王東連,張 杰,嚴(yán)艷倫,姜治國(guó)
(云南云大科技農(nóng)化有限公司,云南 昆明 650000)
甲哌鎓,ISO通用名稱:mepiquat chloride。其他中文名稱:助壯素、縮節(jié)胺、調(diào)節(jié)啶、甲哌啶、壯棉素、縮節(jié)靈?;瘜W(xué)名稱:N,N-二甲基哌啶鎓氯化物。分子式:C7H16NCl。相對(duì)分子質(zhì)量:149.66 (按2007年相對(duì)原子質(zhì)量計(jì))。具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用。22.5% 28-表蕓·甲哌鎓水劑是由甲哌鎓、28-表高蕓苔素內(nèi)酯復(fù)配而成的棉花株鈴調(diào)控劑。藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,甲哌鎓和28-表高蕓苔素內(nèi)酯復(fù)配后可顯著促進(jìn)根系生長(zhǎng),健株穩(wěn)長(zhǎng)、塑造株型、改善葉片功能和群體結(jié)構(gòu),最終達(dá)到優(yōu)化成鈴結(jié)構(gòu)、增加鈴數(shù)和鈴重的功效,對(duì)棉花增產(chǎn)有顯著的增效作用。本品用于調(diào)控棉花株型、防止蕾鈴脫落、提高產(chǎn)量,對(duì)于解決棉花生產(chǎn)中徒長(zhǎng)和蕾鈴脫落的問(wèn)題有廣闊的應(yīng)用前景。迄今為止,大多數(shù)文獻(xiàn)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)所用的檢驗(yàn)方法大致為離子對(duì)色譜柱與電導(dǎo)檢測(cè)器結(jié)合、離子對(duì)試劑與反相色譜柱和紫外檢測(cè)器結(jié)合、電位滴定與紙層析結(jié)合、液質(zhì)聯(lián)用等?,F(xiàn)有檢測(cè)方法,大部分不能在色譜柱上很好的保留。電位滴定法又測(cè)定步驟多;花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng);靈敏度低,對(duì)制劑產(chǎn)品的準(zhǔn)確性更差。經(jīng)查閱甲哌鎓化學(xué)結(jié)構(gòu)和相關(guān)性質(zhì)后,決定采用近幾年快速發(fā)展的親水色譜技術(shù)與VWD或DAD檢測(cè)器結(jié)合的方式進(jìn)行分離檢測(cè)。該色譜技術(shù)即使是強(qiáng)極性的化合物也能通過(guò)HILIC使用與反相HPLC相同的系統(tǒng)和溶劑實(shí)現(xiàn)分離,大大降低了極性分析的成本和工作量。
1.1 試劑和溶液 甲哌鎓標(biāo)準(zhǔn)品:質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%;22.5% 28-表蕓·甲哌鎓水劑:是由甲哌鎓、28-表高蕓苔素內(nèi)酯復(fù)配而成。乙腈:色譜純,飛世爾;乙酸銨:色譜純;試驗(yàn)用水:去離子水。
1.2 儀器 高效液相色譜儀(帶DAD檢測(cè)器):安捷倫1260 II;色譜柱:默克ZIC?-HILIC,2.1×100 mm,3.5 μm;電子分析天平:梅特勒AB204-E;超聲波清洗機(jī):新芝SB25-12DTD。
1.3 高效液相色譜操作條件 流動(dòng)相:80%的乙腈+20%的25 mmol/L乙酸銨水溶液;流速:0.2 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;進(jìn)樣體積:2 μL;保留時(shí)間:約為4.18 min左右。
1.4 測(cè)定步驟
1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取甲哌鎓標(biāo)準(zhǔn)樣品0.10 g(精確到0.000 2 g),用80%的乙腈+20%的25 mmol/L乙酸銨水溶液溶解,并定容至25 mL容量瓶中。搖勻,超聲波脫氣15 min,過(guò)0.22 μm的尼龍膜至1.5 mL進(jìn)樣瓶中,備用。
1.4.2 原藥及制劑樣品溶液的配制
1.4.2.1 原藥測(cè)定溶液的配制 準(zhǔn)確稱取甲哌鎓原藥0.10 g(精確到0.000 2 g),用80%的乙腈+20%的25 mmol/L乙酸銨水溶液溶解,并稀釋至25 mL容量瓶中,搖勻,超聲波脫氣15 min,過(guò)0.22 μm的尼龍膜至1.5 mL進(jìn)樣瓶中,備用。
1.4.2.2 水劑測(cè)定溶液的配制 用已測(cè)定甲哌鎓原藥按照工藝配方制成一個(gè)待測(cè)樣品,同時(shí)制備一個(gè)制劑空白。然后,準(zhǔn)確稱取含0.10 g甲哌鎓的水劑樣品(精確至0.000 2 g)于25 mL容量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,超聲波脫氣,過(guò)濾備用。
1.4.3 測(cè)定 在上述色譜條件下,待儀器穩(wěn)定后,先注入數(shù)針標(biāo)樣溶液,計(jì)算各針?lè)迕娣e,直至相鄰2針標(biāo)樣溶液峰面積變化<1.5%后,按照標(biāo)樣、試樣、試樣、標(biāo)樣的順序進(jìn)樣測(cè)定。
1.4.4 計(jì)算 將測(cè)得的2兩針試樣溶液以及試樣前后2針溶液中甲哌鎓的峰面積,分別進(jìn)行平均。甲哌鎓的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X1(%)按公式(1)進(jìn)行計(jì)算:
(1)
式中:
m1——標(biāo)準(zhǔn)品甲哌鎓的質(zhì)量,g;
m2——試樣的質(zhì)量,g;
P1——標(biāo)準(zhǔn)品甲哌鎓的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%。
2.1 色譜條件的選擇 甲哌鎓屬于強(qiáng)極性化合物,在液相分離中使用反相柱或者陽(yáng)離子柱,保留時(shí)間較短且易受到溶劑峰的干擾,很難達(dá)到分析定量的目的。其吸收最佳波長(zhǎng)195 nm[1],但195~220 nm處吸收較強(qiáng)。用安捷倫親水色譜柱發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)增大靈敏度降低,柱壓變化較大,柱子耐用性明顯下降。且未得到高靈敏度,檢測(cè)波長(zhǎng)選擇較低。后經(jīng)過(guò)調(diào)研,發(fā)現(xiàn)默克ZIC?-HILIC柱帶有PEEK內(nèi)襯[2],能很好的降低極性化合物在柱子上的殘留。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn),甲哌鎓在默克ZIC?-HILIC柱上不僅靈敏度高,而且在210 nm波長(zhǎng)處也有很好的響應(yīng)及線性,同時(shí)也能排除低波長(zhǎng)的溶劑效應(yīng)。所以將波長(zhǎng)選擇為210 nm。親水色譜柱[2],即使是強(qiáng)極性的化合物也能通過(guò)HILIC使用與反相HPLC相同的系統(tǒng)和溶劑實(shí)現(xiàn)分離,大大降低了極性分析的成本和工作量,且提高了分離度。此液相條件下分離,目標(biāo)物不受雜質(zhì)峰干擾。首先,用乙腈-水95+5→60+40做梯度看甲哌鎓在柱子上的保留情況。結(jié)果顯示保留較好。再次,用乙腈-水90+10和80+20兩個(gè)等度對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行洗脫看保留時(shí)間。結(jié)果表明,當(dāng)80+20等度洗脫時(shí)能節(jié)約時(shí)間且與干擾峰很好地分離。第三,由于峰的對(duì)稱性較差,所以選擇加入緩沖鹽來(lái)改善峰型。首選甲酸銨與乙酸銨。本實(shí)驗(yàn)直接采用乙酸銨,在25 mmol/L濃度時(shí)能很好的得到保留和分離(圖1)。
圖1 甲哌鎓紫外光譜圖
2.2 分析方法線性相關(guān)性試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣1~5 μL。在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)y,以峰面積為橫坐標(biāo)x,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程為y=0.002x-0.144 6,相關(guān)系數(shù)r=0.998 9[3]。甲哌鎓的線性相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1),線性關(guān)系(圖2)。
表1 線性相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖2 甲哌鎓線性關(guān)系圖
2.3 分析方法的精密度試驗(yàn) 在相同的色譜條件下,從同一產(chǎn)品中準(zhǔn)確稱取5個(gè)試樣,在上述色譜條件下進(jìn)行分析并求平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù),結(jié)果表明:甲哌鎓的標(biāo)準(zhǔn)偏差為:0.209 6,變異系數(shù)為:0.89%(表2)。
表2 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果
2.4 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 試驗(yàn)采用產(chǎn)品空白制劑中添加已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試樣5份,按照1.4進(jìn)行分析,結(jié)果表明:甲哌鎓的平均回收率為:99.8%(表3)。
表3 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果
2.5 非分析物干擾的判定 在評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度時(shí),需要包含非分析物質(zhì)干擾試驗(yàn),因?yàn)橹鷦┲械娜魏胃蓴_物質(zhì)都會(huì)導(dǎo)致分析方法出現(xiàn)偏差,分析時(shí)同時(shí)測(cè)定不帶助劑的原藥和空白樣品,證明其無(wú)干擾,并提交色譜圖。通過(guò)不加助劑的原藥色譜圖和空白樣品色譜圖判定,非分析物對(duì)有效成分不構(gòu)成干擾,相關(guān)非分析物質(zhì)干擾典型圖譜(圖3~7)。
圖3 溶劑空白
圖4 制劑空白
圖5 標(biāo)樣圖譜
圖6 甲哌鎓水劑圖譜
圖7 甲哌鎓原藥圖譜
綜上所述,用本分析方法對(duì)甲哌鎓原藥及22.5% 28-表蕓·甲哌鎓水劑進(jìn)行測(cè)定分析,方法準(zhǔn)確度高,精密度高,分析方法簡(jiǎn)便、快速,適用于甲哌鎓原藥及22.5% 28-表蕓·甲哌鎓水劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制分析。