黃秋楠，亢守亭，徐良騰，周長明，王 艷，葛仕豪，姜莉莉，樊兆斌*

（1.曹縣畜牧服務(wù)中心，山東菏澤 274400；2.菏澤學(xué)院藥學(xué)院，山東菏澤 274015；3.菏澤市禽免疫抑制病防控重點(diǎn)實驗室，山東菏澤 274015）

先天免疫是宿主抵抗病原入侵的第一道防線，模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRS）激活宿主的先天免疫反應(yīng)[1]。PRRs 被識別后，會觸發(fā)信號，導(dǎo)致I 型干擾素（Type I interferon，IFN-I）、干擾刺激基因（Interferon-stimulated genes，ISGs）和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[2]。干擾素基因刺激因子（Stimulator of Interferon Genes，STING）是天然免疫系統(tǒng)信號傳導(dǎo)過程中重要的銜接蛋白[3,4]，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，介導(dǎo)異常的細(xì)胞質(zhì)DNA 觸發(fā)的免疫信號傳導(dǎo)，對有效的先天免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程至關(guān)重要。STING 是天然免疫中重要的調(diào)節(jié)因子，作為連接病毒感應(yīng)受體和干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor 3，IRF3）的適配器[5]，能誘導(dǎo)IRF3 和TANK 結(jié)合激酶(TANK Binding Kinase，TBK1)的磷酸化激活并調(diào)控Ⅰ型干擾素和干擾素刺激基因的表達(dá)，對病原入侵引起的天然免疫應(yīng)答至關(guān)重要[6-8]。缺乏STING 的胚胎成纖維細(xì)胞限制RNA 病毒復(fù)制的能力降低[9]。目前針對哺乳動物STING 基因的研究較為廣泛，對雞STING 基因研究相對較少。該文旨在對雞STING基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，以期為STING編碼蛋白的抗病毒功能及其在固有免疫信號通路中的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

動物組織總RNA 提取試劑盒、FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒、2×Taq PCR Mastermix、D 2000 Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、pGM-T、T4 DNA 連接酶等均購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI 與HindIII 購自寶日醫(yī)學(xué)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank 已發(fā)表的雞STING 基因序列（KP893157.1），設(shè)計 STING 基因擴(kuò)增引STING-F/STING-R，STING-F：TAGGAATTCATGCCCCAGGACCCGTCAACCAGGAG（EcoRI），STING-R：TAAAGCTTTCAGGGGCAGTCACTGCG（HindIII），引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.2 雞STING 基因克隆及測序

提取雞組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，擴(kuò)增雞STING 基因。反應(yīng)體系50μL：2×Taq PCR Mastermix 25μL，cDNA 1μL，上、下游引物各1μL，雙蒸水22μL。PCR 程序：94℃5min；94℃30s，60℃45s，72℃80s，設(shè)35 個循環(huán)；72℃7min 后4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。經(jīng)膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，16℃過夜連接pGM-T 載體，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種LB（A+）平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單個圓滑白色菌落，PCR 驗證正確后送生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.3 STING 基因序列分析

測序結(jié)果用NCBI 中BLAST 程序進(jìn)行相似性比對；選取原雞（Gallus gallus，KP893157.1）綠頭鴨（Anas platyrhynchos，XM_027468121.2）、火雞（Meleagris gallopavo，XM_010718794.3）、日本鵪鶉（Coturnix japonica，XM_015876253.2）、盔珠雞（Numida meleagris，XM_021410148.1）、環(huán)頸雉（Phasianus colchicus，XM_031607086.1）、艾草松雞（Centrocercus urophasianus，XM_04281 5288.1）、馬（Equus caballus，XM_023617603.1）、牛（Bos taurus，KU695665.1）、綿羊（Ovis aries，XM_004008857.4）、羊 駝（Lama glama，JQ359755.1）、人（Homo sapiens，MF622062.1）、小鼠（Mus musculus，NM_028261.1）、大 鼠（Rattus norvegicus，NM_001109122.1）、家 貓（Felis catus，KU315474.1）等物種，利用DNAStar 和Mega 5.0 軟件進(jìn)行STING 基因相似性比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 STING 基因生物信息學(xué)分析

運(yùn) 用 ExPASy 在線軟件 ProtParam 和Protscale 在線軟件分析STING 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性；利用TMHMM2.0 在線軟件對蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析；用SignalP 5.0 預(yù)測蛋白信號肽，用PSORT II 分析蛋白的亞細(xì)胞定位；利 用NetPhos3.1 Server，NetOGlyc 4.0 和NetNGlyc 1.0 進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)及O、N 糖基化位點(diǎn)預(yù)測；利用SMART 程序推測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；利用STRING 在線工具分析STING 互作蛋白，利用SOPMA 在線工具預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL 預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 STING 基因CDs 區(qū)的克隆及序列分析

由圖1 可知，PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，在1000bp 以上出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期一致。應(yīng)用DNAMAN 軟件分析測序結(jié)果顯示，STING 基因CDs 區(qū)為1140bp，與NCBI 上發(fā)表的原雞STING基因序列同源性為99.9%，共編碼379 個氨基酸，堿基組成分別為A（17.54%）、C（33.86%）、G（30.35%）、T（18.25%）。

圖1 STING 基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 STING 基因序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

對Genbank 發(fā)表的不同物種STING 基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比對，結(jié)果顯示白來航雞STING 與原雞同源性最高（99.9%）；環(huán)頸雉（92.3%）、火雞（92.2%）、與盔珠雞（91.9%）、艾草松雞（91.1%）和日本鵪鶉（89.2%）同源性較高，與大鼠、小鼠、人、馬、牛、綿羊等物種同源性較低（＜60%）?；赟TING 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，白來航雞與艾草松雞親緣關(guān)系最近，與原雞、火雞、環(huán)頸雉、盔珠雞、日本鵪鶉、綠頭鴨等禽類形成1 個分支，人、小鼠、牛等哺乳動物形成另外1 個分支（圖2）。

圖2 雞STING 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 STING 基因生物信息學(xué)分析

2.3.1 STING 編碼蛋白理化性質(zhì)、親疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用ExPASy 在線工具對STING 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明，蛋白分子式為C1897H3032N530O541S22，理論分子量為42.6kD，理論等電點(diǎn)為6.67。編碼379 個氨基酸，含量最多的氨基酸是亮氨酸Leu（L），所占比例均為17.2%，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為69.26，高于閾值40，提示該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為105.01。平均親水指數(shù)為-0.041。利用ExPASy程序ProtScale 對STING 編碼蛋白親/ 疏水性分析結(jié)果（圖3）表明整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性。利用在線軟件TMHMM2.0 進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果（圖4）表明該蛋白存在一個跨膜區(qū)。

圖3 STING 蛋白親/疏水性分析

圖4 STING 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.2 信號肽、亞細(xì)胞定位

利用SignalP 5.0 Server 在線軟件對雞STING信號肽進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明不含信號肽區(qū)域，說明該蛋白不是分泌型蛋白。用PSORT 程序分析STINGII 在線工具分析蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示STING 蛋白主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（55.6%），也存在于線粒體（22.2%）、高爾基體（11.1%）和細(xì)胞外基質(zhì)（11.1%）。

2.3.3 磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)預(yù)測

利用NetPhos 3.1 在線軟件對STING 蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果顯示，STING 蛋白中共存在33 個潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括絲氨酸（S）磷酸化位點(diǎn)25 個、蘇氨酸（T）磷酸化位點(diǎn)5 個和酪氨酸（Y）磷酸化位點(diǎn)3 個。經(jīng)NetOGlyc 4.0在線軟件分析結(jié)果顯示，STING 蛋白存在潛在的O-糖基化點(diǎn)5 個。

2.3.4 STING 蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

STING 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示α-螺旋占比為54.62%，β-折疊占比為3.43%，延伸鏈占比為10.29%，無規(guī)則卷曲占比為31.66%。使用SWISS-MODEL 在線工具預(yù)測STING 蛋白三級結(jié)構(gòu)，預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致（圖5）。

圖5 雞STING 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.5 蛋白相互作用分析

相互作用蛋白預(yù)測結(jié)果表明，STING 蛋白可能與TBK1、MAVS、IKBKE、MB21D1、IFIH1、TNFSF15、LACC1、DDX41 等蛋白存在相互作用（圖6）。

3 討論

先天免疫是宿主抵御病原體入侵的第一道也是最快速的防線。宿主細(xì)胞通過不同的模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）識別保守的病原體結(jié)構(gòu)，即病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和宿主損傷相關(guān)分子模式（Molecular patterns associated with host damage，DAMPs），啟動先天免疫反應(yīng)。在感知病毒感染過程中釋放的PAMPs和DAMPs 后，信號級聯(lián)被激活產(chǎn)生I 型干擾素和/ 或多種細(xì)胞因子和趨化因子，最終合成多種抗病毒蛋白[10]。STING 又稱為跨膜蛋白173（Transmembrane protein 173，TMEM173），是宿主受病原入侵產(chǎn)生I 型干擾素反應(yīng)的信號接頭分子[11]。環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶-干擾素基因刺激因子（Cyclic guanylate adenylate synthase interferon gene stimulator，cGAS-STING）信號通路是內(nèi)外源性異常核酸物質(zhì)激活固有免疫系統(tǒng)的重要信號通路[12]，cGAS 可以感受胞質(zhì)中雙鏈DNA，催化ATP 和GTP 形成環(huán) 二核 苷酸（c GAMP）從而激活STING[13]。作為RIG-I 樣受體（RIG-I-like receptors，RLRs）和cGAS-STING 信號通路中重要的銜接分子，STING 可激活核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor 3，IRF3）信號通路，誘導(dǎo)I 型干擾素和炎性因子分泌介導(dǎo)免疫反應(yīng)，在炎癥、感染和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14,15]。STING 被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)的傳感器，在病毒感染時激活干擾素途徑，介導(dǎo)宿主對病毒的防御[16]。STING 參與調(diào)控病毒的固有免疫應(yīng)答，作為DENV、HCV、HCoV-NL63、PEDV 和SARSCoV 等病毒識別和拮抗的靶點(diǎn)，最終阻斷IFN 途徑[17]。過表達(dá)STING 可通過IRF3 和NF-κB 通路誘導(dǎo)IFN 反應(yīng)，使ISG15 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的干擾素誘導(dǎo)病毒抑制蛋白viperin 的表達(dá)上調(diào)，顯著抑制H3N2 犬流感病毒復(fù)制[18]。冠狀病毒木瓜蛋白酶通過破壞STING 介導(dǎo)的信號通路反向調(diào)控抗病毒先天免疫反應(yīng)[19]。STING 的150 位賴氨酸被確定為RNF5泛素化的靶點(diǎn)，這導(dǎo)致了病毒感染后STING 的降解[20]。SARS-CoV-2 ORF9b 通過靶向RIG-I/MDA-5-MAVS、TLR3-TRIF 和cGAS-STING 信號通路的多個組分來拮抗I 型和Ⅲ型干擾素[21]。

與哺乳動物不同，雞不存在RIG-I，但雞STING 是病毒誘導(dǎo)的IFN 激活的關(guān)鍵中介物，雞STING 在DF-1 細(xì)胞中的過表達(dá)會顯著抑制NDV和AIV 的復(fù)制，并激活I(lǐng)RF-7 和NF-κB 誘導(dǎo)I型IFN 的表達(dá)[22]。雞STING 作為先天免疫信號的重要調(diào)控因子，可能參與了雞細(xì)胞內(nèi)MDA5 信號通路[23]。蛋白相互作用預(yù)測結(jié)果表明STING 蛋白可能與TANK 結(jié)合激酶1（TANK binds kinase 1，TBK1）、線粒體抗病毒信號蛋白（Mitochondrial antiviral signaling proteins，MAVS）、B 細(xì)胞κ 輕肽基因增強(qiáng)子抑制因子（Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells，IKBKE）、含MAB21 域蛋白1（Contains MAB21 domain protein 1，MB21D1）、含干擾素誘導(dǎo)解旋酶C 域蛋白1（Contains interferon-induced helicase C domain protein 1，IFIH1）、重組人腫瘤壞死因子配體超家族成員15（Recombinant Human tumor necrosis factor ligand Superfamily member 15，TNFSF15）、含漆酶結(jié)構(gòu)域1 蛋白（Containing laccase domain 1，LACC1）、DDX41 等蛋白存在相互作用。已有研究表明環(huán)鳥苷酸-腺苷酸（cGAMP）作為第二信使結(jié)合并激活STING，導(dǎo)致TBK1 磷酸化STING[24]。此外，STING 可能與自身免疫性疾病[25]、脂質(zhì)代謝[26]和腫瘤發(fā)展[27,28]有關(guān)，因此對雞STING 的深入探究為進(jìn)一步探討STING 在先天免疫中的生物學(xué)功能具有重要意義。

4 結(jié)論

該研究克隆獲得了雞STING 基因CDS 序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)進(jìn)行了預(yù)測分析。結(jié)果顯示，該基因CDs 區(qū)為1140bp，編碼379 個氨基酸，存在1 個跨膜區(qū)，無信號肽。