盧金東，王波，厲廣輝，周長生，尹俊玉，王興軍，趙術(shù)珍

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室，山東濟(jì)南 250100；2. 濰坊工程職業(yè)學(xué)院，山東青州 262500；3. 山東巨鑫源農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東曹縣 274400；4. 北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100081)

蘆筍(Asparagus officinalisL.)屬于百合科天門冬屬植物，也稱石刁柏，是一種宿根性的多年生草本植物，屬于典型的雌雄異株植物[1]。 蘆筍富含蛋白質(zhì)、維生素、多糖、黃酮類、皂苷等多種活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等功效，是一種食藥兼用型蔬菜，被譽(yù)為“蔬菜之王”。 據(jù)FAOSTAT(Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database)統(tǒng)計，2014—2020 年我國及全球蘆筍種植面積及產(chǎn)量均呈逐年增長態(tài)勢，2020 年我國蘆筍種植面積為9 萬公頃，約占世界種植面積的35%，是蘆筍生產(chǎn)第一大國[2]。蘆筍種子大部分依賴進(jìn)口，由于價格高，利潤空間大，國內(nèi)市場上假種子屢禁不止，導(dǎo)致我國蘆筍與美國、西班牙等國家的相比，單產(chǎn)低、質(zhì)量差，國際市場競爭力較弱[3]。 因此，加快國內(nèi)優(yōu)異品種培育是提高蘆筍國際市場競爭力的關(guān)鍵所在。 蘆筍生產(chǎn)用種為F1雜種，但因蘆筍為雌雄異株植物，無法通過自交保持和繁育優(yōu)良品系，其雌雄親本的繁殖只能通過營養(yǎng)繁殖，因此，親本材料的組培快繁就成為蘆筍雜交育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 建立高效的離體繁殖技術(shù)，既可有效保持優(yōu)良品種的種性，防止品種在繁育過程中混雜退化，又可實現(xiàn)優(yōu)異雜交親本的工廠化育苗，加快蘆筍良種生產(chǎn)，實現(xiàn)蘆筍品種國產(chǎn)化，對推動我國蘆筍產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

關(guān)于蘆筍再生體系的研究已有不少報道，多是通過兩種途徑獲得再生植株，一是以莖尖[4，5]、種子[6]、嫩莖[7]等為外植體，先形成愈傷組織，再誘導(dǎo)胚狀體或不定芽，最終獲得再生植株；二是不經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)過程，利用嫩莖[8－10]、莖段[11]、莖尖[12－14]等材料，直接使頂芽或腋芽增殖形成叢生芽，然后生根獲得再生植株。 但經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)的再生途徑存在體細(xì)胞變異現(xiàn)象，不是優(yōu)良材料或親本繁殖的最佳途徑；而不經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)的途徑也需先進(jìn)行芽誘導(dǎo)、芽增殖和生根等多步培養(yǎng)，比較繁瑣。 基于此，本研究通過外植體及其消毒方法、生根培養(yǎng)基中激素組合的篩選試驗，建立了由蘆筍腋芽一步誘導(dǎo)再生植株的離體培養(yǎng)體系，能夠簡便、快速、高效地實現(xiàn)蘆筍無性繁殖，為其工廠化育苗提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蘆筍材料為全雄種質(zhì)Y14。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體及滅菌方法篩選 從田間取回幼莖，先用自來水流水沖洗5 min，然后用中性洗滌液逐條清洗，注意不要損傷頂芽和側(cè)芽，再用自來水流水沖洗15 min；截取3 ～5 cm 筍尖和5 ～10 mm 腋芽分別進(jìn)行消毒處理，先用75%乙醇浸泡30 s，然后按表1 設(shè)計在160 r/min 搖床上不斷搖動消毒；取出外植體用無菌水沖洗5 次，每次3 min，用無菌濾紙吸干多余水分，接種于不同的生根培養(yǎng)基中，每種消毒方法接種10 瓶，每瓶接種4 個外植體，然后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為27℃、每天光照14 h、光照強(qiáng)度3 000 lx。 培養(yǎng)10天后，統(tǒng)計不同處理的污染率，以確定適宜的滅菌方法。 外植體污染率(%)＝污染外植體個數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。

1.2.2 生根培養(yǎng)基篩選 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2MS＋2%蔗糖＋0.65%瓊脂，pH5.6 ～5.8，選用NAA、KT、IBA、PP333和嘧啶醇，設(shè)計5 種激素組合處理，配制5 種生根培養(yǎng)基，具體見表2。 將消毒后的腋芽接種于各生根培養(yǎng)基上，在27℃、每天光照14 h、光照強(qiáng)度3 000 lx 下進(jìn)行生根培養(yǎng)，70 天后統(tǒng)計根生長情況。

表2 不同生根培養(yǎng)基激素處理組合

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2003 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(one－way ANOVA)，用最小顯著差異法(LSD 法)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體及其適宜滅菌處理的確定

外植體消毒是組織培養(yǎng)的一個非常重要環(huán)節(jié)，有效消毒方法的建立是保證組織培養(yǎng)成功的第一步。 考慮到外植體對污染率的影響，本試驗分別選用5～10 mm 腋芽(圖1A)和3～5 cm 筍尖(圖1B)兩種外植體，用不同滅菌劑進(jìn)行消毒。 結(jié)果(表3)顯示，相同外植體和滅菌劑處理下，外植體污染率隨著滅菌時間的延長而下降，處理20 min 時最低，均在10.0%及以下；在相同滅菌劑處理下，以蘆筍腋芽為外植體的污染率明顯低于以筍尖為外植體的，降幅在5.0 ～10.0 個百分點，污染率為5.0%～15.0%；兩種滅菌劑間比較，相同外植體、處理相同時間條件下，0.1%升汞處理的污染率更低，可降低2.5～5.0 個百分點。 此外，在試驗中還觀察到，筍尖鱗片(變態(tài)葉)包裹的緊實程度也是影響污染率的重要因素，包裹越緊實，污染率越低。 綜合上述分析，確定本試驗的最佳滅菌體系為:選取鱗片包裹緊實的筍尖，自來水流水沖洗5 min 后用中性洗滌液逐條清洗，再用自來水流水沖洗15 min，剝?nèi)[片，取腋芽用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗2 次，然后用0.1%升汞浸泡20 min，期間置于160 r/min 搖床上搖動，然后取出用無菌水沖洗5 次，每次3 min。

圖1 外植體材料的選取部位

表3 不同滅菌劑對不同蘆筍外植體的消毒效果比較

2.2 適宜生根的激素組合篩選

將消毒好的腋芽分別轉(zhuǎn)接到含有不同激素的生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 天開始生根，培養(yǎng)至70 天時對生根率及生根類型進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計。 結(jié)果(圖2、表4)發(fā)現(xiàn)，再生根可明顯分為3 種類型，分別為從腋芽基部直接生出的粗壯肉質(zhì)根(Ⅰ型)、從腋芽基部的愈傷組織上產(chǎn)生的不定根(Ⅱ型)以及從腋芽基部直接生出的細(xì)長根(Ⅲ型)。 3 種根型在不同生根培養(yǎng)基上的發(fā)生比例不同，在RM5培養(yǎng)基上產(chǎn)生的根質(zhì)量較好，主要是Ⅰ型根，有少量Ⅱ、Ⅲ型根，生根率最高，達(dá)92.00%；在RM1 和RM4 上產(chǎn)生的主要是Ⅰ型和Ⅲ型根，有少量Ⅱ型根，生根率也較高，分別為87.50%和80.67%，與RM5 差異不顯著；在RM2 培養(yǎng)基上，生根率顯著降低，為68.43%，產(chǎn)生的根主要是Ⅲ型和Ⅱ型，僅有少量Ⅰ型根；在RM3 培養(yǎng)基上，雖然形成的根也主要是Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅲ型很少，但生根率很低，僅為38.89%，顯著低于其它處理。 可見，NAA 濃度為0.05 mg/L 時更有利于蘆筍腋芽生根，且根的質(zhì)量更好；相比于0.02 mg/L，KT 濃度為0.1 mg/L 時更有利于生根；嘧啶醇的生根效果優(yōu)于PP333。 綜合上述分析，確定適宜的生根培養(yǎng)基為RM5，即1/2MS＋0.05 mg/L NAA＋0.1 mg/L KT＋1.0 mg/L 嘧啶醇＋1.0 mg/L IBA＋2%蔗糖＋0.65%瓊脂，在此條件下可產(chǎn)生較多粗壯的Ⅰ型根，而具有Ⅰ型根的植株在培養(yǎng)45 天后，芽開始迅速伸長生長，培養(yǎng)至60 天左右芽長可達(dá)3～5 cm。

圖2 蘆筍組培過程中3 種生根類型

表4 不同激素組合對蘆筍生根的影響

2.3 蘆筍再生植株的煉苗及移栽

生根培養(yǎng)70 天左右，將培養(yǎng)瓶蓋打開并半覆蓋在瓶口，置于培養(yǎng)室弱光條件下放置2 天，然后將生根苗從瓶中取出，用自來水小心沖洗掉蘆筍根上的培養(yǎng)基后，移至盛有潮濕營養(yǎng)土的塑料盆中，在27℃、每天光照14 h、光照強(qiáng)度3 000 lx 條件下繼續(xù)培養(yǎng)；移栽第1 周是再生植株能否成活的關(guān)鍵期，需要確保較高的土壤濕度和空氣濕度，因此用保鮮膜覆蓋以保持濕度；進(jìn)入第2 周，可將保鮮膜部分掀起，進(jìn)行適度透氣；隨著培養(yǎng)時間的延長，根據(jù)小苗的生長狀態(tài)，透氣程度逐步提高，直到完全去掉保鮮膜；待植株長出3 ～4 個分枝時即可移植到大田，此時的苗已經(jīng)長出很好的根系(圖3)，移栽成活率可達(dá)98%以上。 幼苗在大田中生長旺盛，1 個月左右即可長成健康植株。

圖3 可移植到大田的幼苗地上部分(A)及根系(B)生長情況

3 討論與結(jié)論

在組織培養(yǎng)中，蘆筍試管苗誘導(dǎo)生根時會產(chǎn)生不同類型的根，Ⅰ型根是從莖上發(fā)生的，與莖部維管束相通，較粗壯，具有這類根的再生苗移栽成活率在98%以上；Ⅱ型根是從愈傷組織上發(fā)生的不定根，這些根與莖部的維管束沒有直接連接，只具有這類根的再生苗，移栽后很難成活；Ⅲ型根也是從莖基部發(fā)生的，但較細(xì)弱，只具有這類根的再生苗，移栽也不容易成活[15]。 在蘆筍的組織培養(yǎng)過程中，芽增殖和伸長較容易，但生根困難，這一直是蘆筍組織培養(yǎng)的瓶頸。 這不僅表現(xiàn)在有些品種難以生根或生根率低，也表現(xiàn)在生根中Ⅱ型和Ⅲ型根較多[16－20]。

嘧啶醇能夠抑制赤霉素合成關(guān)鍵酶如古巴焦磷酸合成酶、內(nèi)根－貝殼杉稀合酶等的活性，降低植物體內(nèi)的赤霉素水平。 嘧啶醇對蘆筍生根有明顯的促進(jìn)作用，可能是其通過減少蘆筍體內(nèi)的赤霉素含量而促進(jìn)了根的形成[21，22]。 但是嘧啶醇價格昂貴，因此本試驗中嘗試使用PP333代替嘧啶醇，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)仍以嘧啶醇的效果更好，這與高建明等[4]的研究結(jié)果不同，可能與組培材料的基因型不同有關(guān)。

外植體選擇是影響植物組織培養(yǎng)成敗的重要環(huán)節(jié)之一。 蘆筍筍尖部分由鱗片包裹著腋芽緊密排列而成，單個3～5 cm 的筍尖就可以獲得15～20個5～10 mm 的腋芽，取材方便，材料充足，這為組織培養(yǎng)提供了便利條件。 由于腋芽容易誘導(dǎo)產(chǎn)生芽叢，本研究不進(jìn)行芽增殖和伸長的單獨(dú)培養(yǎng)，而是探索了直接從腋芽到再生植株的一步培養(yǎng)條件，結(jié)果表明，將腋芽轉(zhuǎn)接在1/2MS＋0.05 mg/L NAA＋0.1 mg/L KT＋1.0 mg/L 嘧啶醇＋1.0 mg/L IBA＋2%蔗糖＋0.65%瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，30 天左右就可以生根，但此時芽生長緩慢，培養(yǎng)45 天左右根長可達(dá)1 cm 左右；培養(yǎng)至60 天左右時，具Ⅰ型根的植株根長可迅速伸長至3 ～5 cm；培養(yǎng)70 天后即可將生長健壯的生根苗進(jìn)行煉苗移栽，再生周期與通過愈傷組織誘導(dǎo)再生的相比大幅縮短。

本研究以Y14 蘆筍為材料，建立了以腋芽為外植體直接誘導(dǎo)生根成苗的蘆筍組培快繁體系，該體系步驟簡單，獲得再生苗所用時間短，生根質(zhì)量高，大大提高了快繁育苗的效率，對蘆筍優(yōu)異親本材料的繁殖和新品種培育都具有重要意義。