［摘要］目的通過Akt/GSK3-β信號通路研究6-姜酚對心肌缺血再灌注損傷（I/R）的影響。方法（1）選取相同月齡的健康雄性Wistar大鼠32只，依據隨機數字表法將大鼠分為對照組1、I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組各8只，對I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組制備I/R模型，分別給予I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組2 mg/kg及4 mg/kg的6-姜酚溶液2 mL灌胃，對照組1及I/R1組大鼠灌注等量蒸餾水。比較各組干預后心肌細胞凋亡水平、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、血清乳酸脫氫酶（LDH）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、核因子κB（NF-κB）、Akt、p-Akt、GSK3-β及p-GSK3-β表達水平。（2）H9C2心肌細胞分為對照組2、I/R2組、I/R2+50 mmol/L組、I/R2+100 mmol/L組，每組3份。對I/R2組、I/R2+50 mmol/L組、I/R2+100 mmol/L組H9C2心肌細胞建立I/R模型，分別將對照組2、I/R2組、I/R2+50 mmol/L組及I/R2+100 mmol/L組H9C2心肌細胞置于含有0 mmol/L、0 mmol/L、50 mmol/L和100 mmol/L的6-姜酚DMEM培養(yǎng)基中，比較H9C2心肌細胞干預后的凋亡水平、Caspase-3、LDH、Akt、p-Akt、GSK3-β、p-GSK3-β的表達水平。結果（1）I/R+4 mg/kg組的細胞凋亡面積及Caspase-3、LDH、IL-6、TNF-α及NF-κB水平均低于I/R1組（Plt;0.05），且I/R+4 mg/kg組的細胞凋亡面積及Caspase-3及IL-6水平低于I/R+2 mg/kg組（Plt;0.05）；I/R+4 mg/kg組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R1組及I/R+2 mg/kg組（Plt;0.05）。（2）I/R2+100 mmol/L組的細胞凋亡率、Caspase-3及LDH均低于I/R2組及I/R2+50 mmol/L組（Plt;0.05），I/R2+100 mmol/L組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R2 組及I/R2+50 mmol/L組（Plt;0.05）。結論6-姜酚處理后的大鼠心肌細胞I/R程度顯著減輕，炎癥因子降低，心肌細胞的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β信號通路相關蛋白比值升高，考慮6-姜酚通過激活Akt/GSK3-β信號通路達到改善心肌I/R的效果。

［關鍵詞］6-姜酚；大鼠；H9C2心肌細胞；缺血再灌注損傷；Akt/GSK3-β信號通路

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2023.03.011

6-Gingerol Improving Myocardial Ischemia-Reperfusion Injuryby Akt/GSK3-β Signaling Pathway

Zeng Xiaoman，Chen Zejiang，Zhang Laxi，Zeng Xiaohui，Li Xiuxia，Qiu Xunwu，Fu Dapeng，Lin Keli，Zheng Yingzhuo

Department of Cardiology，Wenchang People's Hospital of Hainan Province，Wenchang571300

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of 6-gingerol on myocardial ischemia-reperfusion injury（I/R） by Akt/GSK3-β signaling pathway.Methods（1）Thirty-two healthy male Wistar rats with the same age were divided into control group 1，I/R1 group，I/R+2 mg/kg group and I/R+4 mg/kg group according to the random number table，with 8 rats in each group.I/R model was prepared for I/R1 group，I/R+2 mg/kg group and I/R+4 mg/kg group.The rats in the I/R+2 mg/kg group and I/R+4 mg/kg group were given 2 mg/kg and 4 mg/kg of 6-gingerol solution by gavage，respectively，and the rats in the control group 1 and I/R1 group were given the same volume of distilled water.The levels of myocardial cell apoptosis，Caspase-3，serum lactate dehydrogenase（LDH），interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α），nuclear factor κB（NF-κB），Akt，p-Akt，GSK3-β and p-GSK3-β were compared between the groups after intervention.（2）H9C2 cardiomyocytes were divided into control group 2，I/R2 group，I/R2+50 mmol/L group，and I/R2+100 mmol/L group，with 3 in each group.I/R model was established for H9C2 cardiomyocytes in I/R2 group，I/R2+50mmol/L group，and I/R2+100 mmol/L group.The H9C2 cardiomyocytes in control group 2，I/R2 group，I/R2+50 mmol/L group and I/R2+100 mmol/L group were cultured in DMEM medium containing 0 mmol/L，0 mmol/L，50 mmol/L，and 100 mmol/L of 6-gingerol，respectively.The levels of apoptosis，Caspase-3，LDH，Akt，p-Akt，GSK3-β，and p-GSK3-β in H9C2 cardiomyocytes were compared between the groups after intervention.Results（1）Apoptotic area and the levels of Caspase-3，LDH，IL-6，TNF-α and NF-κB in I/R+4 mg/kg group were lower than those in I/R1 group（Plt;0.05）.The apoptotic area and the levels of Caspase-3 and IL-6 in I/R+4 mg/kg group were lower than those in I/R+2 mg/kg group（Plt;0.05）.The levels of p-Akt/Akt and p-GSK3-β/GSK3-β in I/R+4 mg/kg group were higher than those in I/R1 group and I/R+2 mg/kg group（Plt;0.05）.（2）The apoptotic rate，the levels of Caspase-3 and LDH in I/R2+100 mmol/L group were lower than those in I/R2 group and I/R2+50 mmol/L group（Plt;0.05）.The ratio of p-Akt/Akt and p-GSK3-β/GSK3-β in I/R2+100 mmol/L group were higher than those in I/R2 group and I/R2+50 mmol/L group（Plt;0.05）.ConclusionAfter treated with 6-gingerol，the myocardial cells show reduced ischemia-reperfusion injury and inflammatory response，elevated ratio of signaling pathway-related proteins such as p-Akt/Akt and p-GSK3-β/GSK3-β.It is considered that 6-gingerol may improve the ischemia-reperfusion injury by activating the Akt/GSK3-β signaling pathway in myocardial cells.

［Key words］6-Gingerol；Rats；H9C2 cardiomyocytes；Ischemia-reperfusion injury；Akt/GSK3-β signaling pathway

心肌梗死如不能得到有效的治療會危及患者的生命，第一時間解除狹窄恢復血供是改善預后的首要措施。但缺血的心肌細胞在血管再通血液重新灌注后可能出現損傷程度加重、心肌細胞結構損傷，甚至出現冠脈無復流等嚴重心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia-reperfusion injury，I/R）表現，為臨床救治帶來嚴重困擾［1］。6-姜酚是生姜中產生辛辣味覺的主要物質，研究表明其具有改善機體氧化應激反應、對抗細胞凋亡等作用，其生物學效應的發(fā)揮可能與多種信號通路的激活有關［2］。本研究通過Akt/GSK3-β信號通路研究6-姜酚對I/R的影響，為臨床治療I/R提供方案。

1對象與方法

1.1研究對象

選取體質量250～300 g的健康雄性Wistar大鼠32只，依據隨機數字表法分為對照組1、I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組，各8只。各組均采用常規(guī)飼養(yǎng)方法進行飼養(yǎng)，其中I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組在I/R手術后分別按照2 mg/kg及4 mg/kg的劑量進行6-姜酚灌胃10 d，I/R1組及對照組灌胃等體積的蒸餾水。

取H9C2心肌細胞進行培養(yǎng)和分組，分別為對照組2、I/R2組、I/R2+50 mmol/L組、I/R2+100 mmol/L組，各組H9C2心肌細胞分別在含0 mmol/L、0 mmol/L、50 mmol/L和100 mmol/L的6-姜酚的DMEM培養(yǎng)基（未添加血清及葡萄糖）中進行培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1模型制備動物模型制備：對照組1大鼠僅做開胸掛線手術，冠狀動脈的左前降支血管未結扎。缺血再灌注損傷模型的造模方法依據文獻進行［3］。使用乙醚吸入麻醉法將大鼠麻醉，麻醉后扣戴半開放式乙醚吸入面罩，經口氣管插管接大鼠人工呼吸機（呼吸頻率110 次/min）。開始手術，將大鼠固定后，沿胸骨左側2 mm處切開皮膚，鈍性分離肌肉直至見肋骨，之后分離肋間肌，在第4肋間隙處的位置使用拉鉤將胸壁拉開，然后剪開心包膜，用棉簽輕輕按壓住心臟。取針（8-0絲線）在左心耳下緣1～2 mm處進針，進針深度約為1 mm，之后斜向右上方肺動脈圓錐方向出針，針距約2 mm，結扎左前降支近端，驗證模型制作是否成功，成功標志為結扎血管供應區(qū)的心肌腫脹或變?yōu)樯n白色。缺血時間為30 min，之后松開線結解除阻斷行再灌注。最后逐層縫合胸部肌肉、皮膚。

細胞模型制備：將對照組2、I/R2組、I/R2+50 mmol/L組及I/R2+100 mmol/L組H9C2心肌細胞置于填充低氧含量氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，后以2 L/min速度通入空氣并置入常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，以完成再灌注（即復氧）模型的建立。

1.2.2標本采集及檢測按照預定干預方式對各組大鼠進行為期10 d的連續(xù)喂養(yǎng)后，取大鼠左心室血液、冠狀動脈左前降支供應區(qū)域心肌組織及H9C2心肌細胞標本進行檢測。

采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的末端標記技術檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況，利用流式細胞術檢測各組H9C2心肌細胞的凋亡水平。分別采用半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性試劑盒及血清乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒檢測各組Caspase-3及LDH的表達水平。用ELISA法檢測大鼠血清炎癥因子白細胞介素6（Interleukin- 6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）的表達情況。采用免疫印記法分別檢測各組大鼠冠狀動脈左前降支供應區(qū)域心肌組織及各組H9C2心肌細胞的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β的表達水平。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，正態(tài)分布計量資料采用±s表示，多組計量資料采用單因素方差分析，任意兩組間比較采用LSD-t檢驗，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1大鼠心肌細胞損傷情況及炎癥因子水平比較

各組細胞凋亡面積及Caspase-3、LDH、IL-6、TNF-α及NF-κB水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。其中，I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組的細胞凋亡面積及Caspase-3、LDH、IL-6、TNF-α及NF-κB水平均高于對照組（Plt;0.05），I/R+4 mg/kg組的細胞凋亡面積及Caspase-3、LDH、IL-6、TNF-α及NF-κB水平均低于I/R1組（Plt;0.05），I/R+4 mg/kg組的細胞凋亡面積及Caspase-3及IL-6水平低于I/R+2 mg/kg組（Plt;0.05），見表1。

2.2大鼠心肌細胞凋亡信號通路相關蛋白表達水平比較

各組p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。其中，I/R1組、I/R+2 mg/kg組及I/R+4 mg/kg組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均低于對照組（Plt;0.05），I/R+4 mg/kg組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R1組及I/R+2 mg/kg組（Plt;0.05），見表2。

2.3H9C2心肌細胞損傷情況以及凋亡因子水平比較

各組H9C2心肌細胞的細胞凋亡率、Caspase-3及LDH比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。其中，I/R2組、I/R2+50 mmol/L組以及I/R2+100 mmol/L組的細胞凋亡率、Caspase-3及LDH均高于對照組2，I/R2+100 mmol/L組的細胞凋亡率、Caspase-3及LDH均低于I/R2組及I/R2+50 mmol/L組（Plt;0.05），見表3。

2.4H9C2心肌細胞凋亡信號通路相關蛋白表達水平比較

各組H9C2心肌細胞的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。I/R2組、I/R2+50 mmol/L組及I/R2+100 mmol/L組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均低于對照組2，I/R2+100 mmol/L組的p-Akt/Akt及p-GSK3-β/GSK3-β均高于I/R2組及I/R2+50 mmol/L組，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表4。

3討論

I/R是一種常出現于心肌梗死、器官移植、擠壓傷綜合征后因血流中斷一段時間后再次恢復血供，組織器官不僅未出現明顯缺血缺氧狀態(tài)的好轉，反而出現損傷加重、細胞炎癥反應及細胞凋亡情況進一步加劇的現象［4-8］。有研究表明，I/R的發(fā)生和發(fā)展與NF-κB、Akt/GSK3-β等介導的信號通路激活狀態(tài)改變密切相關［2］。組織細胞處于缺血狀態(tài)時，大量黃嘌呤脫氫酶轉化成為黃嘌呤氧化酶，三磷酸腺苷徹底氧化供能產生次黃嘌呤，當重新恢復血供時次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下一次轉化為黃嘌呤和尿酸，并在此過程中生成大量的自由基，而缺血導致清除自由基的抗氧化酶生成不足，自由基大量堆積對機體細胞產生持續(xù)損傷作用，進而導致細胞損傷及凋亡的發(fā)生。據報道，I/R后組織細胞釋放大量IL-6、TNF-α及NF-κB等炎癥因子引發(fā)異?；钴S的炎癥反應，激活溶酶體酶并對自身細胞產生破壞作用，是組織細胞產生損傷的重要因素之一［9-12］。因此，緩解I/R組織細胞自由基堆積及減輕局部炎癥反應程度是降低I/R的重要突破口。

6- 姜酚是生姜中形成辛辣味覺的主要物質，研究表明6-姜酚具有明顯的降低炎癥反應的功效，應用6-姜酚后機體出現明顯的抑制炎癥細胞聚集，降低IL-6、TNF-α及NF-κB等炎癥因子的產生，從而達到抑制溶酶體酶激活，降低細胞損傷的作用［13-15］。經實驗證實6-姜酚通過干預NF-κB的表達，降低氧自由基對細胞氧化應激損傷及DNA損傷作用［16］。據報道，6-姜酚在發(fā)揮對炎癥反應抑制作用的同時對損傷細胞的凋亡也具有緩解作用，應用6-姜酚后機體細胞凋亡情況及Caspase-3、LDH等細胞凋亡指標均有明顯改善［17］。6-姜酚具有強大的抗自由基作用，可顯著降低I/R過程中產生蓄積的大量自由基，從而顯著降低由此而導致的細胞損傷及組織結構損害［18-19］。

本研究表明，2 mg/kg劑量的6-姜酚應用于在體研究心肌I/R模型大鼠后，各項指標均有改善但并不顯著，4 mg/kg劑量的6-姜酚明顯降低大鼠心肌細胞凋亡水平，改善血清細胞凋亡指標及炎癥因子水平，由此可見6-姜酚的治療效果與應用劑量有關。離體研究中，6-姜酚應用于H9C2心肌細胞后同樣發(fā)揮明顯抗細胞凋亡作用。有研究表明，6-姜酚的抗自由基損傷及抗凋亡作用依賴于p-Akt等相關信號通路正常激活，當p-Akt等蛋白相關信號通路被抑制時，Caspase-3等凋亡激活蛋白水平提高，細胞凋亡被激活從而出現細胞損傷［20-22］。應用6-姜酚后大鼠的Akt、p-Akt、GSK3-β及p-GSK3-β水平顯著升高，考慮6-姜酚的顯著抗細胞凋亡及抗炎癥反應機制與Akt/GSK3-β信號通路系統(tǒng)的激活有關，本研究與國內外其他相關研究結果一致［13，23-24］。機體通過激活Akt/GSK3-β信號通路系統(tǒng)，降低炎癥細胞聚集并抑制IL-6、TNF-α及NF-κB等炎癥因子的釋放及進一步可能發(fā)生的炎癥級聯(lián)反應；緩解組織細胞的炎癥損傷及凋亡進程，從而達到降低I/R改善預后的治療效果。鑒于本研究樣本量及實驗條件有限，本次研究結果尚需進一步探討研究。

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（2022-08-19收稿）