楊祖凡，楊 揚(yáng)，楊義芳，康興東，李小峰，吳永忠，肖軍平，王 穩(wěn)，賈強(qiáng)強(qiáng)*，周 斌*

UHPLC同時(shí)測定不同產(chǎn)地和不同采收期裸花紫珠及同屬植物中9種活性成分的含量與質(zhì)量評(píng)價(jià)

楊祖凡1, 2，楊 揚(yáng)3，楊義芳3，康興東4，李小峰4，吳永忠4，肖軍平4，王 穩(wěn)1，賈強(qiáng)強(qiáng)1*，周 斌3*

1. 青海大學(xué)三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016 2. 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001 3. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 201203 4. 江西普正藥業(yè)有限公司，江西 吉安 331409

利用UHPLC-UV建立裸花紫珠藥材中9個(gè)活性成分同時(shí)定量的方法，并測定其在不同產(chǎn)地及不同采收期裸花紫珠中的含量，用于裸花紫珠藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及產(chǎn)地、采收期的選擇。采用Phenomenex kintex XB-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；體積流量0.3 mL/min；檢測波長332 nm和210 nm；柱溫為45 ℃；測定了83批裸花紫珠和7批同屬不同種紫珠屬樣品中的9個(gè)活性成分含量。結(jié)合主成分分析及正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）對(duì)裸花紫珠進(jìn)行全面分析。建立了裸花紫珠中9個(gè)活性成分含量同時(shí)測定的方法。其中咖啡酸、木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草素-4'--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3'--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素、藿香黃酮醇和熊果酸分別在1.240～124.0、2.040～204.0、1.020～101.6、5.100～510.0、0.904 0～90.40、0.982 0～98.20、0.872 0～87.20、0.822 0～82.20、2.280～228.0 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD值均小于3.00%，平均加樣回收率在95.58%～101.73%，回收率RSD值均小于2.50%。主成分分析篩選出2個(gè)主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率為77.33%，表明這2個(gè)主成分可包含原有數(shù)據(jù)的大多數(shù)信息；OPLS-DA法標(biāo)記出裸花紫珠藥材中的4個(gè)差異性成分，分別為咖啡酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和熊果酸。建立的多成分含量測定方法適用于裸花紫珠的質(zhì)量評(píng)價(jià)，為裸花紫珠質(zhì)量控制及相關(guān)經(jīng)典名方開發(fā)提供參考。

裸花紫珠；UHPLC-UV；主成分分析；多成分含量測定；苯丙烯酸類；黃酮類；咖啡酸；木犀草苷；連翹酯苷B；毛蕊花糖苷；木犀草素-4'--β--吡喃葡萄糖苷；木犀草素-3'--β--吡喃葡萄糖苷；木犀草素；藿香黃酮醇；熊果酸

裸花紫珠Hook. et Arn.是馬鞭草科紫珠屬L.植物，其干燥葉可入藥，生長于海拔1200 m及以下的平原、山坡、谷地、林地中，主要分布在中國廣東、廣西、海南、江西等地[1-2]，其提取物具有抗炎、抗菌、保護(hù)神經(jīng)、抗氧化和鎮(zhèn)痛等作用[3-12]。對(duì)裸花紫珠有效成分的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道，主要集中在利用比色法[13]、分光光度法[14-17]對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測定，或使用HPLC對(duì)毛蕊花糖苷、木犀草苷等少數(shù)指標(biāo)成分進(jìn)行定量[18-20]。但由于藥材成分復(fù)雜，單一指標(biāo)成分專屬性不強(qiáng)，難以反映藥材的整體質(zhì)量。因此，有必要建立中藥裸花紫珠多指標(biāo)成分含量測定的方法。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道苯丙素類、黃酮類和萜類等化合物為裸花紫珠藥材的主要活性成分[21-26]。結(jié)合本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)裸花紫珠指紋圖譜的研究結(jié)果[27-28]，最終確定使用UHPLC-UV方法對(duì)裸花紫珠中9個(gè)主要活性成分同時(shí)進(jìn)行定量分析，包括3個(gè)苯丙烯酸類（咖啡酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷），5個(gè)黃酮類（木犀草苷、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素和藿香黃酮醇），以及1個(gè)三萜類（熊果酸）化合物。本研究分別優(yōu)化了供試品提取條件與色譜條件，開發(fā)了9種活性成分同時(shí)定量的方法，并進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證。最后，利用該方法對(duì)不同產(chǎn)地及采收時(shí)間的83批裸花紫珠和同一時(shí)期采收的7批同屬不同種紫珠屬樣品進(jìn)行了比較分析，探索了各活性成分的差異和變化規(guī)律，對(duì)其內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)價(jià)。相較于以往的報(bào)道[29-30]，本研究在多指標(biāo)成分定量分析時(shí)選擇的指標(biāo)成分更多，收集樣本更全，研究數(shù)據(jù)更豐富。并采用了化學(xué)模式識(shí)別分析，OPLS-DA法標(biāo)記出裸花紫珠藥材中的4個(gè)差異性成分，可能是導(dǎo)致裸花紫珠質(zhì)量產(chǎn)生差異的關(guān)鍵因素，可以更好的為裸花紫珠的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY ARC型超高效液相色譜儀，配有二元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（美國沃特世公司）；CPA225D型十萬分之一天平（塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）；PB1501-N型萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；800Y型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市鉑歐五金制品有限公司）。

1.2 材料

乙腈、甲酸（美國ACS公司，色譜純）；甲醇（上海泰坦科技股份有限公司，分析純）；屈臣氏蒸餾水（北京屈臣氏蒸餾水有限公司）。毛蕊花糖苷（批號(hào)M-011-170315，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98.0%）和連翹酯苷B（批號(hào)L-013-170421，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98.0%）對(duì)照品均購于成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草苷（批號(hào)PR F8030242，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98.0%）和咖啡酸（批號(hào)PR F7102121，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98.0%）對(duì)照品均購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；熊果酸對(duì)照品（批號(hào)PR F8002125，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98.0%）對(duì)照品購于寶雞辰光生物科技有限公司；木犀草素-4'--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3'--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素和藿香黃酮醇對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；83批不同產(chǎn)地和不同采收時(shí)間的裸花紫珠樣品（S1～S83）經(jīng)江西普正制藥有限公司吳永忠研究員鑒定為馬鞭草科裸花紫珠Hook. et Arn.的干燥葉，另外7批同屬不同種紫珠屬樣品（S84～S90）也由吳永忠研究員鑒定為大葉紫珠Vahl.、廣東紫珠Chun、杜虹花紫珠Rolfe、小葉紫珠(Lour.) K. Koch和枇杷葉紫珠Makino的干燥葉，密封后保存于陰涼干燥處，樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取咖啡酸、木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′-β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素、藿香黃酮醇和熊果酸對(duì)照品一定量，溶于80%甲醇配制混標(biāo)溶液。精密吸取混標(biāo)溶液0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 mL置于10 mL量瓶中，搖勻，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過，作為儲(chǔ)備液，保存于4 ℃下。

2.1.2 供試品溶液制備 裸花紫珠樣品粉碎，過40目篩，稱取樣品粉末約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇水溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W、頻率40 kHz）提取45 min，放冷，80%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

表1 裸花紫珠及7批同屬不同種植物的樣品信息

Table 1 Sample information of C. nudiflora and seven batches of different species of Callicarpa

編號(hào)種產(chǎn)地采收日期編號(hào)種產(chǎn)地采收日期編號(hào)種產(chǎn)地采收日期 S1裸花紫珠海南白沙2016-09-15S31裸花紫珠海南五指山2016-12-30S61裸花紫珠江西上猶2016-12-15 S2裸花紫珠海南白沙2016-10-15S32裸花紫珠海南五指山2017-03S62裸花紫珠廣東2016-03-30 S3裸花紫珠海南白沙2016-10-20S33裸花紫珠海南五指山2017-04-15S63裸花紫珠廣東惠東2014 S4裸花紫珠海南白沙2016-10-25S34裸花紫珠海南五指山2017-08-12S64裸花紫珠廣東惠東2014-11 S5裸花紫珠海南白沙2016-11-18S35裸花紫珠海南五指山2017-08-20S65裸花紫珠廣東惠東2016-07-30 S6裸花紫珠海南白沙2016-11-30S36裸花紫珠海南白沙2015-11-30S66裸花紫珠廣東惠東2016-10-30 S7裸花紫珠海南白沙2016-12-15S37裸花紫珠海南白沙2015-12-15S67裸花紫珠廣東惠東2017-04-22 S8裸花紫珠海南白沙2016-12-30S38裸花紫珠海南白沙2015-12-30S68裸花紫珠廣東惠東2017-08-20 S9裸花紫珠海南白沙2017-01S39裸花紫珠海南白沙帶桿2017-04-10S69裸花紫珠廣東惠州2016-11 S10裸花紫珠海南白沙2017-01-12S40裸花紫珠海南白沙惠芬2016-09S70裸花紫珠廣東惠州綠天然2016-11 S11裸花紫珠海南白沙2017-02S41裸花紫珠海南白沙智豐2016-09S71裸花紫珠廣東惠州綠天然2017-01 S12裸花紫珠海南白沙2017-02-01S42裸花紫珠海南五指山2015-12-30S72裸花紫珠（帶枝）廣東惠州綠天然2016-11-21 S13裸花紫珠海南白沙2017-03-15S43裸花紫珠海南五指山機(jī)場2016-04-20S73裸花紫珠江西安福彭錦云2016-06 S14裸花紫珠海南白沙2017-03-20S44裸花紫珠江西普正藥業(yè)菜園2016-09-14S74裸花紫珠江西贛州2016-07 S15裸花紫珠海南白沙2017-04S45裸花紫珠江西普正藥業(yè)菜園2016-10-15S75裸花紫珠江西贛州2016-07-31 S16裸花紫珠海南白沙2017-04-01S46裸花紫珠江西普正藥業(yè)菜地2016-11-15S76裸花紫珠江西峽江2015-11-01 S17裸花紫珠海南白沙2017-04-12S47裸花紫珠江西普正藥業(yè)菜園2016-11-29S77裸花紫珠江西峽江2014-11-08 S18裸花紫珠海南白沙2017-04-15S48裸花紫珠江西普正藥業(yè)菜地2016-12-15S78裸花紫珠江西峽江2016-10 S19裸花紫珠海南白沙2017-08-01S49裸花紫珠江西普正藥業(yè)藥園2016-12-29S79裸花紫珠江西峽江2016-11 S20裸花紫珠海南白沙2017-08-15S50裸花紫珠江西普正藥業(yè)藥園2016-09-14S80裸花紫珠江西峽江2016-11-29 S21裸花紫珠海南白沙2017-08-20S51裸花紫珠江西普正藥業(yè)藥園2016-10-15S81裸花紫珠江西峽江2016-12-15 S22裸花紫珠海南五指山2016-09-15S52裸花紫珠江西普正藥業(yè)藥園2016-10-31S82裸花紫珠江西峽江2017-07-25 S23裸花紫珠海南五指山2016-09-15S53裸花紫珠江西普正藥業(yè)藥園2016-11-15S83裸花紫珠江西峽江藥園2017-06-06 S24裸花紫珠海南五指山2016-09-30S54裸花紫珠江西普正藥業(yè)藥園2016-11-29S84大葉紫珠帶枝貴州2017-06 S25裸花紫珠海南五指山2016-10-25S55裸花紫珠江西普正藥業(yè)藥園2016-12-29S85大葉紫珠全葉貴州2017-06 S26裸花紫珠海南五指山2016-10-30S56裸花紫珠江西上猶2016-09-15S86杜虹花紫珠云南昭通2017-06 S27裸花紫珠海南五指山2016-11-15S57裸花紫珠江西上猶2016-10-15S87廣東紫珠峽江藥園2017-06-06 S28裸花紫珠海南五指山2016-11-30S58裸花紫珠江西上猶2016-11-01S88枇杷葉紫珠峽江藥園2017-06-06 S29裸花紫珠海南五指山2016-12-15S59裸花紫珠江西上猶2016-11-10S89小葉紫珠大葉型峽江藥園2017-06-06 S30裸花紫珠海南五指山2016-12-15S60裸花紫珠江西上猶2016-12-01S90小葉紫珠峽江藥園2017-06-06

2.2 色譜條件

色譜分離采用Phenomenex kintex XB-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相為（A）0.1%磷酸水溶液和（B）乙腈。梯度洗脫：0～5 min，8%～13% B；5～15 min，13% B；15～20 min，13～16% B；20～35 min，16%～22% B；35～45 min，22%～30% B；45～50 min，30%～50% B；50～55 min，50%～65% B；55～65 min，65%～100% B；65～75 min，100% B。體積流量為0.3 mL/min；柱溫45 ℃，進(jìn)樣量2 μL。檢測波長為332 nm和210 nm?；旌蠈?duì)照品及樣品的色譜圖見圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍、檢測限（LOD）與定量限（LOQ） 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下7個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液各2 μL，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）繪制傳統(tǒng)曲線?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2。將混合對(duì)照品溶液逐步稀釋，分別以信噪比（S/N）＝3和S/N＝10時(shí)各對(duì)照品的質(zhì)量濃度作為LOD和LOQ，結(jié)果見表2。

2.3.2 精密度考察 精密稱取S1樣品粉末0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算各組分峰面積的RSD，9個(gè)組分的RSD值依次為咖啡酸0.81%、木犀草苷0.35%、連翹酯苷B 1.24%、毛蕊花糖苷0.49%、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷0.31%、木犀草素-3′--β--吡喃葡萄糖苷0.35%、木犀草素1.03%、藿香黃酮醇0.50%、熊果酸0.67%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 精密稱取S1樣品粉末6份，每份0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)平行制備6份供試品溶液。每份供試品溶液按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。測得各成分質(zhì)量濃度的RSD值分別為咖啡酸1.29%、木犀草苷2.95%、連翹酯苷B 2.02%、毛蕊花糖苷1.20%、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷2.24%、木犀草素-3′--β--吡喃葡萄糖苷2.27%、木犀草素1.27%、藿香黃酮醇1.18%、熊果酸2.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

1-咖啡酸 2-木犀草苷 3-連翹酯苷B 4-毛蕊花糖苷 5-木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 6-木犀草素-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 7-木犀草素 8-藿香黃酮醇 9-熊果酸，圖3同

表2 裸花紫珠中9個(gè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍、LOQ和LOD

Table 2 Regression equations, correlation coefficients and linearity ranges, limit of quantitation and limit of detection of nine components in C. nudiflora

對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線R2線性范圍/(μg·mL?1)LOQ/(μg·mL?1)LOD/(μg·mL?1) 咖啡酸Y＝31 210.60 X＋12.190.999 81.240 0～124.000.0410.012 木犀草苷Y＝14 012.38 X＋10.820.999 52.040 0～204.000.1700.051 連翹酯苷BY＝9 390.23 X＋1.270.999 41.020 0～101.600.1710.051 毛蕊花糖苷Y＝10 431.76 X＋16.200.999 65.100 0～510.000.3410.102 木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷Y＝14 428.02 X＋2.310.999 50.904 0～90.400.1490.045 木犀草素-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷Y＝15 482.63 X＋5.590.999 70.982 0～98.200.1650.049 木犀草素Y＝21 512.33 X?4.970.999 90.872 0～87.200.1440.044 藿香黃酮醇Y＝16 056.27 X＋6.160.999 80.822 0～82.200.0550.012 熊果酸Y＝3 127.13 X＋7.480.999 4 2.280 0～228.000.1900.051

2.3.4 穩(wěn)定性考察 精密稱取S1樣品粉末0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)制備1份供試品溶液。分別于0、2、4、6、12、24 h按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算各組分峰面積的RSD。依次為咖啡酸2.50%、木犀草苷1.52%、連翹酯苷B 0.89%、毛蕊花糖苷2.37%、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷1.39%、木犀草素-3′--β--吡喃葡萄糖苷0.90%、木犀草素2.45%、藿香黃酮醇1.26%、熊果酸0.62%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各指標(biāo)成分含量已知的樣品粉末6份，每份0.25 g，按照樣品含量的100%水平分別加入咖啡酸、木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素、藿香黃酮醇和熊果酸峰對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各指標(biāo)成分的回收率。計(jì)算得咖啡酸、木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素、藿香黃酮醇和熊果酸的平均加樣回收率分別為101.60%、101.35%、97.30%、98.38%、100.64%、95.58%、98.14%、101.37%和97.43%。對(duì)應(yīng)的RSD分別為2.02%、1.83%、2.50%、1.78%、1.87%、0.83%、1.69%、1.70%和1.88%。

2.4 供試品溶液提取條件的優(yōu)化

采用單因素變量法，精密稱取7份裸花紫珠樣品粉末0.5 g，進(jìn)行提取溶劑優(yōu)化（溶劑分別為25 mL純水、20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、純甲醇，40 kHz、500 W超聲提取30 min）、超聲時(shí)間優(yōu)化（40 kHz、500 W分別超聲提取15、30、45、60、75、90 min）、提取液固比的優(yōu)化（分別加入10、25、40、50、65、75 mL 50%甲醇，40 kHz、500 W超聲提取30 min），按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，分別對(duì)峰面積進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)提取效果。最終確定最佳提取條件為0.5 g裸花紫珠樣品粉末加入25 mL 80%甲醇，超聲45 min。結(jié)果如圖2所示。

圖2 供試品溶液提取條件提取溶劑(A)、超聲時(shí)間優(yōu)化(B) 不同提取液固液比(C) 優(yōu)化

2.5 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.5.1 主成分分析 使用SPSS21.0軟件對(duì)83批裸花紫珠藥材中9種活性成分進(jìn)行主成分分析，得到 83×9階數(shù)據(jù)矩陣，以主成分特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，提取得到了2個(gè)主成分，其累積貢獻(xiàn)率為77.33%。第1主成分特征值為3.53，方差貢獻(xiàn)率為49.20%，根據(jù)因子載荷矩陣反映各主成分與原始變量之間的相關(guān)系數(shù)，可知第1主成分主要反映了毛蕊花糖苷、連翹酯苷B和咖啡酸的信息，表明其對(duì)第1主成分的影響較大，可為裸花紫珠的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)；第2主成分特征值為1.63，方差貢獻(xiàn)率為28.13%，主要反映了熊果酸和木犀草素的信息。分析結(jié)果表明，裸花紫珠的前2個(gè)主成分可概括原有數(shù)據(jù)的絕大部分信息。計(jì)算83批裸花紫珠樣品的主成分得分，以各主成分對(duì)應(yīng)的貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)計(jì)算綜合得分（1為第1主成分得分，2為第2主成分得分，為綜合得分），并進(jìn)行排序，結(jié)果見表3。綜合得分較高的前4位分別為批次S19、S83、S77和S55，其綜合得分均大于1，說明這4個(gè)批次的裸花紫珠樣品質(zhì)量較好，與其他樣品差異較大。

2.5.2 正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）以83批裸花紫珠的9個(gè)活性成分峰峰面積為變量，使用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果如圖3-A所示。OPLS-DA 載荷圖中的每個(gè)圓點(diǎn)代表一個(gè)化合物，化合物越遠(yuǎn)離原點(diǎn)，表示其在組間的差異性越大。從圖中可以看出，化合物1（咖啡酸）、化合物3（連翹酯苷B）、化合物4（毛蕊花糖苷）和化合物9（熊果酸）明顯偏離主化合物群，與主成分分析結(jié)果一致。通過設(shè)置VIP值大于1篩選出影響裸花紫珠成分差異的標(biāo)志性成分，結(jié)果見圖3-B。初步篩選出咖啡酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和熊果酸4個(gè)差異成分，這與載荷圖的結(jié)果相一致。表明以上成分可能是導(dǎo)致裸花紫珠質(zhì)量產(chǎn)生差異的關(guān)鍵因素。

表3 83批裸花紫珠的主成分因子得分和排序

Table 3 Factor scores and sorting of principal component factors of 83 batches of C. nudiflora

編號(hào)Y1Y2Y排名編號(hào)Y1Y2Y排名 S10.35 0.230.1850S430.42 0.230.2143 S20.35 0.180.1754S440.81 0.120.3429 S30.22 0.290.1458S450.21 0.040.0973 S40.28 0.260.1655S460.59?0.140.2145 S50.07 0.310.0875S470.58 0.100.2540 S60.23 0.010.0971S481.28?0.260.4520 S70.29 0.010.1263S491.78?0.470.6114 S80.30 0.000.1262S500.57 0.230.2737 S91.32 0.150.5416S510.41 0.250.2144 S100.59 0.220.2735S520.28 0.030.1264 S111.08 0.110.4421S530.78 0.110.3331 S121.14 0.100.4719S541.29 0.030.5117 S130.35 0.260.1848S552.74?0.231.03 4 S140.44 0.220.2142S560.53 0.150.2341 S150.39 0.260.2046S570.69?0.080.2638 S160.36 0.220.1849S580.73?0.080.2734 S171.01 0.100.4124S590.71 0.090.2933 S180.34 0.240.1851S601.27?0.170.4718 S194.17?0.481.55 1S611.94?0.110.7411 S200.32 0.260.1753S622.16?0.300.79 8 S210.82 0.180.3527S630.20 0.230.1261 S220.17 0.220.1168S640.18 0.330.1359 S230.19 0.300.1360S651.88?0.030.7313 S240.13 0.030.0678S660.81 0.170.3528 S250.11 0.010.0483S670.40 0.210.1947 S260.13 0.030.0678S680.94 0.190.4025 S270.11 0.040.0582S690.47 0.340.2539 S280.15 0.280.1166S700.81 0.280.3726 S290.12 0.030.0580S712.04 0.040.81 6 S300.12 0.030.0580S722.23 0.010.88 5 S310.22 0.300.1457S730.27 0.240.1556 S321.08 0.110.4421S740.07 0.270.0876 S331.99?0.030.77 9S750.11 0.240.0974 S341.05 0.170.4423S760.72?0.080.2736 S350.33 0.240.1752S773.07?0.251.16 3 S361.90?0.060.7312S780.14 0.260.1070 S371.50 0.020.5915S790.17 0.230.1167 S382.09?0.080.80 7S800.18 0.230.1165 S390.72 0.110.3032S810.12 0.320.1169 S400.06 0.240.0777S821.98?0.090.7610 S410.09 0.310.0972S833.33?0.321.25 2 S420.80 0.130.3430

2.6 裸花紫珠多成分含量測定

按照已驗(yàn)證的定量方法，對(duì)83批不同產(chǎn)地和不同采收時(shí)間的裸花紫珠樣品（S1～S83）進(jìn)行比較分析，結(jié)果見表4。通過比較海南白沙和五指山8月采收的樣品可知，海南白沙9個(gè)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.492 1%，毛蕊花糖苷占比86.22%，熊果酸占比4.53%，木犀草苷占比3.16%，連翹酯苷B苷占比2.40%，木犀草素- 4′--β--吡喃葡萄糖苷占比1.80%，木犀草素- 3′--β--吡喃葡萄糖苷占比1.10%，其他3個(gè)成分共占比0.78%，毛蕊花糖苷量高達(dá)8.1842%。而海南五指山9個(gè)成分總含量為4.921 2%，毛蕊花糖苷占比74.28%，熊果酸占比11.87%，連翹酯苷B苷占比4.56%，木犀草苷占比3.66%，木犀草素- 4′--β--吡喃葡萄糖苷占比2.74%，其他4個(gè)成分共占比2.89%。海南白沙8月份總含量比其他采集時(shí)間明顯更高，此時(shí)毛蕊花糖苷含量達(dá)到峰值，且均高于海南五指山的含量。由以上分析可知海南白沙裸花紫珠的品質(zhì)總體比海南五指山高出許多。

表4 83批裸花紫珠樣品的含量測定結(jié)果

Table 4 Results of determination of content of 83 batches of C. nudiflora

編號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 咖啡酸木犀草苷連翹酯苷B毛蕊花糖苷木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷木犀草素-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷木犀草素藿香黃酮醇熊果酸總量 S10.005 10.106 60.018 50.452 60.099 30.042 80.020 10.046 80.542 81.334 6 S20.001 90.088 50.021 90.498 40.097 00.032 60.018 80.048 40.461 41.268 9 S30.003 20.068 50.011 60.258 40.041 10.026 60.025 90.059 40.575 21.069 9 S40.004 40.070 80.014 80.367 10.067 10.022 40.025 20.050 80.581 01.203 6 S50.000 00.012 40.000 00.032 00.006 90.003 90.042 20.056 20.576 10.729 7 S60.002 30.079 60.014 70.360 20.066 40.027 40.020 20.050 00.038 40.659 2 S70.003 70.108 50.017 20.426 80.095 10.033 30.014 60.053 60.049 60.802 4 S80.004 90.102 70.019 90.442 50.102 30.034 70.020 60.059 00.037 70.824 3 S90.099 90.159 70.218 92.192 20.125 50.054 90.043 70.044 30.603 43.542 5 S100.010 30.081 30.039 50.979 80.077 50.026 60.022 60.057 50.594 51.889 6 S110.027 00.163 10.144 81.835 70.123 70.041 10.036 40.052 50.506 32.930 6 S120.026 20.284 90.135 91.844 30.140 70.042 40.040 40.051 60.488 13.054 5 S130.005 80.095 90.019 10.461 50.087 20.030 20.026 90.048 80.592 41.367 8 S140.011 30.097 80.024 90.650 00.094 30.031 00.023 50.046 80.559 01.538 6 S150.017 90.169 90.028 30.426 40.123 50.056 00.052 20.046 60.541 21.462 0 S160.018 10.096 60.028 00.448 90.156 20.035 90.037 80.046 00.544 71.412 2 S170.010 80.197 10.154 91.622 10.141 90.056 60.018 90.039 40.492 02.733 7 S180.004 60.076 70.053 60.454 80.070 70.027 00.025 40.035 60.552 51.300 9 S190.009 50.300 50.227 78.184 20.171 10.104 60.013 90.050 50.430 19.492 1 S200.003 40.131 70.023 00.351 40.114 50.049 40.028 40.067 70.547 61.317 1 S210.003 00.138 40.088 11.359 50.097 40.038 70.012 30.050 30.613 12.400 8 S220.001 20.043 20.004 70.188 10.051 10.015 30.018 20.046 40.478 80.847 0 S230.001 30.056 60.006 10.169 70.059 80.041 20.019 80.051 00.607 51.013 0 S240.001 70.059 60.005 70.181 00.053 10.019 70.018 70.047 60.049 10.436 2 S250.001 40.044 80.004 60.174 20.042 50.015 50.017 70.047 50.000 00.348 2 S260.001 30.053 10.006 30.189 80.049 60.018 10.019 80.049 20.044 80.432 0 S270.000 90.050 20.004 90.137 90.057 10.017 20.022 40.054 60.048 40.393 6 S280.001 10.049 10.002 90.126 50.056 30.017 00.023 90.047 20.584 10.908 1 S290.001 30.050 20.004 90.164 30.057 70.017 10.020 60.048 80.042 30.407 2 S300.001 30.050 20.004 90.164 30.057 70.017 10.020 60.048 80.042 30.407 2 S310.002 90.064 60.005 00.211 50.069 80.050 40.026 20.054 20.593 91.078 5 S320.034 00.189 60.118 51.792 20.154 20.055 80.062 60.036 00.498 92.941 8 S330.025 60.180 00.224 53.655 60.134 70.058 60.016 50.041 50.584 24.921 2 S340.014 80.217 10.097 21.708 40.150 80.062 40.029 20.057 60.615 92.953 4 S350.004 30.119 10.012 40.401 80.098 30.041 30.027 00.054 50.525 51.284 2 S360.046 40.211 30.214 83.422 60.187 60.062 20.026 70.045 70.482 44.699 7 S370.042 90.186 90.136 32.673 90.153 20.046 00.004 70.048 10.520 53.812 5 S380.054 40.234 60.158 23.833 00.193 60.069 10.038 50.046 90.494 95.123 2 S390.009 60.129 20.217 51.051 40.119 80.041 40.026 30.030 90.403 02.029 1 S400.000 00.016 20.000 00.039 80.009 20.006 60.044 70.048 10.433 90.598 5 S410.000 20.014 90.002 10.068 00.010 60.004 30.016 50.052 60.617 20.786 4 S420.026 10.129 70.044 81.351 60.131 00.038 40.017 90.048 70.514 92.303 1 S430.011 00.106 10.043 70.577 10.095 80.039 00.029 60.040 30.559 11.501 7 S440.005 10.148 10.102 11.359 00.061 10.039 50.007 50.048 00.457 82.228 2 S450.005 00.093 30.008 00.302 70.063 90.037 50.034 30.051 90.037 80.634 4 S460.005 10.091 90.025 10.987 30.316 10.042 60.005 80.044 50.042 91.561 3 S470.004 80.066 90.010 31.056 70.018 20.033 00.003 20.031 10.345 91.570 1 S480.003 00.075 10.041 22.238 70.701 40.042 20.002 10.032 30.363 03.499 0 S490.001 10.091 80.084 63.075 91.128 60.028 50.005 70.030 20.447 14.893 5 S500.015 60.280 10.097 90.626 50.125 00.074 60.018 90.057 00.509 11.804 7 S510.009 00.219 50.028 00.400 60.153 20.080 00.022 00.054 00.546 61.512 9 S520.006 10.129 70.021 00.363 40.111 80.044 00.048 70.060 00.047 40.832 1 S530.009 40.153 40.071 81.275 80.146 40.039 00.004 10.050 40.480 72.231 0 S540.009 20.179 80.083 62.289 00.162 30.051 00.005 20.047 20.493 03.320 3

續(xù)表4

將江西地區(qū)同年9月到12月樣品進(jìn)行比較分析可知，12月樣品其總含量比其它采集時(shí)間明顯更高，江西普正藥業(yè)菜園、藥園和江西上猶9個(gè)成分總含量分別為4.893 5%、6.431 8%和4.613 8%，且毛蕊花糖苷、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷、熊果酸和木犀草苷這4個(gè)成分含量比其他采集時(shí)間明顯更高。且海南白沙11～12月9個(gè)成分總含量與江西上猶和普正藥業(yè)藥園11～12月9個(gè)成分總含量趨勢(shì)相似。12月在海南白沙中9個(gè)成分總含量為5.123 2%。

此外，本實(shí)驗(yàn)還測定了另外22批其他產(chǎn)地的裸花紫珠樣品（S62～S83），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算樣品含量，測定結(jié)果均在線性范圍內(nèi)（除咖啡酸、連翹酯苷）。且江西峽江2016年10月到12月樣品中9中活性成分的總含量與江西以南其它地區(qū)吉安、上猶不盡相同，而2017年和2014年總含量變化也基本遵循吉安、上猶規(guī)律。

通過對(duì)5種紫珠屬其他樣品的9種活性成分進(jìn)行初步比較分析（表5），其咖啡酸、木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′--β--吡喃葡、木犀草素、藿香黃酮醇和熊果酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0～0.034 1%、0.000 6%～0.322 9%、0.0070%～1.549 4%、0.541 0%～6.563 1%、0.001 3%～1.140 0%、0.001 6%～0.0527%、0.002 3%～0.031 2%、0～0.059 9%和0.143 1%～0.648 9%?？芍瑢俨煌N紫珠屬植物所含化學(xué)成分種類基本一致，但成分含量存在一定差異性。與其他同屬不同種紫珠屬藥用植物相比裸花紫珠藥材中9種活性成分的總含量和毛蕊花糖苷含量均相對(duì)較高。

表5 紫珠屬其他藥用植物的9種成分的含量測定結(jié)果

Table 5 Results of content determination of nine components of other plants of Callicarpa

編號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 咖啡酸木犀草苷連翹酯苷毛蕊花糖苷木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷木犀草素-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷木犀草素藿香黃酮醇熊果酸總量 S840.000 00.009 10.172 10.849 60.001 60.007 20.005 80.020 00.143 21.208 6 S850.001 20.046 30.066 93.303 70.007 90.017 70.010 10.024 80.212 93.691 5 S860.003 90.224 00.032 31.802 00.509 20.026 50.006 60.001 00.557 63.163 1 S870.000 00.000 61.549 40.541 00.001 30.001 60.004 30.005 80.350 32.454 3 S880.000 00.001 40.008 40.751 90.095 90.003 70.002 30.025 00.326 61.215 2 S890.000 10.322 90.007 02.501 51.140 00.003 00.009 90.000 00.579 74.564 1 S900.000 00.177 00.196 75.321 81.027 90.008 80.002 50.012 80.648 97.396 4

3 討論

采用Waters UHPLC系統(tǒng)，用梯度洗脫法在較短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)進(jìn)行裸花紫珠中咖啡酸、木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草素-4′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′--β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素、藿香黃酮醇和熊果酸共9個(gè)活性成分含量同時(shí)測定的方法。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行前期色譜條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過采集200～400 nm全波長色譜圖并比較各化合物的紫外吸收強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)除熊果酸外其它化合物的最大吸收峰均在332 nm附近，并且在332 nm的色譜圖中這些化合物分離最好。而熊果酸在210 nm附近的吸收峰最高，但在332 nm波長下無紫外吸收。因此本實(shí)驗(yàn)最終采用雙波長進(jìn)行定量，即在332 nm波長下定量除熊果酸外的8個(gè)指標(biāo)成分，在210 nm波長下定量熊果酸。在進(jìn)行提取溶劑比例優(yōu)化、超聲時(shí)間優(yōu)化、提取液固比的優(yōu)化預(yù)試驗(yàn)后，比常用的HPLC[31]節(jié)省時(shí)間，大大提高了工作效率且減少了溶劑的消耗。并進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明9個(gè)活性分在各自的線性范圍內(nèi)線性良好（2＞0.9993），精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的RSD值均小于3.00%，平均加樣回收率在95.58%～101.73%，回收率的RSD值均小于2.50%。

采用本方法對(duì)不同產(chǎn)地及采收期的83批裸花紫珠藥材進(jìn)行比較分析。以9種活性成分含量為基礎(chǔ)構(gòu)建裸花紫珠的質(zhì)量評(píng)價(jià)函數(shù)進(jìn)行了主成分分析，可知江西峽江和海南白沙綜合評(píng)分較高，裸花紫珠質(zhì)量較好，其中丙烯酸類占總含量的85%以上，黃酮類占7%左右。但江西地區(qū)裸花紫珠藥材的數(shù)據(jù)只有9月到12月的數(shù)據(jù)，因此對(duì)于江西地區(qū)裸花紫珠藥材質(zhì)量的變化規(guī)律有待進(jìn)一步研究。此外，活性成分的積累規(guī)律與采收時(shí)間相關(guān)，毛蕊花糖苷等在春夏兩季積累較多，秋冬兩季較少，藿香黃酮醇、熊果酸含量隨采收時(shí)間變化不大。

綜上所述，產(chǎn)地和采收時(shí)間對(duì)活性成分含量影響極大，在不同樣本間活性成分雖然大致相同，但各成分含量相距甚遠(yuǎn)。為了確保裸花紫珠產(chǎn)品及新藥研發(fā)一致性，必須從藥材源頭嚴(yán)把關(guān)，建立藥材產(chǎn)地GAP種植基地及飲片加工GMP建設(shè)及相關(guān)配套設(shè)施。而本研究建立的活性成分含量測定方法靈敏、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可用于裸花紫珠藥材的質(zhì)量分析。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation offrom different origins, picking stages and other plants ofbased on simultaneous determination of nine active components by UHPLC

YANG Zu-fan1, 2, YANG Yang3, YANG Yi-fang3, KANG Xing-dong4, LI Xiao-feng4, WU Yong-zhong4, XIAO Jun-ping4, WANG Wen1, JIA Qiang-qiang1, ZHOU Bin3

1. State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture, Qinghai University, Xining 810016, China 2. Medical College of Qinghai University, Xining 810001, China 3. Shanghai Institute of Pharmceutical Industry, Shanghai 201203, China 4. Jiangxi Puzheng Pharmaceutical Co., Ltd., Ji’an 331409, China

An UHPLC-UV method was established for simultaneously determination of nine active components in, and compare samples from different origins and picking stages.Phenomenex Kintex XB-C18column were performed on HPLC analysis, the mobile phase was acetonitrile (A)-0.1% phosphoric acid (B) for gradient elution. The flow rate was 0.3 mL/min, the wavelength was 280 nm and 332 nm and the column temperature was 45 ℃. The contents of nine active components in 83 batches ofand seven batches of different species of medicinal plants ofwere measured simultaneously, combined with principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA), which were applied in the comprehensive analysis of.A method for simultaneous quantification of nine active components inwas established. Caffeic acid, luteoloside, forsythoside B, acteoside, luteolin-4'--β--glucopyranoside, luteolin-3′--β--glucopyranoside, luteolin, pachypodol and ursolic acid had good linearity in the range of 1.240—124.0 μg/mL, 2.040—204.0 μg/mL, 1.020—101.6 μg/mL, 5.100—510.0 μg/mL, 0.9040—90.40 μg/mL, 0.9820—98.20 μg/mL, 0.8720—87.20 μg/mL, 0.8220—82.20 μg/mL and 2.280—228.0 μg/mL, respectively. The RSD of precision, repeatability and stability was less than 3.00% and the average recovery value was between 95.58%—101.73%, with RSD less than 2.50%. Principal component analysis screened out two ingredients, and the cumulative variance contribution rate was 77.33%, indicating that the main ingredients contained the most information of the raw statistics. OPLS-DA screened out four differential components, including caffeic acid, forsythoside B, acteoside and ursolic acid.The established method of multi-component quantitative analysis can be applied to the quality assessment of, which also can provide reference for the quality control and the development of related prescriptions of.

Hook. et Arn.; UHPLC-UV; principal component analysis; multi-component quantitative analysis; phenylacrylic acids; flavonoids; caffeic acid; luteoloside; forsythoside B; acteoside; luteolin-4'--β--glucopyranoside; luteolin-3′--β--gluco- pyranoside; luteolin; pachypodol; ursolic acid

R286.2

A

0253 - 2670(2023)14 - 4631 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.024

2022-12-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31460082）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（R1402824）；國家中醫(yī)藥管理局（ZYBZH-C-JX-40）；青海省科技廳國際合作項(xiàng)目（2022-HZ-812）

楊祖凡（1998—），女，碩士研究生，主要從事藥物分析。E-mail: 1011724401@qq.com

賈強(qiáng)強(qiáng)，男，博士，副教授，主要從事藥物分析。E-mail: jia1108029@163.com

周 斌，男，博士，研究員，主要從事醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)政策與醫(yī)藥政策法規(guī)策略。E-mail: zhoubin@sinopharm.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]