張留雙，謝 徽，2，楊金清，韓佳祺，保志娟

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；2.紅云紅河集團(tuán) 紅河卷煙廠，云南 彌勒 652399）

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展、礦產(chǎn)開(kāi)發(fā)利用和化肥等不合理使用，土壤中的重金屬含量增加。2014 年《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示我國(guó)耕地污染點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)19.4%，鉛點(diǎn)位超標(biāo)率1.5%。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的40 多種土壤重金屬元素中，鉛（Lead，Pb）在環(huán)境中具有持久性且易被植物吸收，被認(rèn)為是一種重要的重金屬污染物[1-2]。云南省是典型的重金屬地質(zhì)高背景區(qū)，鉛的儲(chǔ)量和開(kāi)發(fā)度居全國(guó)前列[3]，煙草栽培不可避免地面臨鉛脅迫問(wèn)題。鉛脅迫會(huì)破壞植物的氧化還原平衡，使植株氮素合成及分解受到抑制，光合能力下降，嚴(yán)重時(shí)干擾其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，甚至造成植株死亡[4-6]。茶多酚（Tea polyphenols，TP），又叫茶單寧或茶鞣質(zhì)，是從茶葉中提取的一類(lèi)多羥基酚類(lèi)衍生物的混合物，具有良好的抗氧化、調(diào)節(jié)植物光合以及絡(luò)合重金屬的能力[7-8]。研究表明，茶多酚能增強(qiáng)干旱脅迫下黃瓜幼苗中谷氨酰胺合成酶、硝酸還原酶等代謝酶的活性，提高可溶性糖和蛋白質(zhì)的含量，對(duì)切花月季的瓶插壽命及月季體內(nèi)抗氧化酶活性也有不同影響[9-10]。楊穎麗等[11]和司廉邦等[12]發(fā)現(xiàn)，茶多酚能有效緩解鹽脅迫對(duì)小麥幼苗的損傷，提高麥苗光合能力。茶多酚還可以減少鉛脅迫下茶樹(shù)的鉛積累量，修復(fù)鉻脅迫造成的玉米細(xì)胞損傷，有效緩解葡萄遭受酸鋁毒害等[13-15]。近年來(lái)大量研究證實(shí)，外源茶多酚在調(diào)節(jié)植物抵御逆境脅迫方面起著積極作用，但茶多酚緩解煙草Pb 脅迫的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用盆栽試驗(yàn)方法，研究外源茶多酚對(duì)鉛脅迫下煙葉抗氧化、氮代謝關(guān)鍵指標(biāo)及煙株生物量和根莖葉中鉛積累的影響，旨在探討茶多酚的農(nóng)業(yè)應(yīng)用，為解決農(nóng)業(yè)實(shí)踐中的重金屬鉛脅迫問(wèn)題提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為K326。供試土壤采自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院試驗(yàn)大棚周邊土地的紅壤，其pH值5.84，有機(jī)質(zhì)含量18.25 g/kg，全氮含量0.26 g/kg，全磷含量0.18 g/kg，全鉀含量54.31 g/kg，堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為7.23、4.22、97.34 mg/kg，鉛含量為21.62 mg/kg，明顯低于GB 15618—2018《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的土 壤Pb 污 染 風(fēng) 險(xiǎn) 篩 選 值[100 mg/kg（5.5＜pH 值≤6.5）]?；ㄅ枰?guī)格32 cm×19 cm×23 cm（上口直徑×下底直徑×高）。茶多酚用70%乙醇作為溶劑從云南產(chǎn)普洱茶的茶渣中提取，參照GB/T 8318—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》測(cè)得茶多酚的含量。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020 年5—10 月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院試驗(yàn)大棚進(jìn)行，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定對(duì)煙株產(chǎn)生中度脅迫的土壤Pb 添加量為750 mg/kg。試驗(yàn)共設(shè)置5 個(gè) 處 理：CK（正 常 條 件）、Pb（單 一Pb 處 理）、300TP+（Pb+300 mg/kg TP）、600TP+（Pb+600 mg/kg TP）、900TP+（Pb+900 mg/kg TP）。每個(gè)處理重復(fù)5盆。

煙苗采用漂浮育苗方式培育，成苗后移栽入花盆（盆底均置托碟）。每盆裝風(fēng)干土10 kg，植煙1株。移栽時(shí)一次性施用煙草專(zhuān)用復(fù)合肥[m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=12∶12∶24] 45 g。于移栽后14 d施入中性醋酸鉛（配制成水溶液），次日，根據(jù)不同試驗(yàn)處理設(shè)置澆施茶多酚水溶液，后期進(jìn)行常規(guī)管理。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

移栽后60 d，用打孔器取6～9 葉位（從下往上數(shù)）鮮煙葉于液氮中保存，用于抗氧化和氮代謝相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。移栽后80 d，將煙株按根、莖、葉分部位收獲并測(cè)生物量，后依次用自來(lái)水、0.01 mol/L EDTA 溶液和去離子水清洗，于烘箱中105 ℃殺青30 min，60 ℃烘干，粉碎，過(guò)孔徑0.425 mm 篩，用于煙株各部位鉛含量的測(cè)定；同時(shí)，收集盆栽土壤風(fēng)干過(guò)篩，用于土壤中鉛含量的測(cè)定。

超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫（H2O2）含量測(cè)定參考王學(xué)奎等[16]的方法，硝酸還原酶（NR）活性測(cè)定參照鄒奇[17]的方法，活性氧（ROS）和亞硝酸還原酶（NiR）活性采用蘇州格瑞思生物科技公司的試劑盒測(cè)定，硝態(tài)氮（NO3--N）含量測(cè)定采用水楊酸法[18]，可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。煙株鉛含量測(cè)定參照《煙草及煙草制品鉻、鎳、砷、硒、鎘、鉛的測(cè)定電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（YC/T 380—2010）。

煙株P(guān)b積累量=煙株生物量×煙株P(guān)b含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和Origin 2018作圖，用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對(duì)Pb脅迫下烤煙生物量的影響

由表1 可知，單一Pb 處理的煙株各部位生物量均顯著低于CK，根、莖、葉及全株的生物量分別比CK減少21.2%、13.3%、36.2%、25.1%；添加茶多酚后煙株的根、莖、葉及全株生物量均比單一Pb 處理增高，以添加900 mg/kg 茶多酚處理增幅最大，根、莖、葉、全株的生物量分別比單一Pb 處理增加11.8%、6.8%、33.0%、17.5%。

表1 茶多酚對(duì)Pb脅迫下烤煙生物量的影響Tab.1 Effects of tea polyphenols on biomass of flue-cured tobacco under Pb stress

2.2 茶多酚對(duì)Pb脅迫下煙葉抗氧化系統(tǒng)的影響

2.2.1 抗氧化酶活性 由圖1 可看出，單一Pb 處理的煙葉SOD、POD 活性均高于CK，分別高5.6%、30.3%；而CAT 活性下降5.2%。隨茶多酚用量增加，煙葉SOD、POD 活性總體降低，而CAT 活性呈上升趨勢(shì)。300、600、900 mg/kg 茶多酚處理的煙葉SOD 和POD 活性分別比單一Pb 處理降低2.6%、5.2%、3.5%和3.2%、17.1%、48.6%，CAT 活性升高13.6%、15.3%、20.8%。

圖1 茶多酚對(duì)Pb脅迫下煙葉SOD、POD、CAT活性的影響Fig.1 Effects of tea polyphenols on activities of SOD，POD and CAT in tobacco leaves under Pb stress

2.2.2 MDA、ROS、H2O2含量 由圖2 可看出，單一Pb 處理的煙葉MDA、ROS、H2O2含量均高于CK，分別增加了21.0%、7.4%、16.5%。添加茶多酚后，煙葉MDA 含量隨茶多酚用量增加呈逐漸降低趨勢(shì)，300、600、900 mg/kg 茶多酚處理分別比Pb 處理降低了4.9%、5.4%、39.3%；ROS 含量隨茶多酚用量增加而逐漸上升，H2O2含量呈先降后增趨勢(shì)，且添加茶多酚處理ROS 和H2O2含量均顯著低于單一Pb處理。

圖2 茶多酚對(duì)Pb脅迫下煙葉MDA、ROS、H2O2含量的影響Fig.2 Effects of tea polyphenols on contents of MDA，ROS and H2O2 in tobacco leaves under Pb stress

2.3 茶多酚對(duì)Pb脅迫下煙葉氮代謝指標(biāo)的影響

由圖3 看出，單一Pb 處理的煙葉NR 活性顯著低于CK，降低了37.1%，而NO3--N 含 量比CK 顯 著增加24.6%；添加茶多酚后，煙葉NR 活性隨茶多酚用量增加呈先升后降趨勢(shì)，300、600、900 mg/kg茶多酚處理的NR 活性分別比單一Pb 處理升高149.1%、268.6%、110.9%，而NO3--N 含量呈先減后增趨勢(shì)且均低于單一Pb處理。此外，Pb脅迫下NiR活性略有升高但無(wú)顯著變化，施加茶多酚后NiR 活性隨茶多酚用量增加呈先減后增的趨勢(shì)。煙葉可溶性蛋白含量在Pb 脅迫下比CK 顯著升高39.78%，添加茶多酚后有所降低但不顯著。

圖3 茶多酚對(duì)Pb脅迫下煙葉NR、NiR活性和NO3-N、可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of tea polyphenols on activities of NR，NiR and contents of NO3-N and soluble protein in tobacco leaves under Pb stress

2.4 茶多酚對(duì)Pb脅迫下煙株P(guān)b累積的影響

從表2 可知，Pb 脅迫處理使煙株根、莖、葉中Pb含量增至CK的16.9倍、7.6倍、3.7倍，各部位及全株的Pb 積累量亦均顯著高于CK。添加茶多酚后，煙株根部Pb 含量顯著降低，尤其是300 mg/kg 茶多酚處理根部Pb含量比單一Pb處理顯著降低83.9%；莖中Pb含量隨茶多酚用量增加呈先減后增趨勢(shì)；葉中Pb 含量隨茶多酚用量增加而逐漸降低。300、600、900 mg/kg 茶多酚處理的烤煙全株P(guān)b 積累量均低于Pb 處理，分別降低65.8%、10.6%、8.6%。整體來(lái)看，烤煙對(duì)Pb 的吸收積累部位主要是根，其次是葉，最后是莖，但900 mg/kg 茶多酚處理時(shí)，Pb 在煙株中的含量和積累量表現(xiàn)為根＞莖＞葉。

表2 茶多酚對(duì)煙株P(guān)b積累的影響Tab.2 Effects of tea polyphenols on Pb accumulation in tobacco

3 結(jié)論與討論

3.1 茶多酚對(duì)Pb脅迫下煙葉抗氧化及氮代謝的影響

本試驗(yàn)中，在重金屬Pb 處理下，煙葉膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 和H2O2大量積累，ROS 含量上升，抗氧化酶SOD、POD活性增強(qiáng)，這與張浩等[19]研究的烤煙Pb 脅迫下抗氧化系統(tǒng)的變化規(guī)律一致。表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Pb 處理對(duì)煙葉造成了較嚴(yán)重的膜脂過(guò)氧化損傷，而CAT活性下降可能是由于其需與POD 共同作為第二線防御系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)以維持煙葉代謝平衡所致[20-21]。添加茶多酚后，煙葉脂質(zhì)過(guò)氧化物均有不同程度降低，SOD、POD 活性降低而CAT 活性隨茶多酚用量增加而逐漸增高，可能是茶多酚利用其強(qiáng)還原性清除植物體內(nèi)氧自由基，導(dǎo)致SOD 活性降低，同時(shí)誘導(dǎo)CAT 清除過(guò)量的H2O2，降低POD活性；但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

通常情況下，土壤中的氮被植物吸收后，硝態(tài)氮在硝酸還原酶作用下轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮，再經(jīng)亞硝酸還原酶作用轉(zhuǎn)化為羥胺，后經(jīng)各種轉(zhuǎn)氨酶作用生成不同種類(lèi)氨基酸進(jìn)而合成蛋白質(zhì)[22]。本試驗(yàn)中，Pb處理下的煙葉NR活性顯著降低而NO3-N含量顯著增加，NiR 活性升高，表明Pb 脅迫一定程度上抑制了煙葉硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了亞硝態(tài)氮分解，這與李裕紅等[23]、張艷英等[24]的研究結(jié)果類(lèi)似。本試驗(yàn)亦表明，Pb 脅迫下煙葉可溶性蛋白含量會(huì)增加，可能是由于可溶性蛋白作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)使細(xì)胞保持適當(dāng)?shù)臐B透勢(shì)而防止脫水[25]，同時(shí)對(duì)生物分子的結(jié)構(gòu)和功能起到穩(wěn)定和保護(hù)作用[26]；此外，值得注意的是，煙葉可溶性蛋白含量過(guò)高在燃吸時(shí)會(huì)引起辛辣、嗆刺等[27]，因此推測(cè)Pb 處理下煙葉可溶性蛋白含量增加可能是影響煙葉品質(zhì)的不利因素。澆施茶多酚后，提升NR 活性促進(jìn)NO3-N 轉(zhuǎn)化，說(shuō)明茶多酚在一定程度上促進(jìn)了氮代謝；而可溶性蛋白含量呈不同程度降低，說(shuō)明茶多酚減弱了Pb對(duì)煙葉的滲透脅迫。

3.2 茶多酚對(duì)Pb脅迫下煙株生物量和Pb積累的影響

Pb 脅迫下，烤煙生長(zhǎng)受到抑制，煙株生物量降低。而添加茶多酚后，煙株根部、葉部及全株生物量均高于Pb 處理，這說(shuō)明茶多酚緩解了Pb 脅迫對(duì)煙草生長(zhǎng)的抑制。

通常煙草根部對(duì)Pb有較強(qiáng)的吸收和富集能力，是葉部和莖部的2～5 倍，而葉的吸收富集能力一般大于莖[28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，各部位Pb 積累均為根＞葉＞莖，與前人的研究基本一致。但當(dāng)茶多酚添加量達(dá)900 mg/kg 時(shí)，煙莖中積累的Pb 含量卻高于葉。本試驗(yàn)中，添加茶多酚后根系Pb含量和積累量均顯著降低，這可能是茶多酚絡(luò)合了土壤中的部分Pb，將其轉(zhuǎn)化為不易被煙草根系吸收的絡(luò)合態(tài)化合物，使根部Pb積累降低。茶多酚也可能同時(shí)調(diào)控了煙株對(duì)Pb 和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，部分Pb 隨營(yíng)養(yǎng)元素一起被轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部，造成個(gè)別處理煙葉、煙莖部位Pb含量的增加。

該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Pb 脅迫濃度對(duì)煙草產(chǎn)生明顯毒害。施加外源茶多酚能使Pb 脅迫下煙株生物量增加，降低煙葉膜脂過(guò)氧化損傷，促進(jìn)煙葉硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)分解，減少煙株體內(nèi)Pb 含量，尤其是根部Pb 積累，進(jìn)而在一定程度上緩解煙草Pb脅迫。