張相猛,周志豪,潘俊鋒,徐秋芳

上海市青浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗科,上海 201700

流行性感冒(流感)病毒以呼吸道為入侵門戶,在呼吸道黏膜上皮細胞中增殖,引起呼吸道局部感染或?qū)е潞粑酪酝饨M織器官病變。作為最常見的呼吸道病毒,流感病毒的肆虐每年造成巨大的經(jīng)濟損失。目前,至少還有200多種病毒可以引起呼吸道感染,如呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等[1-2]。新型冠狀病毒感染疫情是由新型冠狀病毒引起的全球應(yīng)急事件。流感病毒實驗室常規(guī)檢測方法為實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),其具有靈敏度高,特異性強的優(yōu)勢[3]。但是在實驗室檢測過程中多種因素可導(dǎo)致假陰性結(jié)果,尤其是在對弱陽性標(biāo)本進行檢測時更為明顯。

其中核酸抽提是病毒核酸檢測的重要環(huán)節(jié),核酸抽提結(jié)果直接影響核酸檢測的靈敏度和特異度[4]。傳統(tǒng)的核酸抽提方法為沉淀離心手工抽提法,手工抽提對實驗人員操作要求較高,且耗時較長。隨著磁珠分離技術(shù)在生物科學(xué)領(lǐng)域不斷普及和廣泛應(yīng)用,該技術(shù)逐步用于核酸自動抽提,不僅大大提高了核酸抽提的效率,還減少了人工操作的誤差[5-6]。其原理為特殊包被的磁珠對樣品中的核酸具有很強的吸附力,從而達到抽提、純化標(biāo)本中核酸的效果[7-8]。為了進一步提高檢測效率,一些生物公司研制的全自動核酸抽提儀推出了快速抽提和普通抽提兩種模式。二者的主要差異在于組分和結(jié)合時間不同[9],快速抽提法所需時間較普通抽提法短,但是抽提時間及程序的不同會影響到核酸檢測的質(zhì)量,出現(xiàn)漏檢情況,從而影響對疫情的早期研判、導(dǎo)致疫情擴散。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取本中心核酸檢測陽性流感患者臨床標(biāo)本分離到的乙型流感病毒Victoria型毒株作為研究對象。

1.2儀器與試劑 全自動核酸抽提儀(江蘇碩世科技股份有限公司)、Light Cycle 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。乙型流感病毒Victoria型核酸檢測試劑盒(熒光PCR法,上海之江生物科技股份有限公司,批號:20220403),核酸快速抽提試劑盒(磁珠法,碩世生物科技股份有限公司,批號:202205174),核酸普通抽提試劑盒(磁珠法,碩世生物科技股份有限公司,批號:20220276)。

1.3方法

1.3.1菌株處理 將流感病毒毒株高速離心去除雜質(zhì)后留取上清液,將上清液按照1∶10、1∶100倍比稀釋至1∶109。

1.3.2核酸抽提 采用同一臺核酸抽提儀按以下步驟對標(biāo)本進行核酸抽提?？焖俪樘岱▍?shù)設(shè)定為90 ℃裂解0 s,磁珠重懸10 s,結(jié)合400 s,洗滌30 s,90 ℃洗脫120 s,棄磁珠。普通抽提法參數(shù)設(shè)定為90 ℃裂解5 min,磁珠重懸1 min,結(jié)合10 min,洗滌8 min,90 ℃洗脫3 min,棄磁珠。

1.3.3核酸檢測 采用全自動核酸檢測儀對抽提后的核酸進行核酸檢測,按照乙型流感病毒Victoria型核酸檢測試劑盒要求配制好核酸檢測體系。加樣后置于Light Cycle 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀,參數(shù)設(shè)定為45 ℃、10 min,95 ℃、15 min,95 ℃、15 s,60 ℃、60 s,循環(huán)次數(shù)設(shè)定為40次。在60 ℃時進行熒光檢測,檢測通道為FAM通道。

1.3.4結(jié)果判定 靶標(biāo)檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):擴增曲線不呈S型,Ct值>39或Ct值空白為陰性;擴增曲線呈S型,且Ct值≤39為陽性。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1檢出率 采用兩種抽提方法將各稀釋倍數(shù)標(biāo)本平行檢測4次,實時熒光定量PCR檢測后Ct值≤39為檢出病毒基因,比較各稀釋倍數(shù)下不同抽提方法平行檢測的檢出率。

1.4.3線性 以稀釋倍數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo),各稀釋倍數(shù)平行檢測4次Ct值均值為縱坐標(biāo),比較兩種方法稀釋倍數(shù)與Ct值的線性關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1兩種抽提方法檢測結(jié)果 采用兩種方法對各稀釋倍數(shù)標(biāo)本進行平行核酸抽提后,經(jīng)實時熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示快速抽提法在原液至106稀釋倍數(shù)均能檢出,稀釋至107倍后4次平行檢測檢出率為50%,稀釋至108倍后不再檢出。普通抽提法在原液至107稀釋倍數(shù)均能檢出,稀釋至108倍后4次平行檢測檢出率為75%,稀釋至109倍后不再檢出。兩種方法在不同稀釋倍數(shù)的檢出率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩種抽提方法不同稀釋倍數(shù)檢測的Ct值

2.2兩種抽提方法重復(fù)性比較 對標(biāo)本平行檢測4次,核酸抽提后各稀釋倍數(shù)實時熒光定量PCR檢測結(jié)果CV值見表2。結(jié)果顯示,不同稀釋倍數(shù)下普通抽提法CV值均低于快速抽提法。兩種方法在原液至107稀釋倍數(shù)的CV值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 兩種抽提方法不同稀釋倍數(shù)的重復(fù)性

2.3兩種抽提方法線性比較 采用兩種方法對各稀釋倍數(shù)標(biāo)本進行核酸抽提后,實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,不同稀釋倍數(shù)下普通提取法Ct值均小于快速提取法,原液至105稀釋倍數(shù)下兩種方法Ct值結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),106～107稀釋倍數(shù)下兩種方法Ct值結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各稀釋倍數(shù)線性關(guān)系良好,快速抽提法回歸方程為Y=2.86X+14.42,R2=0.971。普通抽提法回歸方程為Y=2.805X+13.61,R2=0.983。見圖1。

圖1 不同抽提方法的線性關(guān)系

3 討 論

自新型冠狀病毒感染疫情暴發(fā)以來,在疫情早期處置中,尤其是高致病性呼吸道傳染病疫情處置中要求實驗結(jié)果的出具快速、準(zhǔn)確。因此一些生物公司推出的快速抽提法核酸抽提試劑盒在普通抽提法的基礎(chǔ)上簡化了流程?？焖俪樘岱ㄝ^普通抽提法能較大限度減少樣品核酸抽提時間,在疫情處置中發(fā)揮重大作用。但是實時熒光定量PCR檢測病毒核酸的靈敏度受多種因素的影響,如核酸模板的質(zhì)量、引物與探針的特異性[10],這些影響因素中核酸模板的質(zhì)量極其重要,核酸提取的質(zhì)量不佳可能會導(dǎo)致病毒載量低的標(biāo)本出現(xiàn)假陰性結(jié)果。核酸抽提條件的改變能影響標(biāo)本核酸抽提效率[11-13],從而影響實時熒光定量PCR的檢測結(jié)果。

病毒的核酸抽提方法目前主要為磁珠法,其操作步驟大致分為裂解、結(jié)合和洗脫。與普通抽提法比較,快速抽提法縮短了這3個步驟時間。裂解過程能裂解病毒表面蛋白質(zhì),有助于標(biāo)本充分釋放核酸[14]。結(jié)合過程能讓磁珠充分吸附核酸。洗滌液主要用來去除抽提過程中產(chǎn)生的蛋白類抑制物,該物質(zhì)被帶入核酸檢測的產(chǎn)品中容易導(dǎo)致低濃度的標(biāo)本檢測不出[15]。本研究結(jié)果顯示,去掉或者縮短某些步驟對核酸抽提效率有一定影響。

本研究選取流感病毒進行實驗,結(jié)果顯示在檢出率方面,低稀釋倍數(shù)(稀釋倍數(shù)≤106)標(biāo)本中兩種方法均能檢出病毒核酸,高稀釋倍數(shù)(稀釋倍數(shù)≥107)標(biāo)本或當(dāng)Ct值接近臨界值時,快速抽提法檢出率較普通抽提法有所下降,且隨著稀釋倍數(shù)的增加,兩者之間Ct值差異越大。這提示快速抽提法在病毒含量低的標(biāo)本中檢出率低于普通抽提法,因此可能會導(dǎo)致陽性標(biāo)本漏檢。CV值是考查檢測方法重復(fù)性的指標(biāo)[16],本研究中普通抽提法CV值在各個稀釋倍數(shù)均明顯低于快速抽提法,顯示在穩(wěn)定性方面普通抽提法明顯優(yōu)于快速抽提法。不同稀釋倍數(shù)普通抽提法Ct值均小于快速抽提法,且不同稀釋倍數(shù)下線性優(yōu)于快速抽提法,提示普通抽提法抽提效率高于快速抽提法。

病毒性傳染病的篩查工作以“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療”為重點?？焖俪樘岱ň哂袡z測時間短、成本低的優(yōu)點,能有效節(jié)省時間和成本,滿足疫情早期大批量標(biāo)本檢測的要求。但是在抽提多類型復(fù)雜標(biāo)本或病毒含量較低的標(biāo)本時,快速抽提法可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陰性,建議采用抽提純化和抽提效率更有保證的普通抽提法,確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,以避免漏檢,從而導(dǎo)致疫情擴散。

本研究仍存在一定的局限性,由于倍比稀釋對標(biāo)本濃度要求較高,本研究采用的研究對象是經(jīng)臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)得到的流感病毒毒株,而日常檢測中血液、鼻咽拭子等標(biāo)本形式多樣且存在各種雜質(zhì),標(biāo)本具有一定的復(fù)雜性,均一性也更差[17]。采用臨床標(biāo)本開展實驗更貼近實際,也更能對比兩種抽提方法對復(fù)雜類型標(biāo)本的抽提效果。