梁福珍 樊 芳 畢 萌 季 彤 李瀚邦 馬曉婷 劉 宇 胡志娟 賈志旸

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病患者典型的微血管并發(fā)癥之一。2020年,全球約有1.031億人患有糖尿病視網(wǎng)膜病變,預(yù)計到2045年將增加至1.605億人[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變現(xiàn)已成為全世界工作年齡人群致盲的首要原因[2]。在長期高血糖狀態(tài)下,視網(wǎng)膜代謝增加會引起缺血缺氧,加重氧化應(yīng)激和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)損傷[3],引起視功能下降[4]。因此,抗氧化應(yīng)激是延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展的重要方式之一。

核因子紅細胞2相關(guān)因子2(Nrf2)是一種細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,它通過與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合來調(diào)控包括血紅素加氧酶1(HO-1)在內(nèi)的多種抗氧化因子的基因表達,激活抗氧化保護系統(tǒng),減輕氧化應(yīng)激對細胞和組織的影響[5]。齊墩果酸是一種五環(huán)三萜類化合物,以游離和(或)與糖結(jié)合成苷的形式廣泛存在于植物界,具有保肝、抗糖尿病、抗炎、抗癌等多種藥理作用[6-7]。研究表明,齊墩果酸可以增加糖尿病大鼠心肌組織中Nrf2及HO-1蛋白的表達,減輕心肌組織的氧化應(yīng)激,從而減輕糖尿病大鼠心肌的損傷[8]。本研究探討齊墩果酸對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)和RGC損傷的影響,為臨床防治糖尿病視網(wǎng)膜病變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

取6周齡健康清潔級雄性SD大鼠30只,體重180～220 g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2019-0009]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將30只大鼠隨機分為對照組、糖尿病組和齊墩果酸組,每組10只。本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn),實驗動物的喂養(yǎng)、使用和管理遵循《實驗動物管理條例》的規(guī)定。

1.1.2 試劑與儀器

鼠維持飼料與45%脂肪供能高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司),鏈脲佐菌素、齊墩果酸(美國Sigma公司),吐溫80和BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),丙二醛(MDA)測定試劑盒與超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),腦特異性同源盒蛋白3a(Brn-3a)抗體(英國Abcam公司),Nrf2抗體和HO-1抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),石蠟切片機、倒置顯微鏡(德國LEICA公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立

對照組大鼠給予鼠維持飼料喂養(yǎng),糖尿病組和齊墩果酸組給予高脂飼料喂養(yǎng)。4周后,大鼠禁食12 h,取適量鏈脲佐菌素溶于0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)中,按照35 mg·kg-1的劑量給予糖尿病組和齊墩果酸組大鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素,對照組注射相應(yīng)體積的檸檬酸鈉緩沖液。次日尾靜脈采血,如大鼠空腹血糖≥11.1 mmol·L-1說明造模成功。剔除2只造模失敗的大鼠,最終對照組10只大鼠,糖尿病組9只,齊墩果酸組9只。

1.2.2 藥物干預(yù)及取材處理

將齊墩果酸溶于吐溫80,齊墩果酸組大鼠按照100 mg·kg-1劑量每天給予齊墩果酸灌胃;對照組及糖尿病組大鼠每天給予等量的溶劑灌胃。灌胃8周后,腹腔內(nèi)注射100 g·L-1水合氯醛,過量麻醉處死各組大鼠,迅速摘取雙側(cè)眼球。于顯微鏡下迅速分離左眼視網(wǎng)膜,按19的比例加入磷酸鹽緩沖液(PBS),充分研磨制成視網(wǎng)膜勻漿,4 ℃低溫離心機3 500 r·min-1離心10 min,取上清液放入-80 ℃保存,用于SOD活性和MDA含量檢測,取大鼠右側(cè)眼球迅速放入眼球固定液中,常規(guī)石蠟包埋后切片,厚度5 μm,用于HE染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.2.3 視網(wǎng)膜組織中SOD活性和MDA含量檢測

取保存于-80 ℃的視網(wǎng)膜勻漿上清液,嚴(yán)格按照SOD、MDA試劑盒的說明書來測定視網(wǎng)膜組織中的SOD活性和MDA含量。

1.2.4 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)

切片常規(guī)脫蠟至水,PBS洗3次,每次3 min;蘇木素染液浸染3 min,自來水沖洗;分化液分化15 s,自來水沖洗返藍;伊紅染液浸染2 min,自來水沖洗;梯度酒精脫水后二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟至水,高壓抗原修復(fù);滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,室溫孵育15 min,PBS洗3次,每次3 min;分別滴加一抗Brn3a(1200)、Nrf2(1400)、HO-1(1400),4 ℃孵育過夜,PBS洗3次,每次3 min;滴加二抗,室溫孵育1 h,PBS洗3次,每次3 min;DAB顯色,蘇木素染液復(fù)染1 min,自來水沖洗;分化液分化15 s,自來水沖洗返藍;梯度酒精脫水后二甲苯透明,中性樹膠封片后拍照;采用ImageJ軟件計算Brn3a染色陽性的RGC密度,測定單位面積內(nèi)Nrf2及HO-1染色陽性平均光密度(MOD)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析和LSD-t檢驗進行組間比較,檢驗水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD活性及MDA含量

三組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD活性比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD活性低于對照組,齊墩果酸組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD活性高于糖尿病組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。三組大鼠視網(wǎng)膜組織MDA含量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織MDA含量高于對照組,齊墩果酸組大鼠視網(wǎng)膜組織MDA含量低于糖尿病組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD活性、MDA含量及RGC密度

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化對照組大鼠視網(wǎng)膜RGC層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層和外核層各層結(jié)構(gòu)清晰,細胞排列整齊、形態(tài)正常;與對照組相比,糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜變薄,結(jié)構(gòu)疏松,內(nèi)核層和外核層細胞排列紊亂,外叢狀層連續(xù)性差;與糖尿病組相比,齊墩果酸組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較清晰,細胞排列較整齊(圖1)。

A:對照組;B:糖尿病組;C:齊墩果酸組。GCL:RGC層;IPL:內(nèi)叢狀層;INL:內(nèi)核層;OPL:外叢狀層;ONL:外核層。圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織RGC密度

三組大鼠視網(wǎng)膜組織RGC密度比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織RGC密度小于對照組,齊墩果酸組大鼠視網(wǎng)膜組織RGC密度大于糖尿病組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(表1和圖2)。

A:對照組;B:糖尿病組;C:齊墩果酸組。白色箭頭示RGC;GCL:RGC層;IPL:內(nèi)叢狀層;INL:內(nèi)核層;OPL:外叢狀層;ONL:外核層。圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2和HO-1蛋白表達

各組大鼠視網(wǎng)膜組織各層均有Nrf2、HO-1表達。三組大鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2、HO-1染色陽性MOD比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織Nrf2、HO-1染色陽性MOD均高于對照組,齊墩果酸組Nrf2、HO-1染色陽性MOD均高于糖尿病組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(表2)。

表2 各組視網(wǎng)膜組織Nrf2和HO-1蛋白表達情況

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病常見并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致患者視力受損和失明的主要原因[9]。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制目前尚未完全明確。研究表明,糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與氧化應(yīng)激、炎癥、多元醇通路激活、蛋白激酶C激活以及己糖胺途徑活化等多種機制相關(guān)[10]。其中,氧化應(yīng)激是由于體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除不平衡而引起的一種狀態(tài),已被證實是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病的關(guān)鍵因素之一[11]。RGC是一種特殊的投射神經(jīng)元,位于視網(wǎng)膜內(nèi)表面附近。研究表明,在糖尿病視網(wǎng)膜病變早期未出現(xiàn)明顯血管損傷時,就已出現(xiàn)RGC受損[12],其損傷、變性及凋亡可直接導(dǎo)致視功能的損害[13],減輕氧化應(yīng)激所致RGC損傷是糖尿病視網(wǎng)膜病變防治的重要靶點。

Nrf2是一種調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子,可誘導(dǎo)多種抗氧化基因的表達。在生理狀態(tài)下,Nrf2與Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1在細胞質(zhì)中共價結(jié)合,當(dāng)體內(nèi)氧化應(yīng)激增強時,關(guān)聯(lián)蛋白1發(fā)生構(gòu)象變化,從而使Nrf2解離并轉(zhuǎn)入核內(nèi)。在細胞核中,Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,調(diào)控其下游抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄,包括HO-1、醌氧化還原酶1等[14]。HO-1是血紅素降解的關(guān)鍵酶,可將血紅素降解為膽綠素、一氧化碳和亞鐵,共同發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用[15]。齊墩果酸是一種植物界廣泛存在的五環(huán)三萜類化合物,可以從多種植物及草藥中提取出來。它可以通過抑制小腸黏膜刷狀緣的α-葡萄糖苷酶活性,延緩碳水化合物吸收,降低餐后高血糖,從而發(fā)揮抗糖尿病的作用[16]。有文獻報道,齊墩果酸能夠激活Nrf2,上調(diào)細胞保護基因表達,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。

在本研究中,糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜變薄、視網(wǎng)膜各層細胞排列紊亂、RGC密度減少,提示造模成功。SOD活性與MDA含量是常見的氧化應(yīng)激指標(biāo)。糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性降低、MDA含量增加,氧化應(yīng)激增強,RGC密度減少。同時機體的抗氧化應(yīng)激機制啟動,表現(xiàn)為視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1蛋白表達升高,這可能是糖尿病狀態(tài)下機體的適應(yīng)性反應(yīng)。而與糖尿病組相比,齊墩果酸組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性升高、MDA含量下降,說明經(jīng)齊墩果酸治療后機體的抗氧化能力增強。同時大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2和HO-1蛋白表達明顯升高、RGC密度增加,提示齊墩果酸能夠激活Nrf2,上調(diào)抗氧化因子HO-1的表達,從而減輕氧化應(yīng)激損傷,保護受損的RGC。

4 結(jié)論

齊墩果酸可能通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路來減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)和RGC損傷。但是由于糖尿病的發(fā)病機制復(fù)雜,本研究仍存在一些不足,如未能在分子層面深入探究齊墩果酸的抗氧化應(yīng)激作用,今后我們將進一步深入研究。