南金生 安江紅,2 柴明娜 蔣嶼瀲 朱志強(qiáng) 楊 燕 韓 冰,*

淀粉特性及其表面結(jié)合蛋白與裸燕麥籽粒硬度的關(guān)系研究

南金生1安江紅1,2柴明娜1蔣嶼瀲1朱志強(qiáng)1楊 燕1韓 冰1,*

1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) / 麥類種質(zhì)創(chuàng)新利用自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗室, 內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院, 內(nèi)蒙古呼和浩特 010018

籽粒硬度可以反映麥類籽粒胚乳質(zhì)地, 與其碾磨性能和食用加工品質(zhì)密切相關(guān)。為了探究裸燕麥(L.)籽粒淀粉特性及其表面結(jié)合蛋白與籽粒硬度的關(guān)系。本文以5份軟質(zhì)和5份硬質(zhì)裸燕麥種質(zhì)為材料, 測定總淀粉、支鏈和直鏈淀粉含量, 觀察淀粉粒特性和粒度, 對淀粉顆粒表面結(jié)合蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明: 成熟籽粒中淀粉顆粒的形狀有圓形、橢圓形和不規(guī)則形, 淀粉粒的數(shù)量、體積和表面積均呈現(xiàn)單峰分布; 淀粉粒大小可分為小(粒徑<6 μm)、中(6～40 μm)和大淀粉粒(粒徑>40 μm), 裸燕麥籽粒主要由小和中淀粉粒組成; 硬度不同的裸燕麥籽粒中淀粉的粒度分布不同, 軟質(zhì)裸燕麥小淀粉粒的數(shù)量和體積百分比高于硬質(zhì), 中、大淀粉粒的數(shù)量和體積百分比低于硬質(zhì); 軟質(zhì)裸燕麥小和中淀粉粒的表面積百分比高于硬質(zhì), 大淀粉粒表面積百分比低于硬質(zhì); 裸燕麥籽粒硬度與支鏈淀粉含量呈正相關(guān)。軟質(zhì)裸燕麥14 kD蛋白在淀粉顆粒表面的含量高于硬質(zhì)裸燕麥, 該蛋白條帶經(jīng)HPLC/MS共鑒定到41種蛋白, 包括Vromindoline蛋白和燕麥α淀粉酶胰蛋白酶抑制劑等。綜上所述, 裸燕麥籽粒淀粉含量、粒度分布和淀粉表面結(jié)合蛋白均與籽粒硬度相關(guān), 支鏈淀粉含量越高, 小淀粉粒的數(shù)量、表面積和體積百分比越多, Vromindoline等蛋白含量越高, 裸燕麥籽粒越軟, 為揭示裸燕麥籽粒硬度形成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

裸燕麥; 籽粒硬度; 淀粉粒度; Vromindoline; HPLC/MS

籽粒硬度是指破壞籽粒所需的力, 是國際較通用的商品小麥分類的重要指標(biāo), 是小麥進(jìn)行市場分級和定價的重要性狀之一[1]。燕麥籽粒屬于超軟質(zhì)結(jié)構(gòu)[2], 籽粒硬度與其在收獲、清洗、脫粒和脫殼過程中的破損率密切相關(guān)[3], 對燕麥的加工及食用品質(zhì)有重要影響。

小麥籽粒硬度的研究開展較早, 已有研究表明, 小麥籽粒硬度不是由淀粉粒和儲藏蛋白單獨(dú)決定的,而是由籽粒中淀粉和蛋白質(zhì)基質(zhì)的粘合力以及包被淀粉顆粒的蛋白基質(zhì)的連續(xù)性決定的[4], 并且與淀粉顆粒表面含有少量的脂類物質(zhì)也有關(guān)[5]。Greenwell等[6]通過對100個小麥品種經(jīng)Triton X-114提取的水洗淀粉粒表面蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 發(fā)現(xiàn)了2個主要譜帶, 分子量大約為15 Ku和30 Ku, 而且軟質(zhì)麥中富含有分子量為15 Ku的淀粉粒表面蛋白, 硬質(zhì)麥中含量稀少, 而在硬粒小麥(AABB)中根本不含有該種蛋白質(zhì)。該蛋白被命名為Friabilin蛋白, 這種蛋白被認(rèn)為是判斷小麥籽粒硬度的生化標(biāo)記[7]。Greenwell和Schofield[6]對Frabilin蛋白進(jìn)行高效液相層析和氨基酸序列分析, 證實(shí)了Frabilin蛋白主要由2種蛋白構(gòu)成, 因其富含色氨酸區(qū)域, 故將其命名為Puroindoline a (PINA)和Puroindoline b (PINB)[8-9]。PINA蛋白的缺失或編碼PINB蛋白的基因突變均造成小麥胚乳質(zhì)地變硬[10]。

燕麥籽粒硬度在分子水平的研究開展較晚。直到2015年, Gazza等[11]利用雙向電泳在普通栽培燕麥()和砂燕麥()的籽粒淀粉顆粒表面各分離了3個燕麥屬特異的Vromindoline (VIN)蛋白, 大小為14 kD, 并在燕麥屬內(nèi)對VIN蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)研究; 作者通過將和基因轉(zhuǎn)化到硬粒小麥Svevo中, 在轉(zhuǎn)基因后代中表達(dá)并在淀粉粒表面積累了其編碼的蛋白VIN-2.1和VIN-3.1, 使得轉(zhuǎn)基因硬粒小麥的籽粒硬度降低約50%, 表明Vromindoline基因引起籽粒硬度的改變, 可以用于其他谷物籽粒硬度性狀的修飾。在六倍體大粒裸燕麥()上關(guān)于Vromindoline蛋白的研究還未見報道。

前期研究確立了籽粒硬度的檢測方法, 針對260份裸燕麥自然群體設(shè)置了3年2點(diǎn)試驗, 并對其進(jìn)行了硬度檢測, 消除環(huán)境方差后得到了連續(xù)變化的硬度數(shù)據(jù)。本研究選擇了自然群體中硬度值差異最大的5份軟質(zhì)和5份硬質(zhì)裸燕麥材料為研究對象, 以淀粉和淀粉顆粒表面結(jié)合蛋白為切入點(diǎn), 對淀粉含量、淀粉顆粒的形態(tài)和粒度分布, 以及淀粉顆粒表面蛋白含量和種類進(jìn)行研究, 揭示淀粉及其表面結(jié)合蛋白與籽粒硬度的關(guān)系, 為闡明裸燕麥籽粒硬度的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)前期研究建立的裸燕麥籽粒硬度檢測方法[12]和3年(2019、2020和2021年) 2點(diǎn)(內(nèi)蒙古烏蘭察布市(40.71°N, 13.23°E)和河北省張家口市, 114.72°E, 41.07°N)籽粒硬度的檢測數(shù)據(jù), 并根據(jù)硬度值從2021年種植于烏蘭察布的材料中篩選出5份最硬和5份最軟的裸燕麥用于本研究(表1)。

1.2 淀粉提取

裸燕麥籽粒經(jīng)挑選去雜后, 使用旋風(fēng)磨磨制成粉, 過80目篩, 得到裸燕麥全粉。按照劉剛的燕麥淀粉和蛋白提取方法[13]對裸燕麥淀粉進(jìn)行提取。

1.3 淀粉含量的測定

總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的測定按照淀粉含量試劑盒說明書進(jìn)行樣品制備。將標(biāo)準(zhǔn)品母液進(jìn)行梯度稀釋, 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。淀粉水解為葡萄糖后, 利用蒽酮比色法測定葡萄糖的含量, 再換算為淀粉含量, 測定波長為620 nm; 直鏈淀粉與碘形成絡(luò)合物于620 nm處讀取吸光值, 進(jìn)而得到樣本中直鏈淀粉的含量; 利用雙波長比色法測定支鏈淀粉與碘形成的絡(luò)合物, 進(jìn)而得到樣本中支鏈淀粉的含量, 測定波長為540 nm和740 nm。

表1 10份裸燕麥材料信息

1.4 淀粉顆粒形態(tài)的觀察

淀粉過100目篩, 取約100 mg淀粉樣于載物臺上, 鋪均勻, 壓緊, 并在蔡司Merlin Compact高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。另外, 直接將成熟后自然干燥的籽粒用力掰開, 將切面壓向?qū)щ娔z, 直接觀察粘在膠面上的淀粉顆粒。

1.5 淀粉粒度的檢測

稱取100～200 mg淀粉于干凈EP管中, 加入1 mL 75%酒精, 渦旋混勻后超聲混勻。將混勻后的樣品加入到Mastersizer 3000馬爾文激光粒度儀進(jìn)行粒度分布測定, 每樣測定3次。利用Mastersizer 3000分析軟件, 對采集的樣品粒度數(shù)據(jù)進(jìn)行處理, 得到淀粉的表面積、體積、數(shù)量分布曲線等特征參數(shù)。

1.6 淀粉顆粒表面蛋白的提取與SDS-PAGE電泳

分別稱取1 g全粉和淀粉, 按照霍華蕾等[14]的方法用TritonX-114提取膜蛋白, 于–20℃存放。利用Solarbio公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白溶液進(jìn)行定量, 具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。全粉和淀粉的蛋白上樣量分別為10 μg和30 μg, 蛋白的電泳參照王子寧等[15]使用的SDS-PAGE電泳法。電泳結(jié)束后, 考馬斯亮藍(lán)溶液染色4 h, 脫色液脫色3～5 h, 背景清晰后, 用成像儀進(jìn)行成像。

1.7 蛋白膠內(nèi)酶解與HPLC-MS分析

以染色條帶為標(biāo)準(zhǔn), 將SDS-PAGE電泳分離的TritonX-114可溶性蛋白條帶切割, 將膠條切碎, 按照王霞霞等[16]的方法進(jìn)行膠內(nèi)酶解。得到的肽段混合物用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離, 后被注入NSI離子源中進(jìn)行電離, 然后進(jìn)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

1.8 搜庫

二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 2.4進(jìn)行檢索, 數(shù)據(jù)庫設(shè)置為Avena (UniProt, 1096條序列); 酶切方式設(shè)置為Trypsin/P; 漏切位點(diǎn)設(shè)置為2; 一級母離子質(zhì)量誤差容忍度設(shè)置為10 mg L–1; 二級碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度設(shè)置為0.02 Da; 肽段離子打分要求高于20, 鑒定結(jié)果peptide confidence設(shè)置為High。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 20進(jìn)行差異顯著性和Person相關(guān)性分析。在UniProt數(shù)據(jù)庫中下載并比對質(zhì)譜檢測到的蛋白的氨基酸序列, 利用MEGA 7采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹, bootstrap值設(shè)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硬度裸燕麥中淀粉含量的差異

10份裸燕麥成熟籽粒中總淀粉含量變化范圍為539.69～620.07 mg g–1, 直鏈淀粉含量變化幅度為118.80～181.60 mg g–1, 支鏈淀粉含量變化幅度為426.08～539.29 mg g–1。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn), 最軟的HX317和最硬的HX320的總淀粉和直鏈淀粉含量差異不顯著(>0.05), 而軟質(zhì)組中的HX344與HX320的總淀粉含量差異顯著(<0.05), HX88與HX320的直鏈淀粉含量差異顯著(<0.05); 最軟的HX317與硬質(zhì)組中的HX310、HX268和HX265的直鏈淀粉含量差異顯著, 與硬質(zhì)組中的HX310、HX21、HX265和HX320的支鏈淀粉含量差異顯著(圖1)。軟質(zhì)組和硬質(zhì)組的硬度值進(jìn)行方差分析, 發(fā)現(xiàn)總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉在組間的差異均不顯著, 組內(nèi)個別材料之間存在顯著差異(>0.05)。籽粒硬度與籽粒淀粉含量的Pearson相關(guān)性分析顯示, 裸燕麥籽粒硬度值與總淀粉含量的相關(guān)系數(shù)為–0.098, 與直鏈淀粉含量的相關(guān)系數(shù)為–0.07, 與支鏈淀粉含量的相關(guān)系數(shù)為0.692, 呈正相關(guān)(=0.027)。

2.2 淀粉顆粒形態(tài)的觀察

選擇最軟(HX317)和最硬(HX320)兩份材料進(jìn)行掃描電鏡觀察, 結(jié)果表明, 成熟籽粒中包括大顆粒和小顆粒淀粉(圖2-f), 淀粉顆粒的形狀有圓形、橢圓形和不規(guī)則形(圖2-c); 軟質(zhì)裸燕麥籽粒的淀粉以小淀粉粒為主(圖2-a), 而硬質(zhì)裸燕麥籽粒中、大淀粉粒分布較多(圖2-f)。另外, 水提淀粉顆粒表面光滑, 幾乎沒有附著物質(zhì)的存在(圖2-d, i), 而直接將成熟籽粒掰開, 直接觀察粘在膠面上的淀粉顆粒, 發(fā)現(xiàn)軟質(zhì)和硬質(zhì)裸燕麥淀粉顆粒表面都有很多附著物(圖2-e, j)。

2.3 淀粉顆粒的粒度分析

經(jīng)檢測, 裸燕麥淀粉粒的數(shù)量、表面積和體積均呈現(xiàn)單峰分布(圖3)。參考小麥和水稻等[17]的劃分方式, 將裸燕麥淀粉粒按粒徑不同劃分為小(粒徑<6 μm)、中(6 μm<粒徑<40 μm)和大淀粉粒(粒徑>40 μm)。從表2可以看出, 裸燕麥籽粒主要由小淀粉粒和中淀粉粒組成, 大淀粉粒較少。從數(shù)量分布來看, 最軟的HX317的小淀粉粒的數(shù)量百分比高于HX320, 而中、大淀粉粒的占比低于HX320, 這與掃描電鏡觀察到的結(jié)果基本一致。從表面積分布來看, HX317和HX320的小、中及大淀粉粒的表面積百分比分別是0.027%和0.009%、99.79%和98.26%、0.016%和1.73%, 說明2個材料的淀粉粒表面積都主要取決于中淀粉粒。軟硬裸燕麥之間比較, 軟質(zhì)裸燕麥的小、中淀粉粒的所占表面積百分比高于硬質(zhì), 而大淀粉粒的低于硬質(zhì)。從體積分布來看, HX317和HX320的小、中和大淀粉粒的體積百分比分別是14.37%和7.59%、84.82%和88.89%、0.80%和3.52%, 說明裸燕麥淀粉?？傮w積主要取決于中淀粉粒。軟硬裸燕麥之間比較, 軟質(zhì)裸燕麥的小淀粉粒所占體積百分比約是硬質(zhì)裸燕麥的2倍, 而中和大淀粉粒所占體積比低于硬質(zhì)裸燕麥。

圖1 10份裸燕麥成熟籽粒中總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量

不同小寫字母表示在0.05概率水平差異顯著?？s寫同表1。

Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 probability level. Abbreviations are the same as those given in Table 1.

圖2 軟質(zhì)HX317和硬質(zhì)HX320籽粒淀粉顆粒的顯微結(jié)構(gòu)

a～e: HX317的淀粉顆粒; f～j: HX320的淀粉顆粒; 從左向右的5列圖片比例尺分別為20、10、3、1和5 μm。

a–e: the starch granules of HX317; f–j: the starch granules of HX320. The scale bars of the five column pictures from left to right are 20, 10, 3, 1, and 5 μm, respectively.

2.4 TritonX-114可溶性蛋白提取

利用TritonX-114提取了燕麥籽粒全粉和淀粉顆粒表面的膜蛋白。結(jié)果表明, 籽粒全粉和淀粉顆粒表面檢測到了多種蛋白, 包括與PIN和VIN蛋白大小相近的14 kD的蛋白, 并且該蛋白在最軟的HX317的淀粉顆粒表面的含量高于最硬的HX320中的含量(圖4), 表明裸燕麥淀粉顆粒表面14 kD蛋白的含量可能與籽粒硬度相關(guān)。

圖3 HX317和HX320淀粉粒的數(shù)量、表面積和體積分布

表2 HX317和HX320淀粉粒的數(shù)量、表面積和體積分布百分比

縮寫同表1。Abbreviations are the same as those given in Table 1.

圖4 不同硬度裸燕麥中TritonX-114可溶性蛋白的SDS-PAGE

a和b為全粉中和淀粉顆粒表面結(jié)合的蛋白; M為80 kD的蛋白marker; 1～10分別代表HX317、HX88、HX106、HX54、HX344、HX310、HX268、HX21、HX265和HX320, 越向右硬度值越大。

a and b are the proteins form whole flour and starch surface bound proteins, respectively. M: 80 kD protein marker. 1–10 represent HX317, HX88, HX106, HX54, HX344, HX310, HX268, HX21, HX265, and HX320, respectively. The further to the right the sequence, the greater the hardness value of the variety.

2.5 硬度相關(guān)蛋白的質(zhì)譜鑒定與生信分析

從圖4-b的SDS-PAGE凝膠上切取14 kD處的條帶, 進(jìn)行膠內(nèi)酶解, 對酶解得到的肽段混合物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。經(jīng)基質(zhì)峰、酶自切峰校正, 根據(jù)UniProt中燕麥屬蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對, 鑒定到159個肽段, 共41個蛋白, 包括Vromindoline蛋白、燕麥α淀粉酶胰蛋白酶抑制劑(AATI)、燕麥儲藏蛋白(Avenin)、類麥醇溶蛋白(Gliadin-like)和球蛋白(globulin)等(表3)。其中, Vromindoline蛋白和燕麥α淀粉酶胰蛋白酶抑制劑在UniProt數(shù)據(jù)庫中比對到了普通栽培燕麥()、細(xì)燕麥()、島嶼燕麥()、綿毛燕麥()、砂燕麥()、大穗燕麥()、大燕麥()和墨菲燕麥(), 表明本研究從裸燕麥()淀粉顆粒表面提取的14 kD蛋白中也存在Vromindoline蛋白和AATI蛋白。得分最高的Vromindoline和AATI蛋白的特異性肽段的質(zhì)譜分析結(jié)果如圖5所示。經(jīng)過蛋白序列比對, Vromindoline和AATI蛋白在燕麥屬內(nèi)是非常保守的, Vromindoline蛋白包含“WPWKWWWK”的色氨酸豐富區(qū)(圖6)。

圖5 I2E102和A0A1B2LQE3特異肽段的質(zhì)譜圖

表3 14 kD處蛋白的部分質(zhì)譜分析結(jié)果

圖6 9個Vromindoline蛋白和8個AATI蛋白的序列比對

Fig. 6 Sequence alignment of nine Vromindoline and eight AATI proteins

A: 9個VIN蛋白和8個AATI蛋白的進(jìn)化樹; B: VIN蛋白的序列比對, 紅框為色氨酸豐富區(qū)。

A: the evolutionary tree of nine VIN proteins and eight AATI proteins; B: the sequence alignment of VIN proteins, and the red box is the tryptophan-rich region.

3 討論

小麥PIN蛋白是淀粉顆粒結(jié)合蛋白, 包含一個色氨酸豐富區(qū), 該區(qū)域具有脂質(zhì)結(jié)合特性[18-19], 且軟質(zhì)小麥淀粉顆粒表面的PIN蛋白量顯著高于硬質(zhì)小麥[20]。小麥淀粉粒結(jié)合蛋白的突變會影響直鏈淀粉含量、支鏈淀粉結(jié)構(gòu), 引起淀粉粒結(jié)晶異常[21]。本研究從裸燕麥成熟籽粒的淀粉顆粒表面分離出了與籽粒硬度相關(guān)的VIN蛋白, 且該蛋白也包含一個色氨酸豐富區(qū), 且在軟質(zhì)裸燕麥中的含量高于硬質(zhì), 這與小麥上的研究類似。PIN蛋白通過色氨酸豐富區(qū)與膜脂相互作用, 影響籽粒脫水過程中造粉體脂雙層膜的穩(wěn)定性, 使其不會被完全破壞, 阻礙了淀粉顆粒與蛋白質(zhì)基質(zhì)的結(jié)合, 而突變的PIN蛋白的脂結(jié)合能力降低, 造粉體膜的穩(wěn)定性降低, 淀粉顆粒與蛋白質(zhì)框架結(jié)合更直接、牢固, 從而使籽粒硬度增加[22]。淀粉表面極性脂在PIN蛋白與淀粉表面結(jié)合中的發(fā)揮重要媒介作用, 且在軟麥中含量高于硬麥[23-24]。本研究在淀粉顆粒表面也觀察到一些附著物, 可能是一些脂質(zhì)或者蛋白, 推測其VIN蛋白可能在裸燕麥籽粒硬度中發(fā)揮與PIN蛋白類似的功能, 其作用模式有待進(jìn)一步研究。

經(jīng)粒度分析表明, 裸燕麥淀粉顆粒包含小、中及大淀粉粒3種粒型, 這與小麥、水稻和玉米等[17]的研究相似。不同的是, 水稻、玉米的淀粉粒的體積和表面積呈三峰和雙峰分布, 小麥的體積呈微弱的四峰分布, 表面積呈三峰分布, 而裸燕麥的淀粉粒的數(shù)量、體積和表面積均呈現(xiàn)單峰分布。小麥胚乳淀粉基本上由小淀粉粒(粒徑<5 μm)組成, 而裸燕麥由小(粒徑<6 μm)和中淀粉粒(6～40 μm)共同組成, 但軟質(zhì)燕麥的小粒淀粉比例顯著高于硬質(zhì)裸燕麥, 造成這種差異的原因有待進(jìn)一步研究。

淀粉、脂質(zhì)和蛋白三者的結(jié)合方式是脂質(zhì)中脂肪酸的具有疏水性的烴鏈進(jìn)入直鏈淀粉螺旋空腔中,與直鏈淀粉結(jié)合, 而在螺旋空腔外的具有極性的羧基, 可以和蛋白質(zhì)的帶電基團(tuán)通過靜電作用結(jié)合, 從而將兩者連接起來, 形成淀粉-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物[25-26]。有研究表明, 籽粒中單半乳糖甘油二酯(monogalactosyl diglyceride, MGDG)和雙半乳糖甘油二酯(digalactosyl diglyceride, DGDG)含量與小麥[27]和玉米[28]籽粒胚乳質(zhì)地緊密相關(guān)。MGDG與小麥籽粒硬度呈負(fù)相關(guān), 而DGDG與之呈現(xiàn)正相關(guān)[29]。本研究推測, 裸燕麥籽粒成熟過程中, 軟質(zhì)裸燕麥的造粉體形成更多的小淀粉粒, 比表面積更大, 可以通過膜脂與更多的VIN蛋白進(jìn)行結(jié)合, 而VIN蛋白越多, 穩(wěn)定了造粉體的脂雙層膜, 從而使得胚乳結(jié)構(gòu)松弛, 空隙較大, 硬質(zhì)裸燕麥VIN蛋白少, 膜穩(wěn)定性降低而降解, 淀粉和蛋白質(zhì)基質(zhì)的結(jié)合更加緊密。

4 結(jié)論

裸燕麥成熟籽粒中支鏈淀粉含量與籽粒硬度呈正相關(guān); 淀粉顆粒的粒度分布影響籽粒硬度, 軟質(zhì)裸燕麥中、小淀粉粒的數(shù)量、表面積和體積百分比均高于硬質(zhì)裸燕麥; Vromindoline等蛋白位于裸燕麥淀粉顆粒表面, 且在軟質(zhì)裸燕麥中的含量高于硬質(zhì)裸燕麥。

[1] 陳鋒, 李根英, 耿洪偉, 夏蘭芹, 夏先春, 何中虎. 小麥籽粒硬度及其分子遺傳基礎(chǔ)研究回顧與展望. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 38: 1088–1094. Chen F, Li G Y, Geng H W, Xia L Q, Xia X C, He Z H. Review and prospect of wheat grain hardness and its molecular genetic basis., 2005, 38: 1088–1094 (in Chinese with English abstract).

[2] 安江紅, 張文靜, 趙瑛琳, 韓冰, 南金生. 麥類作物籽粒硬度的研究進(jìn)展. 北方農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2020, 48(4): 40–47. An J H, Zhang W J, Zhao Y L, Han B, Nan J S. Research progress on the grain hardness ofcrops., 2020, 48(4): 40–47 (in Chinese with English abstract).

[3] Peltonen-sainio, Muurinen S, Vilppu M, Rajala A, Gates F, Kirkkari A. Germination and grain vigor of naked oat in response to grain moisture at harvest., 2001, 127: 147–156.

[4] Stenvert N L, Kingswood K. The influence of the physical structure of the protein matrix on wheat hardness., 1977, 28: 11–19.

[5] Barlow K K, Buttrose M S, Simmonds D H, Vesk M. The nature of the starch-protein interface in wheat endosperm., 1973, 50: 443–454.

[6] Greenwell P, Schofield J D. A Starch granule protein associated with endosperm softness in wheat., 1986, 63: 379–380.

[7] 郭世華. 中國小麥籽粒硬度的生化和分子標(biāo)記研究. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 山東泰安, 2003. pp 6–7. Guo S H. Biochemical and Molecular Markers of Chinese Wheat Grain Hardness. PhD Dissertation of Graduate School of Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong, China, 2003. pp 6–7 (in Chinese with English abstract).

[8] Blochet J E,Chevalier C, Forest E, Pebay-Peyroula E, Gautier M F, Joudrier P, Pézolet M, Marion D. Complete amino acid sequence of puroindoline, a new basic and cystine-rich protein with a unique tryptophan-rich domain, isolated from wheat endosperm by Triton X-114 phase partitioning., 1993, 329: 336–340.

[9] Marion D, Clark D C. Wheat lipids and lipid-binding proteins: structure and function., 1995: 245–260.

[10] Bhave M, Morris C F. Molecular genetics of puroindolines and related genes: regulation of expression, membrane binding properties and applications., 2008, 66: 221–231.

[11] Gazza L, Taddei F, Conti S, Gazzelloni G, Muccilli V, Janni M, D’Ovidio R, Alfieri M, Redaelli R, Pogna N E. Biochemical and molecular characterization of Avena indolines and their role in kernel texture., 2015, 290: 39–54.

[12] 安江紅, 張文靜, 楊曉虹, 南金生, 楊燕, 閆明霞, 韓冰. 2種裸燕麥籽粒硬度測定方法比較. 作物雜志, 2021, (6): 28–35.An J H, Zhang W J, Yang X H, Nan J S, Yang Y, Yan M X, Han B. Comparison of two methods for measuring grain hardness of naked oats., 2021, (6): 28–35 (in Chinese with English abstract).

[13] 劉剛. 燕麥淀粉和蛋白的提取及理化性質(zhì)研究. 武漢工業(yè)學(xué)院碩士學(xué)位論文, 湖北武漢, 2008. pp 9–12. Liu G. Extraction and Physicochemical Properties of Oat Starch and Protein. MS Thesis of Graduate School of Wuhan Institute of Technology, Wuhan, Hubei, China, 2008. pp 9–12 (in Chinese with English abstract).

[14] 霍華蕾, 郭堅, 羅杰, 何光源. 種子中Puroindoline蛋白的SDS-PAGE分析. 生物技術(shù)通訊, 2005, (2): 153–155. Huo H L, Guo J, Luo J, He G Y. SDS-PAGE analysis of Puroindoline protein in seed., 2005, (2): 153–155 (in Chinese with English abstract).

[15] 王子寧, 郭北海. 小麥地方品種SDS-PAGE分析. 華北農(nóng)學(xué)報, 1992, (2): 35–39. Wang Z N, Guo B H. SDS-PAGE Analysis of Wheat Landraces., 1992, (2): 35–39 (in Chinese with English abstract).

[16] 王霞霞, 柴守璽, 常磊, 柴繼寬, 徐智明. 燕麥種子蛋白質(zhì)組的GeLC-MS/MS分析. 草地學(xué)報, 2012, 20(1): 108–115. Wang X X, Chai S X, Chang L, Chai J K, Xu Z M. GeLC-MS/MS analysis of oat seed proteome., 2012, 20(1): 108–115 (in Chinese with English abstract).

[17] 徐云姬, 李銀銀, 錢希旸, 王志琴, 楊建昌. 三種禾谷類作物強(qiáng)、弱勢粒淀粉粒形態(tài)與粒度分布的比較. 作物學(xué)報, 2016, 42: 70–81. Xu Y J, Li Y Y, Qian X Y, Wang Z Q, Yang J C. Comparison of starch grain morphology and size distribution in superior and inferior grains of three cereal crops., 2016, 42: 70–81 (in Chinese with English abstract).

[18] Bordier C. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution., 1981, 256: 1604–1607.

[19] Gautier M F, Aleman M E, Guirao A, Marion D, Joudrier P.puroindolines, two basic cystine-rich seed proteins: cDNA sequence analysis and developmental gene expression., 1994, 25: 43–57.

[20] 常成, 張海萍, 李保云, 劉廣田. 小麥籽粒發(fā)育時期Puroindolines蛋白與硬度的關(guān)系. 麥類作物學(xué)報, 2007, 27: 630–633. Chang C, Zhang H P, Li B Y, Liu G T. The relationship between Puroindoline protein during grain development and kernel hardness of common wheat., 2007, 27: 630–633 (in Chinese with English abstract).

[21] 趙法茂, 蔡瑞國, 畢建杰, 肖軍, 王憲澤. 小麥籽粒淀粉分支酶同種型SBE IIb的亞細(xì)胞定位及遺傳多樣性. 作物學(xué)報, 2009, 35: 952–957. Zhao F M, Cai R G, Bi J J, Xiao J, Wang X Z. Subcellular localization and genetic polymorphism of isoform of starch branching enzyme (SBE IIb) in wheat grain., 2009, 35: 952–957 (in Chinese with English abstract).

[22] Lillemo M, Morris C. A leucine to proline mutation in Puroindoline b is frequently present in hard wheats from northern Europe., 2000, 100: 1100–1107.

[23] 秦海霞. 小麥淀粉表面極性脂對籽粒硬度的影響及其生理機(jī)制. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 河南鄭州, 2017. pp 2–3. Qin H X. Effects of Surface Polar Lipids on Wheat Starch on Grain Hardness and Its Physiological Mechanism. MS Thesis of Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan, China, 2017. pp 2–3 (in Chinese with English abstract).

[24] Ma D Y, Qin H X, Ding H N, Zhang J, Wang C Y, Guo T C. Surface lipids play a role in the interaction of puroindolines with wheat starch and kernel hardness., 2016, 93: 523–528.

[25] Zhang G, Hamaker B R. A three component interaction among starch, protein, and free fatty acids revealed by pasting profiles., 2003, 51: 2797–2800.

[26] Zhang G, Hamaker B R. Sorghum (L. Moench) flour pasting properties influenced by free fatty acids and protein., 2005, 82: 534–540.

[27] Finnie S, Jeannotte R, Morris C, Faubion J M. Variation in polar lipid composition among near-isogenic wheat lines possessing different puroindoline haplotypes., 2010, 51: 66–72.

[28] Wang H H, Huagn Y C, Xiao Q, Huang X, Li C S, Gao X Y, Wang Q, Xiang X L, Zhu Y D, Wang J C, Wang W Q, Larkins B A, Wu Y R. Carotenoids modulate kernel texture in maize by influencing amyloplast envelope integrity., 2020, 11: 5346.

[29] Ohm J, Chung O. Relationships of free lipids with quality factors in hard winter wheat flours., 2002, 79: 274–278.

Relationship between the starch properties and its surface-bound proteins in grains with hardness inL.

NAN Jin-Sheng1, AN Jiang-Hong1,2, CHAI Ming-Na1, JIANG Yu-Lian1, ZHU Zhi-Qiang1, YANG Yan1, and HAN Bing1,*

1Key Laboratory of Wheat Germplasm Innovation and Utilization Autonomous Region Higher School / Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia, China;2Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry Science, Hohhot 010018, Inner Mongolia, China

Kernel hardness can reflect the texture of wheat kernels and it is closely related to its milling performance and edible quality. The objective of this study is to explore the relationship between naked oat (L.) grain starch properties and its surface-bound proteins with grain hardness. In this experiment, to determine the content of total starch, amylopectin and amylose, observe the characteristics and particle size of starch granules, and identify the surface-bound proteins of starch granules by mass spectrometry, five soft and five hard naked oat germplasms were used as the materials. The results showed that the shapes of starch granules in mature grains were round, oval and irregular, and the number, volume and surface area of starch granules showed a unimodal distribution. The size of starch granules could be divided into small (particle size < 6 μm), medium (6–40 μm), and large starch granules (particle size > 40 μm). Naked oat grains were mainly composed of small and medium starch granules. The grain size distribution of starch in naked oat grains with different hardness was different. The number and volume percentage of small starch granules in soft naked oat were higher than those in hard, and the number and volume percentage of medium and large starch grains were lower than those in hard. The percentage of surface area of soft naked oat small and medium starch granules was higher than that of hard, and the percentage of surface area of large starch granules was lower than that of hard. There was a significant positive correlation between the grain hardness of naked oat and the amylopectin content. The results showed that the protein content of the starch granule surface with a size of 14 kD was higher in soft oats than in hard ones. A total of 41 proteins were identified by HPLC/MS for starch granule surface-binding proteins at 14 kD, including Vromindoline protein and oat alpha amylase trypsin inhibitor. The above results showed that the starch content, particle size distribution and starch surface-bound protein in naked oat grains were all related to grain hardness. The higher the amylopectin content, the greater the number, surface area and volume distribution of small starch granules. The higher the protein content such as Vromindoline, and the softer the naked oat kernel. This study laid the foundation for revealing the formation mechanism of grain hardness inL.

L.; grain hardness; starch particle size; Vromindoline; HPLC/MS

2022-10-05;

2023-02-10;

2023-02-27.

10.3724/SP.J.1006.2023.21064

通信作者(Corresponding author):韓冰, E-mail: hb_nmg@163.com

E-mail: 470917658@qq.com

本研究由國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目(2022YFE0119800), 麥類種質(zhì)創(chuàng)新利用自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗室和“飼用作物及有益微生物種質(zhì)資源與分子育種”團(tuán)隊經(jīng)費(fèi)項目(TD202103)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2022YFE0119800), the Key Laboratory of Wheat Germplasm Innovation and Utilization Autonomous Region Higher School, and Forage Crops and Beneficial Microorganism Germplasm Resources and Molecular Breeding Team Funding (TD202103).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20230226.1541.002.html

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