高慧婕，李倩，田斌，朱日明，劉超△

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，居惡性腫瘤死亡率第4 位［1-2］。我國的胰腺癌發(fā)病率也呈逐年增加趨勢［3］。傳統(tǒng)中藥及相關(guān)中藥單體的抗腫瘤活性研究已成為熱點(diǎn)。中藥單體是從傳統(tǒng)中藥中提取出的有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素［4］、黃芩素［5］、姜黃素［6］、大黃素［7］等中藥單體能夠抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，在臨床觀察與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也具有同樣的作用。?；撬幔═aurine，Tau）是一種人體內(nèi)含量豐富的必需氨基酸，同時也是一種具有廣泛生理和藥理活性的中藥有效成分，因其首次從牛膽汁中分離得到而命名［8］。Tau 具有抗氧化應(yīng)激、解毒抗炎、降低血糖、增強(qiáng)免疫功能等作用［9］。盡管有研究發(fā)現(xiàn)Tau 具有一定的抗癌活性［10-11］，但對胰腺癌的相關(guān)研究尚少。本研究觀察Tau 對胰腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移的影響，并探討其作用機(jī)制，為胰腺癌的預(yù)防、分子靶向治療及抗癌中藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3 和PANC-1 細(xì)胞購自韋輝生物科技公司，DMEM、胎牛血清（FBS）購自Hyclone。?；撬豳徸园⒗≡噭┯邢薰?。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKARA Biotech，熒光定量PCR 試劑盒（AcaQ qPCR SYBR Green Master）、CCK-8 試劑盒、TUNEL 檢測試劑盒均購自Vazyme Biotech，RIPA 裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒、特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自Beyotime Biotechnology Biotech，Western blot Marker 購自 Solarbio Science &Technology，Tubulin 抗體、P21 抗體、P53 抗體均購自Wuhan Boster Biological Technology，山羊抗小鼠抗體、山羊抗兔抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記）購自Beyotime Biotechnology公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)等購自Thermo Fisher Scientific 公司；熒光定量PCR 儀、超靈敏多功能成像系統(tǒng)、電泳儀、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀等購自Biorad公司；恒溫金屬浴購自大龍興創(chuàng)有限公司；手持式組織研磨器購自上海凈信實(shí)業(yè)器械廠。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

BxPC-3 和PANC-1 細(xì)胞用含10%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8檢測細(xì)胞活力

制備胰腺癌細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)量控制在1 000～3 000個。BxPC-3和PANC-1均分為對照組和不同Tau 濃度處理組（10、20、40、80、160 mmol/L），24～72 h 后，每孔加入CCK-8 試劑10μL，放入培養(yǎng)箱后孵育2 h，放置于酶標(biāo)儀進(jìn)行光密度（OD）值檢測，波長為450 nm。

1.3.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

制備胰腺癌細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞量約每孔1×106個，放置于培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁、長滿，使用微量移液器槍頭進(jìn)行劃線，PBS 沖洗掉懸浮的細(xì)胞。Tau處理，24 h 后使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，記錄劃線區(qū)域的細(xì)胞遷移的變化，進(jìn)行對比分析。Image J軟件計算劃痕面積（S），劃痕愈合率（%）=［（S0h-S24h）/S0h］×100%。

1.3.4 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡

制備胰腺癌細(xì)胞懸液，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞量每孔約5×105個，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)待其貼壁。Tau處理后，根據(jù)TUNEL試劑盒說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，使用多聚甲醛固定細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況并拍照，記錄每張照片內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測p53、p21 等基因的mRNA表達(dá)

Tau 干預(yù)胰腺癌細(xì)胞，24 h 后使用Trizol 法提取細(xì)胞RNA，提取的RNA使用無核酸酶的水溶解，置于-80 ℃保存。參照試劑說明，使用普通PCR 儀將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR 反應(yīng)體系：上、下游引物各0.4μL，SYBR Green Mix 10μL，cDNA 1μL，加ddH2O 至20μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s，58 ℃退火44 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)。引物序列見表1。

Tab.1 The primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3.6 Western blot檢測P53、P21的蛋白表達(dá)

Tau 干預(yù)胰腺癌細(xì)胞24 h 后使用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測量蛋白濃度，置于-80 ℃保存。配制10%SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。儀轉(zhuǎn)膜后Western 洗滌液洗滌2 min，然后置于封閉液中封閉2 h。封閉結(jié)束后分別使用一抗（內(nèi)參為Tubulin 抗體，目的蛋白分別為P21 抗體、P53 抗體，均1∶1 000 稀釋）和相應(yīng)二抗進(jìn)行孵育（一抗4 ℃過夜孵育，二抗4 ℃孵育2 h），每次孵育后使用Western 洗滌液洗滌3 次，每次搖洗10 min。使用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，置于超靈敏多功能成像進(jìn)行顯影記錄分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tau對胰腺癌細(xì)胞增殖活力的影響

不同濃度的Tau（10、20、40、80、160 mmol/L）處理胰腺癌導(dǎo)管細(xì)胞系BxPC-3 細(xì)胞和PANC-1 細(xì)胞24、48、72 h，Tau 對BxPC-3 細(xì)胞和PANC-1 細(xì)胞增殖活力的抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，見圖1、2。而且，40 mmol/L 濃度的Tau 對BxPC-3 細(xì)胞和PANC-1 細(xì)胞增殖活力開始展現(xiàn)出明顯的抑制，后續(xù)主要以40 mmol/L濃度的Tau作為干預(yù)濃度。

Fig.1 Effects of taurine on proliferation of human pancreatic cancer cell lines BxPC-3圖1 Tau對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3細(xì)胞增殖活力的影響

Fig.2 Effects of taurine on proliferation of human pancreatic cancer cell lines PANC-1圖2 Tau對胰腺癌細(xì)胞PANC-1細(xì)胞增殖活力的影響

2.2 Tau 對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3 細(xì)胞和PANC-1 細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃線結(jié)果表明，與對照組相比，Tau（40 mmol/L）對BxPC-3細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞的遷移能力均具有明顯抑制作用，見圖3、4。

Fig.3 Migration ability of cells of the four groups圖3 各組細(xì)胞的遷移能力

Fig.4 Effects of taurine on migration of human pancreatic cancer cell lines BxPC-3 and PANC-1圖4 Tau對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3和PANC-1遷移能力的影響

2.3 Tau對胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL 染色結(jié)果表明，與對照組相比，Tau（40 mmol/L）能明顯促進(jìn)胰腺癌導(dǎo)管細(xì)胞系BxPC-3細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞的凋亡，見圖5、6。

Fig.5 Apoptosis of cells of the four groups圖5 各組細(xì)胞的凋亡情況

Fig.6 Effects of taurine on apoptosis of human pancreatic cancer cell lines BxPC-3 and PANC-1圖6 Tau對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3和PANC-1細(xì)胞凋亡的影響

2.4 Tau對胰腺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，不同濃度的Tau 作用于BxPC-3 細(xì)胞，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BAX、p53、p21 mRNA 的表達(dá)水平較對照組升高，而PCNA mRNA 的表達(dá)降低（P＜0.01）。見表2。

Tab.2 Comparison of p53,p21,BAX and PCNA mRNA levels of BxPC-3 cells between the three groups表2 各組BxPC-3細(xì)胞p53、p21、BAX、PCNA mRNA表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of p53,p21,BAX and PCNA mRNA levels of BxPC-3 cells between the three groups表2 各組BxPC-3細(xì)胞p53、p21、BAX、PCNA mRNA表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Tau 40 mmol/L組比較，P＜0.05。

組別對照組Tau 40 mmol/L組Tau 80 mmol/L組F p53 1.00±0.00 3.26±0.49a 10.70±0.51ab 460.900＊＊p21 1.00±0.00 2.71±0.64a 9.05±0.26ab 342.500＊＊組別對照組Tau 40 mmol/L組Tau 80 mmol/L組F BAX 1.00±0.00 2.12±0.28a 3.14±0.28ab 67.110＊＊PCNA 1.00±0.00 0.69±0.08a 0.49±0.08ab 45.080＊＊

Tau作用于PANC-1細(xì)胞時，Tau 80 mmol/L組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53、p21 mRNA 的表達(dá)水平較對照組明顯升高；Tau 40 mmol/L 組和Tau 80 mmol/L 組Bcl-2、PCNA、CyclinA2、CyclinB1、CyclinE、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA的表達(dá)水平較對照組均明顯下降，見表3。

Tab.3 Comparison of mRNA levels of p53,p21 and other genes of PANC-1 cells between the three groups表3 各組PANC-1細(xì)胞p53、p21等基因mRNA表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of mRNA levels of p53,p21 and other genes of PANC-1 cells between the three groups表3 各組PANC-1細(xì)胞p53、p21等基因mRNA表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Tau 40 mmol/L組比較，P＜0.05。

組別對照組Tau 40 mmol/L組Tau 80 mmol/L組F p53 1.00±0.00 1.31±0.09 1.80±0.25ab 20.640＊＊p21 1.00±0.00 1.22±0.10 1.54±0.17ab 17.070＊＊Bcl-2 1.00±0.00 0.08±0.02a 0.15±0.08a 352.200＊＊PCNA 1.00±0.00 0.23±0.09a 0.27±0.01a 221.200＊＊CyclinA2 1.00±0.00 0.11±0.02a 0.07±0.02a 2 296.000＊＊CyclinB1 1.00±0.00 0.23±0.12a 0.06±0.02a 150.400＊＊組別對照組Tau 40 mmol/L組Tau 80 mmol/L組F CyclinE 1.00±0.00 0.16±0.05a 0.16±0.05a 413.200＊＊CDK1 1.00±0.00 0.06±0.01a 0.03±0.01ab 8 613.00＊＊CDK2 1.00±0.00 0.11±0.07a 0.08±0.07a 337.800＊＊CDK4 1.00±0.00 0.10±0.02a 0.13±0.08a 338.900＊＊CDK6 1.00±0.00 0.33±0.10a 0.27±0.04a 121.700＊＊

2.5 Tau對BxPC-3和PANC-1細(xì)胞P53、P21蛋白表達(dá)水平的影響

采用不同濃度的Tau處理BxPC-3和PANC-1細(xì)胞后，與對照組相比，P21、P53 的蛋白表達(dá)升高，見圖7。

Fig.7 Effects of Taurine on P21 and P53 proteins in BxPC-3 and PANC-1 cells圖7 Tau對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3和PANC-1細(xì)胞中P21、P53蛋白的影響

3 討論

3.1 Tau的抗癌機(jī)制尚未明確

近年來，隨著化學(xué)治療、免疫治療以及新型分子靶向治療的應(yīng)用進(jìn)展，出現(xiàn)了吉西他濱、厄洛替尼、酪氨酸激酶抑制劑和磷酸肌醇3-激酶抑制劑等多種抗胰腺癌藥物［12-13］，但中晚期胰腺癌患者的臨床預(yù)后效果仍然不理想，因此尋找新型的抗胰腺癌藥物依舊是研究熱點(diǎn)。

Tau 既是人體內(nèi)必不可少的營養(yǎng)元素，同時也是具有廣泛藥效的中藥活性成分。近年有研究認(rèn)為Tau 可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬及對化療藥物的減毒增效作用來發(fā)揮抗腫瘤活性［14-15］，但具體機(jī)制尚未明確。

3.2 P53/P21通過干擾細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞凋亡并發(fā)揮其抗腫瘤活性

p53 作為與人類腫瘤關(guān)系密切的基因之一，主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗腫瘤活性作用的［16］。一旦細(xì)胞周期發(fā)生分裂阻滯，被活化的P53 可以通過提高P21 的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的抑制；P21 是周期蛋白依賴性激酶（CDKs）抑制劑，可以干擾細(xì)胞周期蛋白的活性從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制S—G1期［17］。

3.3 Tau通過影響P53/P21通路抑制胰腺癌

谷倬宇等［18］研究顯示姜黃素可能通過上調(diào)P53等蛋白水平的表達(dá)起到抗胰腺癌的作用。潘海強(qiáng)等［19］研究發(fā)現(xiàn)辣椒素可能通過上調(diào)P53 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活Caspase-3，從而促進(jìn)SW1990細(xì)胞發(fā)生凋亡。與他們的研究一致，Tau 可以顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Tau 處理后的胰腺癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡基因p53、p21顯著上升，而細(xì)胞周期蛋白CyclinA2、CyclinB1 等基因表達(dá)明顯下調(diào)。由此推測Tau 可能是通過作用于P53/P21 通路引發(fā)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯，發(fā)揮其抗腫瘤活性。

本次實(shí)驗(yàn)初步闡明了Tau抗胰腺癌活性的作用機(jī)制，認(rèn)為其具有作為抗胰腺癌藥物的潛力，為抗胰腺癌藥物的研究提供了新的思路和方向。同時，Tau抑制胰腺癌細(xì)胞的活力以及細(xì)胞周期調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，需要進(jìn)一步開展更為廣泛的相關(guān)蛋白及信號通路的研究。