李彩霞，高歆越，羅建軍

(1.廣東環(huán)境保護工程職業(yè)學(xué)院環(huán)境監(jiān)測學(xué)院，廣東 佛山 528216；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，廣東 廣州 510642)

荔枝(LitchichinensisSonn.)為無患子科(Sapindaceae)荔枝屬(Litchi)常綠喬木，原產(chǎn)我國且具有2000多年的栽培史，栽培面積和產(chǎn)量均為世界之首[1]。在荔枝生產(chǎn)過程中，由荔枝霜疫霉菌侵染引起的荔枝霜疫霉病是荔枝生產(chǎn)上的重要病害之一，嚴(yán)重影響荔枝的產(chǎn)量和品質(zhì)及鮮果貯運[2-3]。由于荔枝品種抗病性差，化學(xué)防治仍是荔枝霜疫霉病最有效的防治手段[4]。

氰霜唑(Cyazofamid，4-氯-2-氰基-N，N-二甲基-5-對甲苯基咪唑-1-磺酰胺)是一種新型苯基咪唑類殺菌劑，已在我國大白菜、番茄、黃瓜、荔枝、馬鈴薯、葡萄、西瓜中登記使用，廣泛用于防治霜霉病、疫霉病、晚疫病和疫病等病害[5]。氰霜唑在作物上會迅速分解，產(chǎn)生代謝物 4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)，而 CCIM 作為氰霜唑在植物體內(nèi)的主要降解產(chǎn)物，較母體氰霜唑更易被吸收，且毒性更高[6- 7]。因此，研究氰霜唑在作物中殘留時，需要考慮其代謝物CCIM。吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)是一種廣譜甲氧基丙烯酸酯類(QoI)殺菌劑，通過抑制線粒體呼吸從而抑制真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，具有廣譜、高效、毒性低、提高對氮的吸收和產(chǎn)量等優(yōu)點[8]。目前已在香蕉、玉米、花生等50多種作物上登記使用，用來防治由子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌綱真菌引起的霜霉病、疫病、銹病、白粉病、瘡痂病、褐斑病等[9]。當(dāng)前，關(guān)于吡唑醚菌酯和氰霜唑在農(nóng)作物中的殘留行為及風(fēng)險評估涉及有小麥、玉米、蘋果、葡萄、枇杷、金銀花、藍(lán)莓、西瓜、香蕉、馬鈴薯、番茄等[10-18]。但是關(guān)于2種農(nóng)藥在荔枝中的殘留消解行為及膳食風(fēng)險還有待于研究。

為此，本研究在廣東廣州、廣東陽江、廣西、云南、海南和福建等6地開展田間試驗，首先建立吡唑醚菌酯、氰霜唑及代謝物CCIM在荔枝全果和果肉上的殘留分析方法，研究目標(biāo)農(nóng)藥的消解動態(tài)規(guī)律及最終殘留量，評估其膳食風(fēng)險，為30%吡唑醚菌酯·氰霜唑懸浮劑在荔枝上的安全使用提供科學(xué)指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters Acquity UPLC I CLASS-AB 4 000液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀；萬分之一電子天平；MX-F旋渦混合器；H1850離心機。

乙腈(色譜純)；氯化鈉(分析純)；吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)；氰霜唑(純度97.39%)；4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2腈(純度98.8%)；PSA吸附劑；超純水。

1.2 田間試驗

1.2.1 小區(qū)設(shè)定 根據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[19]，于2021年在廣東廣州、廣東陽江、廣西、云南、海南和福建6地進行田間試驗。各試驗點共設(shè)2個試驗小區(qū)，包括1個對照區(qū)和1個處理區(qū)，每個小區(qū)至少4棵荔枝樹。

1.2.2 最終殘留和消解試驗 供試藥劑為30%吡唑醚菌酯·氰霜唑懸浮劑，施藥劑量為2 500倍液(制劑量)，發(fā)病前或發(fā)病初期施藥，施藥次數(shù)3次，施藥間隔期為10 d，距最后1次施藥后0、3、7、14和21 d采集樣品；14和21 d樣品同時用于最終殘留量分析。

1.2.3 樣品制備 在不少于4株果樹上采集≥12個果實，≥2 kg。荔枝全果樣品制備：取田間荔枝樣品的一半稱重，去核后再次稱重，將去核后的全果樣品切成碎塊，混勻，四分法分樣，于-18℃冰柜保存。荔枝果肉樣品制備：取田間荔枝殘留樣本的另一半去皮、去核后切碎混勻，四分法分樣，于-18℃冰柜保存。

1.3 分析方法

1.3.1 色譜質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC ?BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；流速為0.3 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：3.0 μL。梯度洗脫條件(表1)。

表1 梯度洗脫條件

表2 主要質(zhì)譜參數(shù)

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化正離子掃描(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；氣簾氣(CUR)：40 psi；霧化氣(GS1)：55 psi；輔助加熱氣(GS2)：60 psi；碰撞氣(CAD)：4 psi；電噴霧電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度(TEM)：550℃。

1.3.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取5.0 g(±0.05 g)荔枝全果和果肉樣品，加入25 mL含1%乙酸-乙腈溶液，渦旋提取5 min，加入2.0 g氯化鈉混合均勻，4 000 r/min離心5 min，得到荔枝果肉和荔枝全果的提取液。荔枝果肉提取液過0.22 μm針式濾膜于進樣瓶中，待測；取1.8 mL荔枝全果提取液加于含有100 mg PSA的2 mL離心管中，渦旋30 s，過0.22 μm針式濾膜于進樣瓶中，待測。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別用荔枝全果和果肉空白基質(zhì)液依次稀釋成0.001、0.002、0.01、0.02、0.1和1.0 mg/L基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以化合物的峰面積響應(yīng)值為比例坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于荔枝全果和果肉的定量。

1.3.4 添加回收試驗 在制備好的荔枝全果和果肉空白樣品中分別添加吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液，使空白樣品中吡唑醚菌酯濃度分別為0.01、0.1和1.0 mg/kg，氰霜唑和CCIM分別為0.01、0.02和0.5 mg/kg，每個水平重復(fù)5次。按照上述分析方法進行分析，計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，用于考察方法的回收率和精密度。

1.4 膳食風(fēng)險評估方法 根據(jù)我國膳食結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，結(jié)合本試驗殘留中值和相關(guān)最大殘留限量，計算吡唑醚菌酯和氰霜唑的國家估算每日攝入量(national estimated daily intake，NEDI)，吡唑醚菌酯和氰霜唑的膳食風(fēng)險用NEDI占每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)的百分比來表示，即風(fēng)險概率(risk probability，%)。計算公式如(1)和(2)。

NEDI= ∑[STMRi(STMR-Pi)×Fi)]

(1)

風(fēng)險概率(%)=NEDI/(ADI×bw)

(2)

STMRi為農(nóng)藥在某農(nóng)產(chǎn)品中的規(guī)范殘留試驗中值，mg/kg；STMR-Pi為加工因子校正的規(guī)范殘留試驗中值；Fi為普通人群某一食品消費量，kg/d；ADI為每kg體重的每日允許攝入量；bw為人均體重，kg，一般按照63 kg計算。當(dāng)風(fēng)險概率>1時，表示會對一般人群健康產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險。當(dāng)風(fēng)險概率≤1 時，表示對一般人群健康產(chǎn)生的風(fēng)險是可接受的。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系與定量限 用荔枝全果和果肉基質(zhì)分別將吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM配制0.001、0.002、0.01、0.02、0.1 mg/L質(zhì)量濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)分別得到吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的線性方程，結(jié)果(表3)。吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在0.001～0.1 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r均>0.997 2。在上述儀器條件下，3種農(nóng)藥在荔枝全果和果肉中的定量限(LOQ)均為0.01 mg/kg。

表3 吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在荔枝全果和果肉中的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.2 添加回收率和精密度 在荔枝全果和果肉中分別添加0.01、0.1、1.0 mg/kg 3個濃度的吡唑醚菌酯和0.01、0.02、0.5 mg/kg 3個濃度的氰霜唑和CCIM，用來測定方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果(表4)。吡唑醚菌酯在荔枝全果的平均回收率為73%～88%，RSD為2.0%～3.4%；在荔枝果肉的平均回收率為92%～101%，RSD為3.6%～4.5%；氰霜唑在荔枝全果的平均回收率為79%～88%，RSD為2.1%～4.7%；在荔枝果肉的平均回收率為87%～103%，RSD為3.9%～10.8%；CCIM在荔枝全果的平均回收率為81%～88%，RSD為2.3%～4.4%；在荔枝果肉的平均回收率為81%～%，RSD為6.3%～12.8%。結(jié)果表明，該方法回收率和精密度較高，可滿足于荔枝中農(nóng)殘分析的要求。

表4 吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM在荔枝中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.3 殘留消解試驗結(jié)果 2021年在廣東、海南和廣西3地進行殘留消解動態(tài)試驗，結(jié)果(表5)。吡唑醚菌酯在3地荔枝(全果)中的殘留消解動態(tài)符合一級動力學(xué)方程式，在廣東、廣西和海南3地的原始沉積量分別為0.32、0.34和0.28 mg/kg，消解半衰期分別為6.9、5.2和8.0 d。氰霜唑在廣東和廣西2地的降解符合一級動力學(xué)方程，原始沉積量分別為0.19和0.15 mg/kg，半衰期分別為5.1和6.7 d；在海南無消解規(guī)律。

表5 吡唑醚菌酯和氰霜唑在荔枝中的消解動態(tài)

2.4 最終殘留試驗結(jié)果 2021年在廣東廣州、廣東陽江、廣西、海南、云南和福建等6地開展了最終殘留試驗。檢測結(jié)果表明，末次施藥后間隔14 d，吡唑醚菌酯、氰霜唑、CCIM在荔枝果肉中的殘留量均為< 0.01 mg/kg，氰霜唑與CCIM之和以氰霜唑表示在荔枝果肉中的殘留量為<0.025 mg/kg；吡唑醚菌酯、氰霜唑、CCIM、氰霜唑與CCIM之和以氰霜唑表示在荔枝全果中的殘留量分別為0.014～0.18 mg/kg、<0.01～0.06 mg/kg、<0.01 mg/kg、<0.025～0.074 mg/kg。末次施藥后間隔21 d，吡唑醚菌酯、氰霜唑、CCIM、氰霜唑與CCIM之和以氰霜唑表示在荔枝全果中的殘留量分別為<0.010～0.041 mg/kg、<0.01～0.01 mg/kg、<0.01～0.013 mg/kg、<0.025～0.03 mg/kg。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763-2021)規(guī)定吡唑醚菌酯和氰霜唑在荔枝中的最大殘留限量分別為0.1 mg/kg和0.02 mg/kg，表明2種農(nóng)藥的最終殘留量未超過最大殘留限量。

2.5 膳食暴露風(fēng)險評估 根據(jù)GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，吡唑醚菌酯的ADI值為0.03 mg/kg，氰霜唑的ADI值為0.2 mg/kg。

根據(jù)本試驗在荔枝上取得的殘留試驗數(shù)據(jù)，結(jié)合我國農(nóng)藥登記情況和我國居民的人均膳食結(jié)構(gòu)，計算普通人群吡唑醚菌酯的國家估算每日攝入量是1.439 3 mg，占日允許攝入量的76.2%；氰霜唑的國家估算每日攝入量是1.4845 mg，占日允許攝入量的11.8%。結(jié)果表明，基于規(guī)范殘留試驗數(shù)據(jù)，吡唑醚菌酯和氰霜唑?qū)σ话闳巳航】挡粫a(chǎn)生不可接受的風(fēng)險。

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC-MS-MS測定荔枝全果和果肉中吡唑醚菌酯、氰霜唑和CCIM的殘留分析方法，并于2021年按照GAP在我國6地荔枝主產(chǎn)區(qū)開展田間試驗，測定了不同采收間隔期的殘留量，根據(jù)所得殘留試驗數(shù)據(jù)進行了膳食風(fēng)險評估。結(jié)果表明，吡唑醚菌酯和氰霜唑在荔枝中的殘留消解動態(tài)符合一級動力學(xué)方程；于PHI (21 d)時采收的荔枝樣品中吡唑醚菌酯和氰霜唑的最終殘留量均低于我國相應(yīng)的MRL值。經(jīng)膳食風(fēng)險評估可知，吡唑醚菌酯和氰霜唑的攝入風(fēng)險概率均<100%，不會對一般人群健康產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險。推薦30%吡唑醚菌酯·氰霜唑懸浮劑防治荔枝霜疫霉病，發(fā)病前或發(fā)病初期施藥，噴霧施藥3次，施藥間隔10 d，施藥用量為2 500～3 000倍液(制劑量)，PHI為21 d。