王凱華,楊鑫勇,李 巖,鄭光珊,陳真珍,黃龍堅(jiān)

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 南寧 530201;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧530200;3.右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西 南寧533000)

柚皮素(Naringenin,NAR)是一類天然黃酮類化合物,廣泛存在于柑橘屬、薔薇科等植物中,在西紅柿、葡萄等水果中含量也較高[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),NAR具有抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤、抗損傷、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善糖脂代謝、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等多種藥理作用,已被開發(fā)應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等多個(gè)領(lǐng)域[3-4]。在急性肺損傷動(dòng)物模型中,NAR可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理改變,抑制炎癥細(xì)胞因子釋放,改善肺損傷的病理狀態(tài)[5]。在心肌缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)損傷模型中,NAR預(yù)處理可明顯降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和氧化應(yīng)激水平,從而改善大鼠心肌I/R損傷[6]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們構(gòu)建了大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞糖氧剝奪/再灌注(Oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/Rep)模型,探索NAR處理對腦I/R損傷的保護(hù)作用及其與線粒體自噬的關(guān)系,為NAR保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞I/R損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 柚皮素(#N164488);神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清為美國GIBCO公司產(chǎn)品;Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒(DCF-DA)為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)測試盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)測定試劑盒,來自南京建成生物工程研究所?？筁C3抗體、抗P62抗體、抗細(xì)胞色素C抗體(Cytochrome C)、抗編碼線粒體定位激素的假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)抗體和抗Parkin抗體均購自美國Abcam公司。酶標(biāo)儀為美國Bio-Red公司iMark型號。Guava easycyte流式細(xì)胞儀為美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OGD/Rep法模擬神經(jīng)細(xì)胞體外I/R模型:取本實(shí)驗(yàn)室先前制備并鑒定的大鼠皮層神經(jīng)元[7],參照經(jīng)典的神經(jīng)細(xì)胞OGD/Rep模型制作方法制備[8]。取生長狀態(tài)良好的神經(jīng)細(xì)胞,用無糖Earle’s鹽溶液洗滌數(shù)次再加入無糖Earle’s鹽溶液培養(yǎng),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),向箱內(nèi)緩慢通入含有95% 氮?dú)?N2)和5%二氧化碳(CO2)的混合氣體30 min,以形成低氧環(huán)境。關(guān)閉培養(yǎng)箱氣體進(jìn)出管,靜置90 min(氧糖剝奪,體外模擬缺血缺氧)。取出細(xì)胞,吸去無糖Earle’s鹽溶液,換成細(xì)胞正常培養(yǎng)基,放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)正常培養(yǎng)(復(fù)糖復(fù)氧,體外模擬再灌注),獲得OGD/Rep神經(jīng)細(xì)胞模型,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)措施:將未經(jīng)處理的大鼠皮層神經(jīng)元和經(jīng)OGD/Rep造模的細(xì)胞分組如下:正常組(NC,正常大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞);模型組(OGD/Rep造模的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞);模型+NAR組(OGD+NAR,經(jīng)OGD/Rep造模處理后用含80 μmol/L NAR的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)組);正常+NAR組(NC+NAR,大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞用含80 μmol/L NAR的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)組)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 MTT檢測細(xì)胞增殖活力:取上述各實(shí)驗(yàn)分組的細(xì)胞,加入96孔板,37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h,每組每個(gè)時(shí)間段設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。取出細(xì)胞培養(yǎng)板,磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered solution,PBS)洗滌1次后加入10% MTT溶液,放回細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。輕輕吸棄各孔溶液,加入150 μl二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),輕微震蕩充分溶解結(jié)晶物。酶標(biāo)儀490 nm波長處檢測各孔吸光度(Optical density,OD)值并記錄數(shù)值。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡:各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后,經(jīng)胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞,1500 r/min離心5 min,棄上清,適量PBS重懸細(xì)胞,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(Propidium iodide,PI),混勻。室溫下避光反應(yīng)10 min。離心洗滌2次后,PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率(凋亡率為PI陽性和FITC陽性之和)。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)ROS測定:培養(yǎng)48 h后,取上述各實(shí)驗(yàn)分組的細(xì)胞,PBS洗滌2次,加入DCF-DA工作液,100 μl/孔,充分混勻。5% CO2、37 ℃下染色30 min。去掉上清,PBS洗滌2次,流式細(xì)胞儀檢測FL1通道熒光強(qiáng)度。FL1通道熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比。

1.3.4 化學(xué)比色法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA和GSH水平及SOD 活性:培養(yǎng)48 h后,取出各組細(xì)胞,PBS洗滌3次,棄上清,收集細(xì)胞于離心管內(nèi),向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入PBS,冰水浴中超聲(超聲功率300 W,超聲一次3～5 s,間隔30 s,共超聲4次)。經(jīng)蛋白定量后,按照各說明書所列方法進(jìn)行取樣、加樣、孵育,并于酶標(biāo)儀對應(yīng)波長處進(jìn)行OD值檢測,計(jì)算 MDA和GSH水平及SOD 活性。

1.3.5 Western blot實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)72 h后,取出各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白并測定其濃度,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉80 min,分別使用抗LC3(ab192890,1∶2000)、抗P62(ab109012,1∶1000)、抗Cytochrome C抗體(ab133504,1∶5000)、抗PINK1抗體(ab186303,1∶1000)、抗Parkin抗體(ab77924,1∶2000)和抗GAPDH(ab8245,1∶5000)進(jìn)行一抗孵育,室溫下1 h,然后置于抗鼠或抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗中(1∶5000)。洗滌后,超敏化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行發(fā)光,黑暗下X線底片覆蓋曝光。經(jīng)顯影、定影后,待干燥后拍照。

2 結(jié) 果

2.1 NAR可增強(qiáng)OGD/Rep模型細(xì)胞活力 MTT檢測結(jié)果如圖1所示。與NC組相比,OGD模型組細(xì)胞OD值明顯降低,說明OGD/Rep造模使大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制;NAR加入到模型細(xì)胞中后,神經(jīng)細(xì)胞的增殖活力明顯增強(qiáng)(OD值明顯升高,P<0.05)。

注:與OGD組比較,*P<0.05;與OGD組比較,#P<0.05;與OGD組比較,△P<0.05圖1 NAR可增強(qiáng)OGD/Rep模型細(xì)胞活力

2.2 NAR可抑制OGD/Rep模型細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測NAR對OGD/Rep模型細(xì)胞凋亡的影響見圖2。與NC組比較,模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與OGD模型組比較,OGD+NAR組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,NAR處理可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,抑制OGD/Rep模型細(xì)胞凋亡。

圖2 NAR可抑制OGD/Rep模型細(xì)胞凋亡

2.3 NAR可抑制OGD/Rep模型細(xì)胞ROS產(chǎn)生 流式細(xì)胞儀檢測NAR對OGD/Rep模型細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響見圖3。與NC組比較,OGD模型組細(xì)胞ROS值明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與OGD模型組比較,OGD+NAR組ROS值明顯降低(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,NAR處理可抑制OGD/Rep模型ROS產(chǎn)生。

圖3 NAR可抑制OGD/Rep模型細(xì)胞ROS產(chǎn)生

2.4 NAR可增強(qiáng)OGD/Rep模型細(xì)胞抗氧化能力 NAR處理OGD/Rep模型細(xì)胞和正常培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞后,其抗氧化指標(biāo)(MDA、GSH和SOD)檢測結(jié)果見表1。與正常細(xì)胞NC組比較,OGD/Rep模型細(xì)胞的MDA水平顯著升高,而經(jīng)NAR處理后其水平表現(xiàn)出下降趨勢(P<0.05)。對于GSH和SOD,與NC組比較OGD/Rep模型組細(xì)胞的GSH和SOD水平明顯降低(均P<0.05),與OGD/Rep模型相比OGD+NAR組GSH和SOD水平明顯升高(均P<0.05)。此外,NAR處理可降低正常培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞MDA水平,增強(qiáng)GSH和SOD水平(均P<0.05)。

表1 各組MDA、GSH和SOD水平比較

2.5 NAR可增強(qiáng)OGD/Rep模型細(xì)胞自噬 Western blot 分析NAR對OGD/Rep模型細(xì)胞和正常培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞自噬蛋白LC3和P62,Cytochrome C、PINK1、Parkin的影響見圖4。由圖4可知,與NC組比較,模型細(xì)胞的LC3、Cytochrome C、PINK1、Parkin水平顯著性升高,P62水平顯著性降低(均P<0.05);與OGD模型組比較,OGD+NAR組LC3、PINK1、Parkin水平顯著性升高,P62和Cytochrome C水平顯著性降低(均P<0.05);與NC組比較,NAR處理的正常培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞的LC3、PINK1、Parkin水平顯著性升高,P62和Cytochrome C水平顯著性升高(均P<0.05)。

圖4 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

腦血管類疾病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,目前已成為中國居民死亡的第一原因和成人殘疾的第一原因[9-10]。我們在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)NAR對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)線粒體和抗氧化應(yīng)激作用,動(dòng)物模型也表明NAR對I/R造成的腦損傷有較好的保護(hù)作用[11]?；谏鲜鲅芯? NAR能否保護(hù)處于I/R病理過程中的神經(jīng)細(xì)胞,以及NAR是否通過調(diào)控自噬過程來實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用等問題引起了我們的關(guān)注。本研究的結(jié)果證實(shí)了我們的猜想,NAR處理可以增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞增殖活力、抗氧化能力,促進(jìn)自噬相關(guān)LC3、PINK1和Parkin蛋白表達(dá),抑制P62蛋白表達(dá),增強(qiáng)自噬水平。因此,NAR作為治療腦卒中的天然備選藥物之一,成為一大研究熱點(diǎn)。

線粒體功能失調(diào)和氧化應(yīng)激損傷是造成腦I/R不可逆損傷的主要因素之一。線粒體功能失調(diào)和氧化/抗氧化失衡時(shí),神經(jīng)細(xì)胞的線粒體可產(chǎn)生大量ROS、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡甚至死亡[12]。因此,從線粒體功能失調(diào)和氧化/抗氧化體系失衡方面探尋治療腦I/R損傷的方法愈來愈受到研究者的關(guān)注,通過積極保護(hù)線粒體功能、抗氧化、清除自由基,加強(qiáng)自噬,成為保護(hù)腦I/R損傷神經(jīng)細(xì)胞的策略之一[13-14]。眾多研究表明,腦缺血可以誘導(dǎo)缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬,而進(jìn)一步激活線粒體自噬可明顯減弱神經(jīng)細(xì)胞損傷[15-16]。一些中國傳統(tǒng)中藥或者其活性成分正是通過促進(jìn)線粒體自噬來發(fā)揮對腦I/R損傷的治療作用的[17-18]。本研究結(jié)果表明,NAR處理可以增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化能力,促進(jìn)自噬相關(guān)LC3、PINK1和Parkin蛋白表達(dá),抑制P62蛋白表達(dá),增強(qiáng)自噬水平,對腦I/R損傷后的神經(jīng)細(xì)胞和正常的皮層神經(jīng)細(xì)胞均具有保護(hù)作用。

在哺乳動(dòng)物中,線粒體實(shí)現(xiàn)自噬主要涉及兩個(gè)蛋白:PARK2以及PINK1,其蛋白產(chǎn)物Parkin是細(xì)胞質(zhì)E3泛素連接酶,作為線粒體自噬中最主要的途徑,PINK1/Parkin介導(dǎo)線粒體自噬在各類損傷中發(fā)揮著重要作用[19]。PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和腦I/R損傷中最重要的機(jī)制之一。在神經(jīng)細(xì)胞PC12損傷模型中,PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬是人參皂苷Rg1減輕線粒體損傷的可能機(jī)制,是保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的重要方式之一。Wu等[20]的研究發(fā)現(xiàn),燈盞花素可誘導(dǎo)PINK1表達(dá)并觸發(fā)Parkin易位到受損的線粒體以誘導(dǎo)線粒體吞噬,以減弱腦I/R損傷,但這些效應(yīng)可被PINK1的敲除所抵消,表明燈盞花素可以促進(jìn)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體吞噬途徑,參與I/R腦損傷的保護(hù)。在本研究中,NAR可促進(jìn)腦I/R損傷后的神經(jīng)細(xì)胞和正常的皮層神經(jīng)細(xì)胞的自噬相關(guān)LC3、PINK1和Parkin蛋白表達(dá),抑制P62蛋白表達(dá),增強(qiáng)自噬水平,從而實(shí)現(xiàn)了保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,改善腦I/R損傷的作用。

綜上所述,柚皮素可明顯增強(qiáng)正常培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞及其OGD/Rep模型細(xì)胞的增殖活力,減少凋亡,提高抗氧化能力,其機(jī)制可能是通過促進(jìn)線粒體自噬PINK1/Parkin通路來實(shí)現(xiàn)的。本研究的結(jié)果對于柚皮素的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1/Parkin信號通路的功能及其效應(yīng)分子的關(guān)系較為復(fù)雜,需要進(jìn)一步深入開展相關(guān)方面的研究。