基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書設(shè)置參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳跑膠、生成凝膠成像圖譜,與天津秀鵬生物試劑盒提供的圖譜進(jìn)行比對(duì)。

1.3.3ABO基因測(cè)序分析和序列比對(duì) ABO基因第6～7外顯子擴(kuò)增片段大小約為2 019 bp,擴(kuò)增反應(yīng)體系參照天津秀鵬生物試劑盒說(shuō)明書,上游引物為5′-CCTGCCAGCTCCATGTGAC-3′,下游引物為5′-CAGGACGGACAAAGGA-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序第1～7外顯子編碼區(qū),該實(shí)驗(yàn)部分委托天津秀鵬生物完成。第6外顯子測(cè)序上游和下游引物為5′-CATGTGGGTGGCACCCTGCC-3′,5′-ATGTCCACAGTCACTCGCCA-3′;第7外顯子上游和下游引物:5′-GCTCCCCCAGCCCCCGTCCG-3′,5′-GTTTACCCGTTCTGCTAA-3′。測(cè)序后與NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)nucleotide blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對(duì),確定其基因型。

2 結(jié) 果

2.1血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果 對(duì)38例標(biāo)本采用鹽水試管法進(jìn)行ABO血型鑒定,血清學(xué)結(jié)果顯示ABO血型抗原表達(dá)異常,正反定型結(jié)果不符,抗體篩選試驗(yàn)均為陰性。其中A抗原表達(dá)異常14例,B抗原表達(dá)異常24例,其中與抗-A或抗-B試劑反應(yīng)呈混合視野18例,標(biāo)本紅細(xì)胞與抗-H試劑均有不同程度反應(yīng),38例標(biāo)本經(jīng)血清學(xué)鑒定均為ABO亞型,涉及血清學(xué)表型包括Bend、cisAB/A、ABx、B(A)、cisAB/O、ABend、AxB、Bx、Bmh、Aend、B3、AB3、A3、Am共14種。對(duì)照A、B、O型紅細(xì)胞與抗-H、抗-A1和抗-AB反應(yīng)結(jié)果均符合傳統(tǒng)規(guī)律。由于38例標(biāo)本ABO抗原檢測(cè)基本上均有明顯凝集,因此沒(méi)有再進(jìn)行紅細(xì)胞吸收放散試驗(yàn)。

2.2分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果 ABO血型基因第1～7外顯子編碼區(qū)測(cè)序結(jié)果根據(jù)ISBT(International Society of Blood Transfusion)網(wǎng)站提供的Names for ABO(ISBT001)blood group alleles v1.1171023綜合結(jié)果判定(以ABO*A1.01為參考序列)。38例標(biāo)本結(jié)果分布為7例A亞型、11例B亞型及20例AB亞型。38例標(biāo)本中共檢出ABO等位基因18個(gè),其中常見的等位基因15個(gè),罕見的等位基因1個(gè)(Bw30/O01)及新等位基因2個(gè)。常州地區(qū)ABO基因多態(tài)性主要以A102/B101、A307/O02及Bw03為主,其中A102/B101占18.4%(7/38)、A307/O02占15.8%(6/38)、Bw03占7.9%(3/38)。例1、8、12、13、17因突變未被ISBT網(wǎng)站收錄。見表1和圖1。

注:a為A102(873C>T);b為A102/Bw.03(1036A>C);c為B310/O01(28G>A)。

3 討 論

ABO基因位于第9號(hào)染色體,由7個(gè)外顯子組成,共編碼354個(gè)氨基酸。ABO等位基因編碼區(qū)發(fā)生突變時(shí)可引起ABO基因編碼物質(zhì)的改變,從而導(dǎo)致ABO亞型產(chǎn)生。目前研究ABO亞型主要有血清學(xué)水平(血液免疫學(xué)實(shí)驗(yàn))、基因水平(DNA、mRNA)、蛋白水平(氨基酸、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白)3種模式[9-10]。因ABO基因77%的編碼系列位于第6和第7外顯子,本研究對(duì)38例血清學(xué)檢測(cè)ABO血型抗原表達(dá)異常標(biāo)本第1～7外顯子編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析,進(jìn)一步闡述ABO血型亞型的分子生物學(xué)機(jī)制。

根據(jù)ISBT等位基因命名表,目前已確認(rèn)300多種ABO等位基因。本研究結(jié)果表明,常州地區(qū)B亞型多于A亞型,與章旭等[11]的調(diào)查結(jié)果基本一致。本研究PCR-SSP法采用天津秀鵬生物試劑盒,該試劑盒根據(jù)中國(guó)人群常見ABO亞型設(shè)計(jì),適用于我國(guó)采供血機(jī)構(gòu)ABO血型基因分型的常規(guī)篩查。在38例標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)3例為突變型組合未收錄和2例新突變位點(diǎn),這5例標(biāo)本由西安浩瑞基因技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)單倍體分型。結(jié)果表明,例1為突變型組合未收錄,其堿基突變有28G>A、261delG、297A>G、526C>G、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、903G>A,在單倍體2中出現(xiàn)了錯(cuò)義突變28G>A,該突變位于第1號(hào)外顯子最后一個(gè)堿基處,它不僅改變了氨基酸種類,還有可能造成外顯子剪接錯(cuò)誤。該突變雖未被ISBT收錄,但上海市血液中心蔡曉紅團(tuán)隊(duì)已將序列提交到國(guó)際血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(kù),并在文章中首次報(bào)道28G>A錯(cuò)義突變[12];但當(dāng)時(shí)未對(duì)28G>A導(dǎo)致B3表型的機(jī)制展開研究。2017年蔡曉紅團(tuán)隊(duì)繼續(xù)對(duì)該突變進(jìn)行功能性研究,探討是剪接性能影響還是氨基酸改變,因此對(duì)含有該突變的單倍體cDNA采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行表達(dá)量評(píng)估,證實(shí)了28G>A突變會(huì)對(duì)剪接功能造成影響[13]。例8為突變型組合未收錄,其堿基突變有297A>G、467C>T、526C>G、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、838C>T、903G>A,在其中一條單倍體中發(fā)現(xiàn)了838C>T錯(cuò)義突變引起p.Leu>Phe的改變;結(jié)合其他突變位點(diǎn)推測(cè)其為較罕見的Ax24,同時(shí)可上報(bào)ISBT申請(qǐng)新分型單倍體。例13為突變型組合未收錄,其堿基突變有297A>G、526C>G、657C>T、703G>A、761C>T、796C>A、803G>C、930G>A、261delG,在正常B1的格局中發(fā)生761C>T錯(cuò)義突變;該突變型組合未被ISBT收錄,結(jié)合其他突變位點(diǎn)推測(cè)其為較罕見的BW30。

此外本研究還發(fā)現(xiàn)2例新突變位點(diǎn),均并未被ISBT收錄(正提交NCBI命名中)。例12在A102/O01的基礎(chǔ)上第7外顯子發(fā)生了 1036A>C 的雜合突變。根據(jù)血清學(xué)結(jié)果推斷,該突變應(yīng)位于A基因上的B單倍體發(fā)生了1036A>C錯(cuò)義突變;血清學(xué)表型為Bw03。例17在A102純合的基礎(chǔ)上其第7外顯子第873號(hào)堿基發(fā)生了C>T的雜合突變并對(duì)其進(jìn)行單倍體檢測(cè),在單倍體2中發(fā)現(xiàn)了未被報(bào)道過(guò)的873C>T同義突變,該突變未造成氨基酸改變;從密碼子使用頻率來(lái)看,天門冬氨酸Asp的GAT使用頻率相對(duì)較低,因此推測(cè)該突變可能會(huì)對(duì)蛋白合成速度的造成影響;預(yù)測(cè)表型為A102,該突變點(diǎn)并未被NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄,可上報(bào)ISBT申請(qǐng)新基因。

綜上所述,本研究通過(guò)本地區(qū)獻(xiàn)血人群38例血清學(xué)檢測(cè)ABO血型抗原表達(dá)異常標(biāo)本的基因多態(tài)性,初步了解其分布特征。當(dāng)出現(xiàn)ABO抗原弱表達(dá)或ABO正反定型不符現(xiàn)象時(shí),建議將血型基因分型技術(shù)與血型血清學(xué)技術(shù)結(jié)合運(yùn)用,以防止血型分型判斷錯(cuò)誤。我國(guó)為多民族國(guó)家,不同地域、不同民族人群的血型基因多態(tài)性存在差異,有條件的地區(qū)應(yīng)建立本區(qū)域血型基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù),為精準(zhǔn)輸血治療及輸血醫(yī)學(xué)發(fā)展提供樣本來(lái)源及理論基礎(chǔ)。