翟 斌,韓 梅,蒙莉萍,張鈺坤,姚炎燚

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市第八醫(yī)院檢驗(yàn)科,內(nèi)蒙古包頭 014040;2.內(nèi)蒙古迪安豐信醫(yī)療科技有限責(zé)任公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010000;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市第八醫(yī)院院長辦公室,內(nèi)蒙古包頭 014040

冠心病(CHD)是心血管疾病中最常見的一種類型,發(fā)病率和病死率逐年上升且已經(jīng)超過大多數(shù)腫瘤性疾病。有研究表明,高脂血癥、糖尿病、高血壓和吸煙是CHD高發(fā)的危險因素,且隨著年齡的增加,CHD發(fā)病率也顯著提高[1]。當(dāng)冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化,會引起管腔狹窄或閉塞,造成心肌缺血、缺氧性損傷或壞死。CHD的發(fā)生是由不同因素所致,病因尚不完全清楚,目前較多研究表明,脂質(zhì)代謝異常和激活的炎癥反應(yīng)在CHD中起關(guān)鍵作用[2-3]。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn),炎癥因子參與和調(diào)控著CHD的發(fā)生、發(fā)展過程,臨床檢測指標(biāo),如同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白細(xì)胞介素等已經(jīng)成為診斷CHD的關(guān)鍵指標(biāo)被廣泛研究[4-5]。本研究旨在通過生物信息學(xué)分析技術(shù)從GEO數(shù)據(jù)庫下載CHD基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù),對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,揭示CHD發(fā)生中涉及的相關(guān)生物過程和參與的信號通路,了解生物標(biāo)志物潛在的分子機(jī)制,結(jié)合臨床檢測指標(biāo)綜合分析并對相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證,為CHD的診斷與預(yù)防提供新的思路。

1 材料與方法

1.1基因微陣列數(shù)據(jù)的獲取 以“Coronary Heart Disease”為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)進(jìn)行檢索獲得樣本的基因表達(dá)芯片,下載GSE71226和GSE66360兩個數(shù)據(jù)集。其中GSE71226包括3例CHD患者樣本和3例健康對照樣本;GSE66360包括21例CHD患者樣本和22例健康對照樣本的基因表達(dá)矩陣,實(shí)驗(yàn)平臺均來自Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2方法

1.2.1原始數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異表達(dá)基因的挖掘 下載原始數(shù)據(jù),利用R語言對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析(以P<0.05,|logFC|≥0.5為篩選條件)和聚類分析,獲得差異表達(dá)基因。

1.2.2共有差異表達(dá)基因Venn分析 通過TBtools軟件對兩個數(shù)據(jù)集的共有差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,得到交叉表達(dá)基因Venn圖及共有基因列表信息。

1.2.3基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 GO分析是高通量基因數(shù)據(jù)功能分析最常用的方法,研究目標(biāo)基因在細(xì)胞組分、分子功能和生物過程3個層面的功能作用。KEGG分析包含了多種生物化學(xué)通路,可以更清楚地了解目標(biāo)基因參與人體哪些通路。通過將待分析基因列表上傳至DAVID生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫,即可關(guān)聯(lián)到基因相關(guān)功能注釋和通路富集情況,將結(jié)果下載為文本文件,使用R語言(ggplot)對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2.4基因富集(GSEA)分析 GSEA分析對基因表達(dá)量矩陣進(jìn)行計(jì)算,分析基因集合,可以更全面地分析基因的富集情況。下載兩個數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)原始數(shù)據(jù)并進(jìn)行整理,使用GSEA線上軟件(https://www.omicshare.com/tools/Home/)進(jìn)行可視化分析,篩選條件為P<0.01,錯誤發(fā)現(xiàn)的比率(FDR)<25%。

1.2.5蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析 PPI分析使用STRING(https://cn.string-db.org/)在線軟件。將基因列表上傳即可展示PPI分析結(jié)果,下載數(shù)據(jù)后通過Cytoscpe插件篩選Hub基因,并對PPI圖進(jìn)行可視化。采用GeneMINIA在線分析軟件對Hub基因進(jìn)行基因功能預(yù)測。

1.2.6臨床指標(biāo)檢測 根據(jù)心血管病學(xué)分會介入心臟病學(xué)組制訂的CHD診斷標(biāo)準(zhǔn),選取包頭市第八醫(yī)院收治的CHD患者74例[平均年齡(57.53±5.37)歲]和健康體檢者71例[平均年齡(52.44±8.43)歲]。排除標(biāo)準(zhǔn):并發(fā)自身免疫性疾病和急/慢性感染性疾病;合并惡性腫瘤、腎功能不全和肝膽疾病;近1個月服用過糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。檢測指標(biāo)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT#)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYMPH#)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(MONO#)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、hs-CRP、總膽紅素(TBIL)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和Hcy。本研究獲得包頭市第八醫(yī)院倫理委員會審批,所有研究對象知情并同意參與本研究。

1.2.7蛋白印記法(Western blot)檢測大鼠Toll樣受體(TLR)4、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變(ATM)蛋白表達(dá) 選取清潔級SD大鼠15只,體質(zhì)量220～250 g。隨機(jī)抽取9只每天給予高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)6周后,腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg,連續(xù)3次,間隔24 h,建立CHD大鼠模型,選取建模成功的CHD模型6只,其余6只作為對照組。取大鼠心肌組織100 mg加入適量放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液提取蛋白,使用試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將蛋白溶液與緩沖液進(jìn)行混合并煮沸,短暫離心后根據(jù)目標(biāo)蛋白相對分子質(zhì)量配制不同濃度分離膠,設(shè)置電泳時間,電泳后的樣本轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,按照順序放置于轉(zhuǎn)印夾低溫轉(zhuǎn)印150 min;取出PVDF用Tris緩沖液(TBS)清洗1 min,快速轉(zhuǎn)移至一抗中,4 ℃孵育過夜,次日取出用加吐溫20的TBS(TBST)清洗10 min,共3次,移入熒光二抗中避光孵育2 h,移出用TBST清洗10 min,共3次,隨后進(jìn)行X光顯影檢測。

2 結(jié) 果

2.1差異基因的篩選 為尋找CHD相關(guān)差異表達(dá)基因,進(jìn)一步分析疾病發(fā)生中基因的相互作用,以P<0.05,|LogFC|≥0.5為篩選條件進(jìn)行分析。GSE71226中共鑒定出3 348個差異基因,其中包括1 509個上調(diào)基因,1 839個下調(diào)基因;GSE66360共鑒定出2 820個差異基因,其中包括1 724個上調(diào)基因,1 096個下調(diào)基因。

2.2共有差異表達(dá)基因的Venn分析 為找到CHD患者具有顯著差異的共表達(dá)基因,通過Venn分析將兩個數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,結(jié)果顯示,兩個數(shù)據(jù)集有458個共有差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因171個,下調(diào)基因287個。見圖1。

注:A為上調(diào)基因;B為下調(diào)基因。

2.3GO和KEGG分析 為了解兩個數(shù)據(jù)集中CHD患者共有差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能,對458個共有差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO分析,結(jié)果顯示,CHD中共有差異表達(dá)基因主要參與的生物學(xué)功能包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA模板化;所屬的細(xì)胞成分主要包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等;其分子功能主要為蛋白質(zhì)結(jié)合、金屬離子結(jié)合。KEGG分析顯示,共有差異表達(dá)基因顯著富集的信號通路包括單純皰疹病毒Ⅰ型感染、破骨細(xì)胞分化、花生四烯酸代謝通路、核因子(NF)-κB信號通路等,表明這些基因主要參與一些病毒感染、炎癥和免疫相關(guān)代謝通路。見表1。

表1 部分共有差異表達(dá)基因KEGG通路分析

2.4GSEA富集分析 為進(jìn)一步分析CHD差異表達(dá)基因可能參與的信號通路,對兩個數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)譜進(jìn)行GSEA分析,結(jié)果顯示,兩個數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因主要富集于Toll樣受體信號通路、炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞遷移和花生四烯酸代謝通路等,表明CHD中差異表達(dá)基因主要在炎癥反應(yīng)中富集,并表現(xiàn)為負(fù)反饋調(diào)節(jié),與KEGG分析結(jié)果一致。

2.5PPI分析 為篩選CHD中的關(guān)鍵基因,對458個共有差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI分析,使用MCODE插件對PPI圖進(jìn)行聚類(node score cut-off =0.2,K-core=2),通過K-means聚類算法將得分排序,篩選出前兩條基因簇。見圖2。使用Cytohubba插件以MCC算法篩選出20個關(guān)鍵基因。上調(diào)基因包括細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)、白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL1RN)、整合素αM(ITGAM)、CXC基序趨化因子受體1(CXCR1)、雙特異性磷酸酶1(DUSP1)、Fc γ受體ⅡA(FCGR2A)、甲酰肽受體2(FPR2)、含7A的C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CLEC7A)、細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)等,下調(diào)基因包括前列腺素-過氧化內(nèi)合酶2(PTGS2)、磷酸酶和張力素同系物(PTEN)、過氧化物酶體增殖物激活受體ɑ(PPARA)、TLR8、TLR4、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、GATA結(jié)合蛋白3(GATA3)、ATM基因、維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(DDX58)、白細(xì)胞介素1受體Ⅱ型(IL1R2)、人抑瘤素M(OSM)等。這提示這些基因的異常表達(dá)可能與CHD的發(fā)生與發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)。使用GeneMINIA軟件對Hub基因互作關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,TLR4、ATM基因和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因相互作用明顯,表明其可能在CHD的發(fā)生中共同參與調(diào)控。

注:A為基因簇1(score:5.8);B為基因簇2(score:4.0)。

2.6臨床檢測指標(biāo)結(jié)果 CHD患者M(jìn)ONO#、hs-CRP、TC、Hcy水平均明顯高于健康對照者,LYMPH#、Hb水平均明顯低于健康對照者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 CHD患者與健康對照者臨床檢測指標(biāo)水平比較

2.7TLR4、ATM在CHD大鼠心肌組織中的表達(dá)水平 與健康大鼠心肌組織比較,CHD大鼠心肌組織TLR4、ATM蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 TLR4、ATM在CHD大鼠心肌組織和健康大鼠心肌組織中蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

我國心血管疾病的死亡人數(shù)仍在快速增長,患病人群以老年人為主,伴有并發(fā)癥多和病死率高的風(fēng)險。冠狀動脈造影術(shù)不僅給患者帶來痛苦,還要承擔(dān)昂貴的醫(yī)療費(fèi)用[6]。CHD發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,尚無確切闡述,但已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),動脈粥樣硬化與血管壁炎癥及脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)[3,7]。本研究通過生物信息學(xué)分析技術(shù),篩選CHD差異表達(dá)基因,探究其發(fā)生、發(fā)展中參與的生物過程,結(jié)合臨床檢測指標(biāo)綜合分析,對核心基因進(jìn)行驗(yàn)證,旨在為疾病的早期診斷提供思路。

NF-κB是細(xì)胞中對免疫與炎癥進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要因子,具有促進(jìn)炎性細(xì)胞因子活化、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用[8]。TLR4是Toll樣受體家族在炎癥反應(yīng)中一類高度保守的模式識別受體,其與特異性配體結(jié)合后通過激活一系列下游蛋白質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)將刺激信號傳遞到細(xì)胞核,激活免疫應(yīng)答基因,如NF-κB,進(jìn)而誘導(dǎo)與炎癥反應(yīng)相關(guān)的各種細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)[9]。本研究臨床指標(biāo)中檢測到Hcy、hs-CRP、TC水平在CHD患者中顯著升高。C反應(yīng)蛋白(CRP)是機(jī)體受到感染或組織損傷后血漿中急劇上升的一種急性蛋白質(zhì),是經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活劑[10]。PANG等[11]發(fā)現(xiàn),Hcy通過刺激CRP來啟動血管平滑肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng),而CRP通過NMDAr-ROS-ERK1/2/p38-NF-κB信號通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子、抑制NO的產(chǎn)生而損傷內(nèi)皮細(xì)胞,從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展。血脂異常在CHD中起著關(guān)鍵作用,機(jī)體內(nèi)TC水平過高也是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要因素。XIAO等[12]發(fā)現(xiàn),TC水平也與TLR4/NF-κB通路的激活有關(guān)。

本研究在對Hub基因互作關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn),TLR4、ATM與MTHFR存在相互作用關(guān)系[13]。MTHFR基因是Hcy代謝的關(guān)鍵酶,其677位容易發(fā)生突變從而導(dǎo)致該酶活性降低,Hcy代謝能力受阻,導(dǎo)致體內(nèi)Hcy水平升高[14]。同時,MTHFR基因可通過損傷患者內(nèi)皮細(xì)胞使血管彈性降低,從而促進(jìn)冠狀動脈斑塊形成[15]。ATM蛋白屬于磷脂酰肌醇3-OH家族成員,是細(xì)胞管家基因,在DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用[16]。動脈粥樣硬化常伴隨氧化應(yīng)激程度升高,其特征是血管壁中的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。動脈粥樣硬化發(fā)生的氧化應(yīng)激和DNA損傷均已被證明能激活A(yù)TM基因[17-18]。本研究KEGG分析發(fā)現(xiàn),ATM基因也參與了NF-κB信號通路的調(diào)控,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子而發(fā)揮作用。氧化激活的ATM激酶具有促細(xì)胞增殖作用,通過磷酸化下游底物,參與多條相關(guān)通路以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、調(diào)控代謝功能和增強(qiáng)信號通路[19]。本研究在CHD大鼠心肌組織Western blot實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),TLR4和ATM蛋白在心肌組織中低表達(dá)(P<0.05),提示在CHD發(fā)生過程中這兩個基因參與了調(diào)控,證實(shí)了本研究結(jié)果,因此,這兩個基因有望成為CHD的候選標(biāo)志物。

綜上所述,CHD的發(fā)生與發(fā)展伴隨著炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常。TLR4、ATM參與的生物過程在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中起著重要作用,通過對CHD患者有顯著差異表達(dá)的指標(biāo)與差異表達(dá)基因參與的通路進(jìn)行綜合分析,了解CHD關(guān)鍵指標(biāo)檢測的重要性,為高危人群的篩查及診斷提供思路。本研究還具有一定的局限性:首先,樣本量較小導(dǎo)致一些檢測指標(biāo)差異不明顯;其次,針對核心基因的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)還不夠完善。后續(xù)將通過更加完善的研究對CHD的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探索,為疾病的診斷和預(yù)防提供更有意義的指導(dǎo)。