曾文丹　陸柳英　施平麗　肖亮　尚小紅　曹升　吳正丹　嚴(yán)華兵

關(guān)鍵詞：木薯；同源四倍體；鑒定；種質(zhì)創(chuàng)新

中圖分類(lèi)號(hào)：S31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，是一種富含淀粉的塊根作物，有“淀粉之王”、“地下糧倉(cāng)”等美稱(chēng)。木薯不僅是重要的非主糧生物質(zhì)能源作物，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物，用途廣泛，可食用、飼用和加工成各種工業(yè)產(chǎn)品，如淀粉、酒精等[1-2]。然而，中國(guó)木薯產(chǎn)業(yè)目前存在種植品種單一、單產(chǎn)低、淀粉含量低和比較經(jīng)濟(jì)效益低等突出問(wèn)題[3]，多倍化可伴隨產(chǎn)生一些優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，如抗逆性增強(qiáng)、器官體積變大、生物量增加等，被廣泛應(yīng)用于培育植物新品種[4-6]。如印度三倍體木薯品種Sree Harsha 在株型、塊根產(chǎn)量、淀粉含量、抗性方面均優(yōu)于二倍體親本[7]；在巴西，NASSAR 的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍、遠(yuǎn)緣雜交等技術(shù)，獲得了優(yōu)良的木薯多倍體，如UnB201、UnB310 在長(zhǎng)勢(shì)、塊根產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量等方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)[8-9]。因此，多倍體育種為木薯品種培育提供了一個(gè)重要途徑。

本研究以木薯品種SC12 為對(duì)象，探討不同濃度秋水仙素對(duì)木薯組培苗誘導(dǎo)率的影響，并對(duì)二倍體與同源四倍體組培苗及大田材料進(jìn)行形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和農(nóng)藝性狀比較。以期為提升木薯產(chǎn)量并創(chuàng)制新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SC12 木薯組培苗來(lái)自廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所。

1.2 方法

1.2.1 木薯同源四倍體離體誘導(dǎo) 以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，將木薯組培苗的單芽莖段用0.03～0.20 g/L 的秋水仙素溶液，避光震蕩培養(yǎng)48 h 后，用無(wú)菌水沖洗4 次，轉(zhuǎn)接到MS+0.02 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+20 g/L 蔗糖+6.3 g/L 瓊脂的繼代培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度為18.75～25.00 mol/（m·s），光照時(shí)間16 h/d。45 d 后，統(tǒng)計(jì)各濃度下的莖段成活率。各處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10 瓶，每瓶接種3 株。

1.2.2 倍性鑒定 流式細(xì)胞儀鑒定：通過(guò)形態(tài)學(xué)初步觀察，篩選葉色加深、葉片變寬等具有四倍體形態(tài)學(xué)特性的植株進(jìn)行流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)，檢測(cè)方法參考ZHOU 等[10]的方法。染色體壓片鑒定：檢測(cè)方法參考周慧文[11]的壓片方法，待組培苗根尖長(zhǎng)至1～2 cm 時(shí)，取幼嫩生長(zhǎng)旺盛的根尖，將其浸泡在0.002 mol/L 八羥基喹啉∶0.1%秋水仙素溶液1∶1 的溶液中，進(jìn)行預(yù)處理。隨后用卡諾固定液固定20 h。于高滲溶液（0.075 mol/LKCl）浸泡30 min 后用2.5%纖維素酶與2.5%果膠酶1∶1 混合酶液處理根尖8 h，蒸餾水洗凈后用卡寶品紅染色5 min。用光學(xué)顯微鏡觀察根尖體細(xì)胞染色體數(shù)。

1.2.3 二倍體與同源四倍體離體觀察比較 將鑒定為同源四倍體的木薯組培苗株系（SC12-4、SC12-11）與二倍體對(duì)照接種至MS+0.02 mg/LNAA+20 g/L 蔗糖+6.3 g/L 瓊脂的生根培養(yǎng)基上。30 d 后統(tǒng)計(jì)組培苗的株高、莖粗、葉厚、裂葉長(zhǎng)、裂葉寬、葉綠素SPAD 值等。各處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種15 瓶，每瓶接種6 株。

1.2.4 二倍體與同源四倍體形態(tài)觀察比較 將鑒定為同源四倍體的木薯組培苗株系（SC12-4、SC12-11）與二倍體組培苗移栽大棚煉苗后移栽至大田，觀察不同倍性植株移栽大田60 d（苗期）、120 d（塊根形成期）、180 d（塊根膨大期）、240 d（成熟期）的生長(zhǎng)情況。統(tǒng)計(jì)不同時(shí)期植株的株高、莖粗、葉厚、裂葉長(zhǎng)、裂葉寬、葉綠素SPAD值；成熟期的單株薯種、地上部重、收獲指數(shù)。各處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9 株。收獲指數(shù)=單株薯種/（單株薯種+地上部重）。

1.2.5 二倍體與四倍體解剖學(xué)觀察比較 保衛(wèi)細(xì)胞觀察：選取二倍體與四倍體木薯株系（SC12-4、SC12-11）成熟葉片，將葉片下表皮朝上放置。用鑷子撕取葉片下表皮置于載玻片上，滴一滴0.5%的碘–碘化鉀溶液，染色30～60 s 后覆上蓋玻片。使用光學(xué)顯微鏡Olympus BH-2 型40×物鏡觀察并拍照，測(cè)量保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)、寬，對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)一個(gè)視野內(nèi)保衛(wèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)倍性統(tǒng)計(jì)5 株，每株觀察測(cè)量30 個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞。

葉片橫切面：采用番紅固綠染色法觀察木薯二倍體及同源四倍體的葉片橫截面，用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，測(cè)量葉片橫截面、柵欄組織和海綿組織厚度。

葉片組織緊密度（CTR）=柵欄組織厚度（PPT）/葉片厚度

葉片組織疏松度（SR）=海綿組織厚度（SPT）/葉片厚度

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0 和Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯同源四倍體誘導(dǎo)

經(jīng)秋水仙素浸泡處理的木薯單芽莖段15 d 左右開(kāi)始萌發(fā)，隨著秋水仙素濃度的升高，單芽莖段的存活率降低，0.03%的秋水仙素處理48 h 后，單芽莖段的成活率為42.2%；當(dāng)秋水仙素濃度升至0.10 g/L 時(shí)，存活率僅為8.9%；濃度升至0.20 g/L 時(shí)，單芽莖段無(wú)一存活（表1）。

2.2 木薯誘變材料的倍性鑒定

共得到存活組培苗74 株，其中38 株存在葉片異形、黃化、顏色變深、葉尖鈍化、葉片變寬等不同程度的形態(tài)變異。從中挑選疑似四倍體的組培苗進(jìn)行繼代增殖，每一株組培苗的繼代植株作為一個(gè)株系，每次均挑選疑似四倍體的變異植株進(jìn)行繼代。繼代4 次后，一共獲得20 個(gè)株系進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，在同一參數(shù)下，二倍體植株在熒光強(qiáng)度6750 處出現(xiàn)1 個(gè)主峰（圖1A），四倍體植株在熒光強(qiáng)度13 500 處出現(xiàn)1 個(gè)主峰（圖1B），四倍體植株的DNA 相對(duì)含量是二倍體的2倍。除二倍體植株和四倍體植株，通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定還檢測(cè)到多種嵌合體植株（圖1C、圖1D）。其中，11 個(gè)株系為同源四倍體，5 個(gè)株系為嵌合體，4 個(gè)株系為二倍體。同源四倍體為檢測(cè)株系的55%，為74 個(gè)存活株系的21.62%，即加倍率為21.62%。

根據(jù)流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，將鑒定為四倍體的株系進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，結(jié)果表明二倍體植株的根尖細(xì)胞染色體數(shù)目均為2n=2x=36，而四倍體植株根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=4x=72。

2.3 二倍體與同源四倍體株系組培苗觀察比較

繼代培養(yǎng)30 d 后，二倍體與四倍體不同株系植株生長(zhǎng)情況如表2 所示。二倍體組培苗的株高、裂葉長(zhǎng)、裂葉長(zhǎng)/裂葉寬顯著高于四倍體組培苗，而裂葉寬、葉綠素SPAD 值、植株鮮重、干重顯著低于四倍體，說(shuō)明四倍體組培苗相比二倍體植株矮壯、葉片濃綠、干物質(zhì)積累多，生長(zhǎng)勢(shì)較旺盛。

2.4 二倍體與同源四倍體大田植株形態(tài)觀察比較

將鑒定為四倍體的木薯組培苗株系（SC12-4、SC12-11）與二倍體組培苗移栽至大田，并于植后60 d（苗期）、120 d（塊根形成期）、180 d（塊根膨大期）、240 d（成熟期）對(duì)生長(zhǎng)情況進(jìn)行調(diào)查。如圖2 所示，不同時(shí)期的多倍體的株高低于二倍體，但差異不顯著；多倍體的裂葉寬顯著高于二倍體，裂葉長(zhǎng)顯著低于二倍體，裂葉長(zhǎng)/裂葉寬顯著降低，在葉片形態(tài)上表現(xiàn)為葉尖盾化，葉片由披針形向拱形過(guò)渡；大田生長(zhǎng)的四倍體均呈現(xiàn)葉片厚、莖桿粗和葉色深等性狀，與四倍體組培苗植株表現(xiàn)一致。四倍體株系SC12-11 的單株塊根產(chǎn)量和收獲指數(shù)較高，分別為3.30 kg 和0.43，顯著高于二倍體株系（圖3）。

2.5 二倍體與四倍體解剖學(xué)觀察比較

與二倍體對(duì)照材料相比，變異四倍體葉片保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)、寬、葉綠體數(shù)目均顯著增加，分別比二倍體增加2.33%、28.99%、117.79%；氣孔數(shù)顯著降低，比對(duì)照減少40.06%（表3）；四倍體變異株保衛(wèi)細(xì)胞呈橢圓形，二倍體保衛(wèi)細(xì)胞趨近于圓柱形（圖4）。葉片橫截面觀察結(jié)果表明（表4），四倍體葉片厚度和PPT 均顯著高于二倍體，比對(duì)照分別增加24.41%、43.88%；SPT 比對(duì)照顯著降低，降低了22.33%；PPT/SPT 是對(duì)照的1.9 倍。四倍體葉片的組織緊密度（CTR）為0.61 高于二倍體（0.52），葉片組[織疏松度（SR）為0.41 顯著低于二倍體（0.25），說(shuō)明四倍體葉片的柵欄組織排列緊密，但海綿組織不發(fā)達(dá)。

3 討論

多倍體植物因其遺傳物質(zhì)倍增，從而表現(xiàn)出植株生長(zhǎng)健壯、器官變大、抗逆性增強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物含量增多的特性，因此多倍體誘導(dǎo)在種質(zhì)資源創(chuàng)新方面發(fā)揮著重要作用[12-13]。雷美艷等[14]經(jīng)過(guò)3 a 的栽培試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，百合多倍體株系JD-h-12 和JD-h-15 平均鱗莖重量?jī)?yōu)于對(duì)照；懷地黃同源四倍體的2 個(gè)株系分別比二倍體親本增產(chǎn)26.6％和56.7％[15]；紫雛菊四倍體株系不僅菊苣酸含量較二倍體親本高，而且生物學(xué)產(chǎn)量也增加[16]。潞黨參的多倍體株系LDSS-5 與二倍體相比，塊根產(chǎn)量增加了76.0%，其葉、花、莖、種子及多糖含量均表現(xiàn)出巨大性或優(yōu)異性[17]。但是，木薯品種新選048 和華南8 號(hào)的四倍體單株的淀粉含量及鮮薯產(chǎn)量均低于二倍體親本[18]。本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)2 個(gè)四倍體株系的單株薯種比二倍體親本顯著增加。張曉霞等[19]對(duì)16 個(gè)白花除蟲(chóng)菊同源四倍體和二倍體的農(nóng)藝性狀進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)11個(gè)株系的總除蟲(chóng)菊酯含量高于二倍體株系，僅有7 個(gè)株系干花中的總除蟲(chóng)菊酯含量高于1.4%，研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。因此，考查四倍體的農(nóng)藝性狀需要對(duì)所獲得的株系材料均進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，否則試驗(yàn)結(jié)果可能出現(xiàn)偏差。

只有在一定的處理濃度范圍內(nèi)，秋水仙素才能有效誘導(dǎo)多倍體發(fā)生。不同的基因型之間，適宜的誘變劑濃度和處理時(shí)間存在差異。聶楊眉[20]利用秋水仙素對(duì)5 個(gè)木薯品種的無(wú)菌腋芽進(jìn)行誘導(dǎo)處理，0.5 g/L 的秋水仙素濃度處理SC5 6～9 h時(shí)，誘導(dǎo)率最高，可達(dá)66.67%，而0.1 g/L 的秋水仙素濃度處理6～9 h 為NZ199 最佳誘導(dǎo)濃度，但誘導(dǎo)率僅為16.67%；周慧文等[21]認(rèn)為0.05～0.1 g/L 是誘導(dǎo)木薯組培苗單芽莖段獲得四倍體的最宜濃度范圍。本研究表明，木薯品種SC12 對(duì)秋水仙素較為敏感，當(dāng)秋水仙素濃度為0.03 g/L時(shí)，成活率為42.4%，四倍體誘導(dǎo)率最高；當(dāng)秋水仙素濃度提升到0.05 g/L 時(shí)， 成活率僅為19.4%。不同木薯品種最適宜的秋水仙素處理濃度范圍差異顯著。

CHEN 等[22]發(fā)現(xiàn)四倍體蘆筍的氣孔密度約為二倍體的一半，而葉綠體數(shù)量是二倍體的2 倍，以及氣孔長(zhǎng)度和寬度略大于二倍體植株。董一昕等[23]也發(fā)現(xiàn)四倍體艾納香植株葉片保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)和寬，均較二倍體差異顯著或極顯著。草棉二倍體、三倍體以及四倍體通過(guò)細(xì)胞學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，隨著倍性的增加，氣孔密度呈下降趨勢(shì)，而氣孔長(zhǎng)度和葉綠體數(shù)均呈上升趨勢(shì)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)木薯變異四倍體葉片保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)、寬、葉綠體數(shù)目均顯著增加，分別比二倍體增加2.33%、28.99%、117.79% ； 氣孔密度顯著降低， 比對(duì)照減少40.06%。本研究結(jié)果和前人[25-26]研究結(jié)果一致。所以氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度和葉綠體數(shù)目也是鑒定植株倍性的重要依據(jù)，該方法易取材，損傷小，操作簡(jiǎn)單。

葉片的組織結(jié)構(gòu)在一定程度上反映植物響應(yīng)外界環(huán)境的生理特性，可作為種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、育種和抗逆性研究的重要依據(jù)[27-29]。柵欄組織是光合作用特化而來(lái)的細(xì)胞群，PPT/SPT 越大，柵欄組織更發(fā)達(dá)，有利于光合作用和提高光合效能，并增加抗旱性。另外，葉片的CTR 越大，SR 越小說(shuō)明柵欄組織排列緊密，海綿組織不發(fā)達(dá)，從而減少蒸騰作用，更有效地減少水分流失[30-31]。

本研究發(fā)現(xiàn)，木薯SC12 同源四倍體植株的PPT顯著高于二倍體親本，而SPT 顯著低于親本，四倍體PPT/SPT 是對(duì)照的1.9 倍，且緊密度高，進(jìn)一步說(shuō)明其抗旱性高。本研究以木薯品種SC12 離體單芽莖段為誘導(dǎo)材料，0.03 g/L 濃度的秋水仙素處理48 h 后，同源四倍體效率最高，為7.78%；經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀、染色體技術(shù)、細(xì)胞解剖學(xué)比較鑒定，獲得了10 個(gè)同源四倍體和6 個(gè)嵌合體植株。二倍體和同源四倍體植株表現(xiàn)出顯著的形態(tài)和生理差異，同源四倍體葉片變厚，裂葉長(zhǎng)/裂葉寬顯著降低，葉綠素含量顯著增加；四倍體株系SC12-11 的單株薯重和收獲指數(shù)分別為3.30 kg 和0.43，顯著高于對(duì)照二倍體株系。