王陳等,馬柏強(qiáng),易弼順

王陳等,馬柏強(qiáng),易弼順,麗水市人民醫(yī)院胃腸與疝外科、減重代謝外科、急診創(chuàng)傷外科 浙江省麗水市 323000

王陳等,住院醫(yī)師,主要從事普通外科與腹壁外科方面相關(guān)的研究.

0 引言

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示,食管癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中排第六位,而死亡率居第四位[1];其中約90%的食管癌屬于食管鱗癌,由于早期癥狀不明顯,很多患者均存在診斷晚、治療效果差的現(xiàn)象.輔助化療在食管癌的治療中仍有著不可替代的作用,獲得性耐藥的產(chǎn)生則成為影響化療效果及患者長期生存的主要因素[2,3].腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥的發(fā)生機(jī)制以及逆轉(zhuǎn)耐藥的新型藥物研發(fā)依舊是目前的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)[3];大量的臨床實(shí)踐表明中藥在改善化療藥物的多藥耐藥現(xiàn)象,緩解化療所致的不良反應(yīng),提升患者化療完成度及治療效果上具有明顯的優(yōu)勢[3-5].白藜蘆醇是一種非黃酮多酚類化合物,廣泛存在于天然植物及傳統(tǒng)中藥中;作為一種天然的抗毒素,白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學(xué)功效[6-8].早期有研究顯示,白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞化療耐藥[7].此外,白藜蘆醇可靶向miR-122-5p增加乳腺癌細(xì)胞MCF-7對阿霉素的敏感性[8].由此可見,白藜蘆醇可與多種化療藥物聯(lián)用,增加藥物療效;然而目前并未有關(guān)于白藜蘆醇對人食管癌細(xì)胞Eca109化療耐藥的影響及相關(guān)機(jī)制的報(bào)道.本研究以人食管癌細(xì)胞Eca109及其順鉑耐藥細(xì)胞系Eca109/DDP為觀察對象,評估白藜蘆醇干預(yù)后Eca109/DDP細(xì)胞順鉑耐藥性的變化,并從細(xì)胞鐵死亡的角度初步探究其可能的作用機(jī)制,為白藜蘆醇在食管癌化療中的實(shí)踐應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料 人食管癌細(xì)胞Eca109及其順鉑耐藥細(xì)胞系Eca109/DDP購自中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;RPMI1640液體細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;白藜蘆醇、鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1,Fer-1) 和鐵離子螯合劑(deferoxamine,DFO)購自Sigma公司;注射用順鉑購自齊魯制藥有限公司;鐵分析試劑盒購自美國Abnova公司;?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl coenzyme A synthetase long chain family member 4,ACSL4)、鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain,FTH)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、腫瘤蛋白53(tumor protein 53,P53)和肌動蛋白β(β-actin)抗體均購自美國Abcam公司;噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)細(xì)胞增殖檢測試劑盒以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、活性氧(active oxygen species,ROS)檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng): 食管癌細(xì)胞Eca109及其順鉑耐藥細(xì)胞系Eca109/DDP常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640液體細(xì)胞培養(yǎng)基中,定期換液和傳代.為保證細(xì)胞的耐藥性,Eca109/DDP細(xì)胞培養(yǎng)基中需間斷性加入順鉑.培養(yǎng)環(huán)境為: 37 ℃,50 mL/L CO2.

1.2.2 MTT檢測: 采用MTT法檢測細(xì)胞經(jīng)處理后增殖情況的變化,將細(xì)胞接種至96孔板中(2×104個/mL),給予相應(yīng)的藥物處理后,加入MTT試劑,培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h.最后用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度值(OD),分析細(xì)胞的增殖情況.每次實(shí)驗(yàn)設(shè)三個復(fù)孔取平均值,同時(shí)設(shè)不含細(xì)胞的單孔作為空白對照.實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次.不同實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置如下:

檢測順鉑對Eca109及Eca109/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),順鉑的濃度梯度設(shè)置為0、3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM和50 μM.

檢測白藜蘆醇對食管癌耐藥細(xì)胞Eca109/DDP的毒性作用,白藜蘆醇的濃度設(shè)置為0、15 μM、30 μM、60 μM、120 μM和240 μM.

1.2.3 細(xì)胞集落形成檢測: 采用細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞的增殖情況.將細(xì)胞鋪板于6孔板(1000個/孔),依據(jù)下述實(shí)驗(yàn)分組分別加藥處理,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 wk.吸棄培養(yǎng)液,PBS清洗后加多聚甲醛固定細(xì)胞集落,而后加結(jié)晶紫染液染色,將染色結(jié)果置于顯微鏡下拍照觀察并計(jì)算細(xì)胞的集落形成數(shù).

實(shí)驗(yàn)分組如下: 對照組(不加順鉑及白藜蘆醇;Ctrl);白藜蘆醇組(白藜蘆醇濃度為30 μM;Res);順鉑組(順鉑濃度為12.5 μM;DDP);順鉑及白藜蘆醇聯(lián)用組(順鉑濃度為12.5 μM,白藜蘆醇濃度為30 μM;Res+DDP).

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH檢測: 依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別處理各組細(xì)胞,按照試劑盒提供的操作說明書進(jìn)行如下操作: 首先離心收集各組細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后,重懸細(xì)胞.超聲破碎細(xì)胞并離心收集上清液,依據(jù)說明說加入相應(yīng)的工作液孵育,酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并分析相應(yīng)的檢測指標(biāo).實(shí)驗(yàn)分組同2.3.

1.2.5 二價(jià)鐵離子(Fe2+)含量檢測: 依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別處理各組細(xì)胞,按照試劑盒提供的操作說明書進(jìn)行如下操作: 胰酶消化收集各組細(xì)胞,離心后加Assay buffer重懸細(xì)胞.渦旋化冰后再次離心收集上清液待檢,向待檢樣品中依次加入鐵還原劑和探針,孵育后經(jīng)酶標(biāo)儀檢測593 nm波長處的吸光度值.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并分析各實(shí)驗(yàn)組鐵離子的濃度.實(shí)驗(yàn)分組同2.3.

1.2.6 ROS檢測: 將細(xì)胞鋪板于24孔板(2×104個/孔),依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別處理各組細(xì)胞,并增加空白對照孔(僅溶劑)和陽性對照孔(加ROS對照試劑5 mg/mL Rosup),更換細(xì)胞培養(yǎng)液,避光加DCFH-DA染液染色30 min.消化收集細(xì)胞,PBS洗滌并重懸,于熒光顯微鏡下拍照觀察并分析熒光強(qiáng)度.實(shí)驗(yàn)分組同2.3.

1.2.7 western blot蛋白表達(dá)水平檢測: 細(xì)胞經(jīng)冰PBS洗滌后,加RIPA裂解液收集各組細(xì)胞蛋白.參考BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,而后上樣進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳和電轉(zhuǎn),將分離的目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜.加入5%的脫脂乳粉于室溫下封閉90 min.依據(jù)說明書要求加入相應(yīng)比例的一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后加入相對應(yīng)的二抗室溫孵育2 h.TBST洗滌,暗室中經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白的表達(dá)情況并行灰度半定量分析.實(shí)驗(yàn)分組同2.3.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)錄入GraphPad8.3軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間的比較采用方差分析,各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有顯著性.

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇及順鉑在食管癌化療中的協(xié)同增敏作用 本研究首先采用MTT法確定Eca109/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性.結(jié)果如圖1所示,順鉑可濃度依賴性抑制Eca109及Eca109/DDP細(xì)胞的增殖,其中順鉑對Eca109細(xì)胞和Eca109/DDP細(xì)胞的IC50分別為(7.70±1.18) μM和(24.73±4.45) μM;Eca109/DDP細(xì)胞對順鉑具有明顯的耐藥性,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析.

圖1 白藜蘆醇及順鉑聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞活力的影響. n=3,aP＜0.05 vs Eca109細(xì)胞,bP＜0.05 vs Eca109/DDP細(xì)胞.Res: 白藜蘆醇.

CCK-8細(xì)胞活力檢測的結(jié)果顯示(表1),Eca109/DDP細(xì)胞經(jīng)不同濃度的白藜蘆醇處理24 h后,細(xì)胞活力隨白藜蘆醇濃度的增加有所降低,其中120 μM及240 μM的白藜蘆醇可顯著抑制細(xì)胞活力(P＜0.05);處理48 h后,白藜蘆醇濃度在60 μM、120 μM及240 μM時(shí)的作用較為顯著(P＜0.05).選取無細(xì)胞毒性作用的濃度為白藜蘆醇的耐藥逆轉(zhuǎn)濃度,即30 μM.

表1 白藜蘆醇對Eca109/DDP細(xì)胞活力的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證白藜蘆醇是否可逆轉(zhuǎn)Eca109/DDP細(xì)胞的耐藥性,本研究采用MTT法檢測30 μM白藜蘆醇預(yù)孵之后,順鉑對Eca109/DDP細(xì)胞的殺傷作用.結(jié)果圖1所示;30 μM白藜蘆醇預(yù)孵后,Eca109/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性顯著增強(qiáng),且在順鉑濃度為12.5 μM時(shí),差異較為顯著(P＜0.05),故而后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用此濃度進(jìn)行處理.

2.2 白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用對細(xì)胞集落形成的影響 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示(圖2),相比于對照組,單用順鉑處理(DDP組)細(xì)胞集落形成數(shù)由1058.27±95.82減少至693.69±53.25(P＜0.05),而白藜蘆醇和順鉑聯(lián)合處理組(Res+DDP組)細(xì)胞集落形成數(shù)進(jìn)一步減少至357.78±23.24.結(jié)果表明在Eca109/DDP細(xì)胞中,白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用可進(jìn)一步增強(qiáng)順鉑對細(xì)胞的殺傷力.

圖2 白藜蘆醇及順鉑聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞集落形成的影響(比例尺= 5 mm).Ctrl: 對照組;Res: 白藜蘆醇組;DDP: 順鉑組;Res+DDP: 順鉑及白藜蘆醇聯(lián)用組.n=3,aP＜0.05 vs Ctrl組,bP＜0.05 vs DDP組.

2.3 白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用對細(xì)胞鐵死亡的影響 細(xì)胞鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果顯示(圖3),相比于對照組,順鉑處理組(DDP組)細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子的含量有所升高,同時(shí)MDA和ROS水平顯著升高(P＜0.05),而GSH水平顯著降低.加入30 μM的白藜蘆醇預(yù)孵后,細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子的含量以及MDA和ROS水平顯著高于DDP組;GSH水平則顯著低于DDP組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).結(jié)果說明白藜蘆醇聯(lián)用順鉑可顯著促進(jìn)Eca109/DDP細(xì)胞內(nèi)鐵離子的蓄積,并誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡.

圖3 白藜蘆醇及順鉑聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞鐵死亡的影響.A: 二價(jià)鐵離子含量;B: MDA水平;C: GSH水平;D和E: ROS水平,放大倍數(shù)400×,比例尺=20 μm.n=3,aP＜0.05 vs Ctrl 組,bP＜0.05 vs DDP組.MDA: 丙二醛;GSH: 谷胱甘肽;ROS: 活性氧;Ctrl: 對照組;Res: 白藜蘆醇組;DDP: 順鉑組;Res+DDP: 順鉑及白藜蘆醇聯(lián)用組.

2.4 白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用逆轉(zhuǎn)耐藥性與鐵死亡的相關(guān)性 本部分實(shí)驗(yàn)通過Fer-1和DFO進(jìn)一步驗(yàn)證白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用逆轉(zhuǎn)耐藥性與鐵死亡的相關(guān)性(圖4),MTT細(xì)胞毒性檢測結(jié)果顯示Fer-1和DFO對Eca109/DDP細(xì)胞無明顯損傷;白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用組(Res+DDP)細(xì)胞活力為(48.05±2.83)%,加2.5 μM鐵死亡抑制劑Fer-1或者2.5 μM鐵離子螯合劑DFO干預(yù),細(xì)胞活力分別回升至(60.36±2.87)%和(57.70±2.74)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).結(jié)果表明,白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用所致的Eca109/DDP細(xì)胞增殖抑制作用可被鐵死亡抑制劑Fer-1和鐵離子螯合劑DFO部分逆轉(zhuǎn).

圖4 鐵死亡抑制劑Fer-1和鐵離子螯合劑DFO對Eca109/DDP細(xì)胞活力的影響. A: Fer-1的細(xì)胞毒性檢測;B: MTT檢測Fer-1、Res和DDP對Eca109/DDP細(xì)胞活力的影響;C: DFO的細(xì)胞毒性檢測;D: MTT檢測DFO、Res和DDP對Eca109/DDP細(xì)胞活力的影響.Res: 白藜蘆醇;DDP: 順鉑.n=3,aP＜0.05 vs Res+DDP組.

2.5 白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用對細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)調(diào)控因子的影響 Western blot檢測結(jié)果如圖5所示,相比于對照組,順鉑處理組(DDP組)細(xì)胞內(nèi)FTH及GPX4的蛋白表達(dá)有所降低(P＜0.05);ACSL4及P53的蛋白表達(dá)則呈增加趨勢(P＜0.05).白藜蘆醇和順鉑聯(lián)合處理組(Res+DDP組)細(xì)胞內(nèi)FTH及GPX4的蛋白表達(dá)相比于DDP組顯著降低(P＜0.05);ACSL4及P53的蛋白表達(dá)相比于DDP組則進(jìn)一步增加(P＜0.05).結(jié)果說明白藜蘆醇可影響Eca109/DDP細(xì)胞內(nèi)鐵死亡相關(guān)調(diào)控因子的蛋白表達(dá).

圖5 白藜蘆醇及順鉑聯(lián)用對Eca109/DDP細(xì)胞鐵死亡相關(guān)調(diào)控因子的影響. n=3,aP＜0.05 vs Ctrl組,bP＜0.05 vs DDP組.FTH: 丙二醛;GPX4: 谷胱甘肽;ACSL4: 活性氧;Ctrl: 對照組;Res: 白藜蘆醇組;DDP: 順鉑組;Res+DDP: 順鉑及白藜蘆醇聯(lián)用組.

3 討論

中藥往往具有多種藥理學(xué)功效,且自身毒副作用較小,在應(yīng)對復(fù)雜疾病上具有天然的優(yōu)勢.本研究探究了白藜蘆醇對食管癌順鉑耐藥細(xì)胞Eca109/DDP化療耐藥性的影響.MTT藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白藜蘆醇自身對食管癌細(xì)胞Eca109和Eca109/DDP的毒性較小,聯(lián)合應(yīng)用白藜蘆醇和順鉑可增加Eca109/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性,具有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)效應(yīng).同時(shí)克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示相較于單用順鉑,白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用可進(jìn)一步抑制Eca109/DDP細(xì)胞克隆形成,提升順鉑的作用效果.結(jié)果提示,白藜蘆醇可逆轉(zhuǎn)食管癌順鉑耐藥細(xì)胞Eca109/DDP對順鉑的耐藥性.

化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用主要體現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞的無限增殖,誘導(dǎo)其多種模式的死亡上[9].細(xì)胞死亡的方式主要包括: 細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡、壞死性凋亡、鐵死亡以及自噬等,它們具有不同的形態(tài)和生化特征[9-11].本研究從鐵死亡的角度初步探究了白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)Eca109/DDP細(xì)胞順鉑耐藥性的作用機(jī)制.鐵死亡是一種鐵和脂質(zhì)過氧化依賴性的細(xì)胞死亡模式,其主要特征表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)鐵離子蓄積通過芬頓反應(yīng)生成大量的ROS,同時(shí)伴隨GSH耗竭,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物水平升高,最終誘發(fā)細(xì)胞死亡[12].目前有大量的文獻(xiàn)報(bào)道,在包括胃癌[13]、結(jié)直腸癌[14]以及食管癌[15]中,誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡是改善腫瘤細(xì)胞放化療耐藥的重要策略.本研究的檢測結(jié)果顯示,白藜蘆醇聯(lián)用順鉑可促進(jìn)Eca109/DDP細(xì)胞內(nèi)鐵離子的蓄積,并誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡;同時(shí)白藜蘆醇和順鉑聯(lián)用所致的Eca109/DDP細(xì)胞增殖抑制作用可被鐵死亡抑制劑Fer-1和鐵離子螯合劑DFO部分逆轉(zhuǎn).結(jié)果表明,白藜蘆醇可通過鐵死亡途徑逆轉(zhuǎn)食管癌順鉑耐藥細(xì)胞Eca109/DDP的耐藥性.

鐵離子依賴性脂質(zhì)過氧化是鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵特征,故而細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化和鐵代謝的相關(guān)因子也是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵因子[12].GPX4是含硒GPX家族的成員之一,可通過催化谷胱甘肽還原反應(yīng),抑制脂質(zhì)過氧化物的蓄積,是抵抗鐵死亡的核心因素[16];ACSL4則是長鏈脂酰CoA合成酶家族的成員之一,可通過參與合成易被氧化的膜磷脂誘發(fā)鐵死亡[17].另一方面,鐵蛋白則是胞內(nèi)鐵的主要儲存形式,由鐵蛋白重鏈1和輕鏈組成,對防止鐵超載進(jìn)而產(chǎn)生ROS具有重要的意義[18].除了依賴于GPX4的鐵死亡途徑外,P53信號也被證明通過SLC7A11以及ALOX12等途徑參與調(diào)控鐵死亡[19].本實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果顯示,白藜蘆醇聯(lián)用順鉑可顯著降低Eca109/DDP細(xì)胞內(nèi)FTH和GPX4的蛋白表達(dá),而增加ACSL4以及P53的蛋白表達(dá)水平,這可能是其促進(jìn)鐵死亡的調(diào)控機(jī)制之一.

4 結(jié)論

綜上所述,白藜蘆醇聯(lián)合順鉑使用可顯著提高食管癌細(xì)胞Eca109/DDP對順鉑的敏感性,其作用機(jī)制可能是通過影響細(xì)胞鐵死亡相關(guān)調(diào)控因子FTH、GPX4、ACSL4和P53的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子的蓄積,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡是改善包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞放化療耐藥的重要策略.

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

白藜蘆醇被報(bào)道其可作為多種化療藥的增敏劑,但其在食管癌耐藥細(xì)胞的順鉑化療中的作用以及其中是否涉及鐵死亡途徑并不清楚.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討白藜蘆醇對食管癌耐藥細(xì)胞的順鉑敏感性的影響,并驗(yàn)證鐵死亡途徑在此過程中所起的作用.

實(shí)驗(yàn)方法

白藜蘆醇+順鉑處理Eca109/DDP細(xì)胞后,檢測細(xì)胞活性和集落形成以驗(yàn)證白藜蘆醇對順鉑的增敏作用,并檢測鐵死亡關(guān)鍵表征和調(diào)控因子的水平.用鐵死亡抑制劑和鐵離子螯合劑處理細(xì)胞,觀察是否消除了白藜蘆醇對順鉑的增敏作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

白藜蘆醇在增強(qiáng)Eca109/DDP細(xì)胞對順鉑敏感過程中伴隨促進(jìn)鐵死亡,抑制鐵死亡能在一定程度上消除白藜蘆醇對順鉑的增敏作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

白藜蘆醇可通過誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡來恢復(fù)食管癌順鉑耐藥細(xì)胞Eca109/DDP對順鉑的敏感性.

展望前景

白藜蘆醇可能是改善食管癌耐藥的潛在藥劑.