季申健 王玉秀 顧建軍 閔凌峰

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225001)

吸煙是全身多種疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,如肺癌、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、冠心病及腦梗死等。電子煙是一種靠電池產(chǎn)生動(dòng)力的裝置,在加熱時(shí)能將里面的液體變成氣體狀態(tài),供人吸入。目前電子煙被當(dāng)作戒煙工具而使用〔1〕?，F(xiàn)在盡管電子煙裝置日益升級(jí)發(fā)展,但電子煙的主要成分不外乎包括:尼古丁、植物甘油、丙二醇和多種調(diào)味劑〔2〕。雖然研究顯示電子煙中尼古丁與慢性疾病的不良生物反應(yīng)存在明顯相關(guān)性〔3〕,但國(guó)外普遍認(rèn)識(shí):①電子煙中的尼古丁等有毒物質(zhì)顆粒含量較傳統(tǒng)香煙低,短期吸入時(shí)對(duì)人體影響小,電子煙可以作為戒煙工具使用,甚至被推廣使用。②電子煙中含有的植物甘油、丙二醇和多種調(diào)味劑一般被用作食品添加劑,但在電子煙氣溶膠中,這些加熱成分被吸入能否導(dǎo)致肺損傷因缺乏對(duì)照而暫未有定論,尤其在長(zhǎng)期暴露情況下。反觀國(guó)內(nèi),體外細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物模型的研究認(rèn)為電子煙氣溶膠和液體會(huì)引起不良反應(yīng),包括炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)和培養(yǎng)細(xì)胞死亡等〔4,5〕。以上事實(shí)說明電子煙對(duì)人體的危害還是存在,不能忽視,尤其長(zhǎng)期暴露對(duì)人體肺組織的影響仍需探討。電子煙在當(dāng)今很受歡迎,尤其是IQOS 品牌。最近公布的使用數(shù)據(jù)中顯示其已有顯著增長(zhǎng),特別在年輕人群中〔6,7〕。由于IQOS品牌是新型電子煙,且缺乏足夠多的科學(xué)證據(jù)證明其危害性,因此許多人認(rèn)為電子煙是無害的,可以作為香煙的安全替代品。但是,通過對(duì)經(jīng)常使用電子煙的人群進(jìn)行肺泡灌洗,并對(duì)灌洗液中的基因/蛋白質(zhì)集分析表明:電子煙產(chǎn)生的氣溶膠對(duì)人類氣道有顯著且廣泛的急慢性炎癥反應(yīng),具有明顯的肺臟毒性〔8〕,所以電子煙產(chǎn)生的人體危害必須引起足夠的重視。

目前研究顯示,電子煙對(duì)機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)均有一定的影響,如心血管系統(tǒng)〔9～11〕、神經(jīng)系統(tǒng)〔12～14〕、呼吸系統(tǒng)等,尤其是呼吸系統(tǒng)。Park等〔15〕采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法分析了電子煙氣溶膠對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示,暴露在電子煙氣溶膠下會(huì)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞纖毛相關(guān)基因的下調(diào),導(dǎo)致呼吸道纖毛的功能降低,進(jìn)而無法正常清除氣道黏液,造成第1秒用力呼氣容積(FEV1)下降,推測(cè)吸食電子煙同樣可產(chǎn)生相似COPD病理生理學(xué)改變。 Staudt等〔16〕和Cervellati等〔17〕采用微陣列方法對(duì)傳統(tǒng)吸煙者、電子煙使用者和不吸煙者的肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞樣本進(jìn)行分析,結(jié)果顯示電子煙的使用同樣改變了巨噬細(xì)胞差異基因的表達(dá),涉及炎癥和免疫反應(yīng),導(dǎo)致了與傳統(tǒng)吸煙類似的肺部變化。以上結(jié)果充分提示了電子煙對(duì)機(jī)體潛在的不利影響。

為理解電子煙與肺部組織差異基因的相關(guān)性,本研究建立了小鼠模型,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),深入探究電子煙及傳統(tǒng)香煙對(duì)小鼠肺組織影響及差異基因功能學(xué)分析,為電子煙及傳統(tǒng)香煙對(duì)機(jī)體的分子生物學(xué)影響提供新思路、新方向。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 30只8周齡體質(zhì)量24～27 g,SPF自交系C57BL/6J雄性小鼠,均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔許可:SCXK(北京)2016-0006〕。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、傳統(tǒng)香煙組、電子煙組,每組10只,在揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng),溫度21～23 ℃,濕度50%～60%,自由飲水進(jìn)食,晝夜節(jié)律12 h。實(shí)驗(yàn)過程中給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則的人道關(guān)懷。所有動(dòng)物研究經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要儀器與試劑 Marlboro牌紅香煙(1.2 mg尼古丁,美國(guó)菲利普莫里斯煙草公司);Marlboro牌HeatSticks(1.29 mg尼古丁,美國(guó)菲利普莫里斯煙草公司)。電子煙IQOS加熱器(美國(guó)菲利普莫里斯煙草公司)。儀器與設(shè)備:煙熏箱(自制有機(jī)玻璃箱,90 cm× 40 cm × 30 cm)。光學(xué)顯微鏡、肺功能儀(flexiVent;SCIREQ,Montreal,加拿大)。

1.3動(dòng)物造模 喂養(yǎng)2 w后開始造模。電子煙組及傳統(tǒng)香煙組分別被置于自制的煙熏箱中。為匹配尼古丁濃度:一支Marlboro牌紅香煙抽吸8次,一支HeatSticks抽吸12次。電子煙組及傳統(tǒng)香煙組分別暴露于電子煙氣溶膠和香煙煙霧中30 min,每次5支,間隔4 h,2次/d,5 d/w,共6個(gè)月;正常對(duì)照組則自由呼吸空氣6個(gè)月。記錄每組一般情況。

1.4肺功能檢測(cè) 造模結(jié)束后行肺功能檢測(cè)。在小鼠腹膜內(nèi)注射0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)予以麻醉處理,常規(guī)進(jìn)行固定,備皮,消毒后剪開小鼠頸部皮膚,并且小心予以鈍性分離,使小鼠充分暴露出氣管,進(jìn)而在氣管與軟骨環(huán)之間水平處輕柔剪開小鼠氣管,氣管切開后立即行氣管插管,并將小鼠置于體描箱內(nèi),保持頭低位,與呼吸機(jī)管路相連,行機(jī)械通氣測(cè)肺功能。在測(cè)定過程中,采用外加壓力的辦法,使動(dòng)物深吸氣/深呼氣,電腦自動(dòng)快速而準(zhǔn)確地測(cè)出各項(xiàng)指標(biāo)。測(cè)定指標(biāo)有用力肺活量(FVC)、50 ms用力呼氣容積(FEV0.05)、FEV0.05/FVC%。在揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行小鼠的肺功能檢測(cè),為保證肺功能數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,均安排同一人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.5肺組織獲取及處理 小鼠腹膜內(nèi)注射0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)后予以麻醉處理,處死小鼠后,收集小鼠的肺組織,進(jìn)行多聚甲醛固定,石蠟包埋,隨后進(jìn)行切片,每張切片厚度為5 μm,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,并使用光學(xué)顯微鏡觀察小鼠肺組織的病理形態(tài)。

1.6轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序 使用Illumina HiSeq平臺(tái)檢測(cè)樣品,用mRNA富集法對(duì)totalRNA進(jìn)行處理,mRNA富集:用帶有OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA;得到的mRNA中加入適量打斷試劑高溫條件下使其片斷化,以打斷后的mRNA為模板合成一鏈 cDNA,然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA,并使用試劑盒純化回收、黏性末端修復(fù)、 cDNA 的3′末端加上堿基“A”并連接接頭,進(jìn)行片段大小選擇,最后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增;構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢,合格后進(jìn)行測(cè)序(由杭州景杰公司代理完成)。測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)稱為raw reads。首先,過濾掉低質(zhì)量、接頭污染及未知堿基N含量過高的reads,本實(shí)驗(yàn)使用華大自主研發(fā)的過濾軟件SOAPnuke進(jìn)行統(tǒng)計(jì),使用trimmomatic進(jìn)行過濾,過濾后的數(shù)據(jù)稱為clean reads。然后將clean reads比對(duì)到參考基因組上,之后進(jìn)行新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)、 SNP &InDel 和差異剪接基因檢測(cè)。得到新轉(zhuǎn)錄本后,將具有蛋白編碼潛力的新轉(zhuǎn)錄本加入?yún)⒖蓟蛐蛄兄袠?gòu)成一個(gè)完整的參考序列,計(jì)算基因-蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.7差異基因篩選及生物信息學(xué)分析 當(dāng)基因豐度差異倍數(shù)達(dá)2倍及以上,且統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)P<0.05時(shí),視為候選差異基因;將每組樣品組間兩兩比較,統(tǒng)計(jì)得到差異基因數(shù)量,在3組樣品間均有差異的基因作為差異基因。將篩選所得的差異基因做GO、KEGG功能富集分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.13組肺功能及肺組織學(xué)改變 相較于正常對(duì)照組,傳統(tǒng)香煙組FEV0.05、FEV0.05/FVC顯著下降(P<0.05);電子煙組FEV0.05、FVC、FEV0.05/FVC顯著下降(P<0.05)。與傳統(tǒng)香煙組比較,電子煙組FEV0.05、FVC均下降,且FVC下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。從肺組織肺病理學(xué)角度看,相較于正常對(duì)照組,傳統(tǒng)香煙組及電子煙組肺泡腔均存在明顯擴(kuò)張。見圖1。

圖1 3組肺組織(HE染色)

表1 3組肺功能比較

2.23組肺組織差異基因分析 基因組學(xué)測(cè)序分析結(jié)果提示,相較于正常對(duì)照組,傳統(tǒng)香煙組發(fā)現(xiàn)1 089個(gè)差異基因,其中678個(gè)為表達(dá)上調(diào)基因,411個(gè)為表達(dá)下調(diào)基因;電子煙組發(fā)現(xiàn)1 044個(gè)差異基因,其中 598個(gè)為表達(dá)上調(diào)基因,446為表達(dá)下調(diào)基因;傳統(tǒng)香煙組與電子煙組之間,發(fā)現(xiàn)811個(gè)差異基因,其中499個(gè)為表達(dá)上調(diào)基因,312個(gè)為表達(dá)下調(diào)基因,見圖2。同時(shí)對(duì)差異基因進(jìn)行韋恩圖分析,見圖3。

圖2 火山圖:3組肺組織差異基因

圖3 韋恩圖:3組肺組織差異基因

2.33組肺組織差異基因GO聚類分析和功能富集分析 相較于正常對(duì)照組,傳統(tǒng)香煙組通過GO聚類分析,差異基因生物學(xué)過程主要聚類在生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化及應(yīng)激反應(yīng)這3個(gè)生物學(xué)過程;細(xì)胞組成成分主要聚類在胞外區(qū)、細(xì)胞膜及細(xì)胞器細(xì)胞組成成分;分子功能學(xué)主要聚類在黏附、催化活性分子功能學(xué)過程。相較于正常對(duì)照組,電子煙組通過GO聚類分析,差異基因生物學(xué)過程主要聚類在生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、發(fā)育過程、多生物學(xué)過程及應(yīng)激反應(yīng)這5個(gè)生物學(xué)過程;細(xì)胞組成成分主要聚類在胞外區(qū)、細(xì)胞膜及細(xì)胞器細(xì)胞組成成分;分子功能學(xué)主要聚類在黏附、催化活性分子功能學(xué)過程。與電子煙組相比較,傳統(tǒng)香煙組通過GO聚類分析,差異基因生物學(xué)過程主要聚類在生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、發(fā)育過程、代謝過程、多生物學(xué)過程及應(yīng)激反應(yīng)生物學(xué)過程;細(xì)胞組成成分主要聚類在胞外區(qū)、細(xì)胞膜及細(xì)胞器細(xì)胞組成成分;分子功能學(xué)主要聚類在黏附、催化活性分子功能學(xué)。見圖4。

圖4 3組肺組織差異基因GO聚類分析

2.43組肺組織差異基因KEGG聚類分析和功能富集分析 相較于正常對(duì)照組,傳統(tǒng)香煙組通過KEGG聚類分析,差異基因主要聚類在癌性疾病以及感染性疾病;主要聚類在運(yùn)輸與代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯及免疫系統(tǒng);電子煙組通過KEGG聚類分析,差異基因主要聚類在癌性疾病及感染性疾病;主要聚類在運(yùn)輸與代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯及免疫系統(tǒng)。與電子煙組相比較,傳統(tǒng)香煙組通過KEGG聚類分析,差異基因生物學(xué)過程主要聚類在運(yùn)輸與代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯及免疫系統(tǒng)。見圖5。

圖5 3組肺組織差異基因KEGG聚類分析

3 討 論

本研究說明,電子煙同樣會(huì)造成小鼠氣道阻力增加,肺組織彈性下降。Ferrari 等〔18〕研究結(jié)果提示,電子煙的短期使用對(duì)非吸煙者沒有直接的不良影響,對(duì)吸煙者的FEV1和用力呼氣流量(FEF)25只有很小的影響。而Meo 等〔19〕研究結(jié)果顯示電子煙組肺功能(FEV1、FEV1/FVC、FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%～75%、FEF75%～85%)明顯下降(P<0.05)。提示不管短期還是長(zhǎng)期電子煙使用均可對(duì)機(jī)體肺功能產(chǎn)生一定的影響。所以和傳統(tǒng)香煙相比,電子煙不是作為戒煙工具的最佳選擇,兩者同樣都能引起肺功能的慢性下降和惡化。

本研究結(jié)果提示,不管是傳統(tǒng)香煙組還是電子煙組,差異基因多分布在細(xì)胞的胞質(zhì)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)上,兩者在差異表達(dá)方面多有重合,且差異基因表達(dá)GO富集分析多主要聚類在生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、發(fā)育過程、代謝過程、多生物學(xué)過程及應(yīng)激反應(yīng)過程。傳統(tǒng)香煙煙霧誘導(dǎo)肺組織病理性改變的機(jī)制多種多樣,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖〔20〕、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)〔21,22〕及誘導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激〔23,24〕等多種方式。本研究發(fā)現(xiàn),電子煙誘導(dǎo)肺組織病理改變機(jī)制主要涉及炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等。本文觀察到電子煙誘導(dǎo)的肺部炎癥中,金屬蛋白酶(MPO)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-8、MMP-9等炎癥基因上調(diào);而在傳統(tǒng)香煙組則沒有發(fā)現(xiàn)這些上述基因。MMP-8、MMP-9屬于MMP家族,在過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)γ和骨鈣蛋白(OPN)通路及趨化因子相互誘導(dǎo)下,主要由中性粒細(xì)胞分泌,而中性粒細(xì)胞是參與氣道炎癥的主要細(xì)胞〔25,26〕。相關(guān)研究已表明氣道炎癥過程中,MMP-8、MMP-9會(huì)大量分泌,與氣管擴(kuò)張和肺組織破壞關(guān)系密切〔27〕。從電子煙組小鼠的肺組織病理觀察到,這些上調(diào)基因參與導(dǎo)致肺損害的炎癥過程。以往發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)香煙煙霧暴露下,MMP-12、MMP-1等同樣也可誘導(dǎo)肺部產(chǎn)生炎癥〔28〕。由此可見,這些基因所涉及的促炎機(jī)制基本相同,故提示了電子煙和傳統(tǒng)香煙均可引起小鼠肺組織的炎癥反應(yīng),電子煙并不是沒有危害。在氧化應(yīng)激方面,本研究發(fā)現(xiàn)電子煙組和傳統(tǒng)香煙組都有下調(diào)抗氧化的基因,并且電子煙組高于正常對(duì)照組,如NAD(P)H醛脫氫酶1明顯下調(diào)。NAD(P)H醛脫氫酶1可減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自由基的形成,而抗氧化基因下調(diào)能導(dǎo)致肺部氧化/抗氧化失衡,一旦失衡產(chǎn)生能損傷氣道上皮細(xì)胞進(jìn)而導(dǎo)致小氣道病理改變。以上發(fā)現(xiàn)說明電子煙也可導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生。在細(xì)胞增殖和凋亡方面,本研究發(fā)現(xiàn)電子煙組信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)1表達(dá)下調(diào),而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β-1則表達(dá)上調(diào);而在傳統(tǒng)香煙組則未發(fā)現(xiàn)STAT1。STAT1是STAT家族蛋白的一員〔29〕,該基因表達(dá)與抑制腫瘤發(fā)生有關(guān),一般與酪氨酸激酶(JAK)結(jié)合形成信號(hào)通路,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用〔30,31〕,而且研究顯示吸煙可導(dǎo)致STAT家族蛋白信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào),可能還會(huì)促進(jìn)肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移〔32,33〕。TGFβ-1在活性氧作用下,通過結(jié)合多種Smad蛋白通路,在腫瘤微環(huán)境下可以幫助腫瘤細(xì)胞逃逸,它與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔34〕。另外還有多種信號(hào)通路,包括核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB〔35〕、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)〔36,37〕等也參與煙草煙霧誘導(dǎo)的生物學(xué)改變過程。相關(guān)研究認(rèn)為在電子煙氣溶膠暴露條件下,某些常見涉及炎癥、氧化應(yīng)激等基因表達(dá)或有限或明顯上調(diào),可能與電子煙品種、尼古丁含量、實(shí)驗(yàn)小鼠品系、長(zhǎng)短期持續(xù)暴露等有關(guān)〔38～40〕。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)電子煙組和傳統(tǒng)香煙組的轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異結(jié)果,本文推測(cè)這些差異基因改變機(jī)制或許跟Czekala等〔38〕研究保持一致,需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步論證。

綜上,電子煙具有和傳統(tǒng)香煙的危害性,甚至更甚于傳統(tǒng)香煙對(duì)機(jī)體呼吸系統(tǒng)的危害。一方面長(zhǎng)期暴露于電子煙可導(dǎo)致肺功能、肺彈性的下降,另一方面可誘導(dǎo)肺組織肺泡腔的擴(kuò)大及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),久之導(dǎo)致肺部結(jié)構(gòu)的變化。