王璐 董榮榮 孫士營 王玉萍

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)皮膚科,山東 青島 266035;2青島市婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科;3山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心)

淋巴瘤根據(jù)形態(tài)和免疫組化可將其分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤來源于B、T和自然殺傷NK淋巴細(xì)胞,包括懶惰型和侵襲型〔1〕。T細(xì)胞淋巴瘤是一種侵襲性惡性腫瘤,占非霍奇金淋巴瘤的12%～15%,多發(fā)生于中老年人。目前,由于T細(xì)胞淋巴瘤的化療藥物敏感性低、復(fù)發(fā)率高等不利因素,患者的治療效果和預(yù)后仍不理想〔2〕。因此,亟待尋找有效的治療手段。長非編碼RNA(lncRNAs)是指長度超過200個(gè)核苷酸且不具有編碼蛋白功能的轉(zhuǎn)錄本,研究發(fā)現(xiàn),lncRNAs與人類多種惡性腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。lncRNA GATA結(jié)合蛋白3反義RNA(GATA3-AS)1首次發(fā)現(xiàn)于人類CD4+T細(xì)胞亞群〔3〕。lncRNA GATA3-AS1在三陰性乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),敲除lncRNA GATA3-AS1可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞生長,并增強(qiáng)免疫應(yīng)答的抵抗力,lncRNA GATA3-AS1通過穩(wěn)定程序性細(xì)胞死亡-配體(PD-L)1蛋白和降解GATA3蛋白來促進(jìn)三陰性乳腺癌進(jìn)展和免疫逃〔4〕。lncRNA GATA3-AS1在肝癌中高表達(dá)與腫瘤大小、分期、轉(zhuǎn)移及患者總生存期縮短顯著相關(guān),lncRNA GATA3-AS1通過抑制磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN)1A和TP53表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔5〕。在胰腺癌組織和細(xì)胞中,lncRNA GATA3-AS1表達(dá)上調(diào),敲除lncRNA GATA3-AS1通過miR-30b-5p/Tex10軸抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和致瘤能力,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔6〕。然而lncRNA GATA3-AS1在淋巴瘤中的表達(dá)及作用尚不清楚,本實(shí)驗(yàn)通過StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)lncRNA GATA3-AS1與miR-361-3p具有結(jié)合位點(diǎn)。研究報(bào)道,miR-361-3p在淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-361-3p通過Wnt/β-Catenin信號(hào)通路抑制細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)凋亡〔7〕。盡管miR-361-3p在淋巴瘤中的作用已有報(bào)道,但lncRNA GATA3-AS1在淋巴瘤中的作用及其分子機(jī)制是否與miR-361-3p有關(guān)還尚未可知。本文對(duì)LncRNA GATA-AS1通過靶向miR-361-3p調(diào)控T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲展開研究。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2017年6月至2019年6月收治并手術(shù)切除的30例T細(xì)胞淋巴瘤組織及其癌旁組織樣本,并保存于-80 ℃冰箱,患者均知情同意,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞與試劑 人T淋巴細(xì)胞H9和T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞Jurkat、人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞(CCRF-CEM)和人淋巴母細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(SUP-T1)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;Trizol試劑、qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司;Transwell小室購于美國密理博公司;放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-361-3p、anti-miR-NC、anti-miR-361-3p購自上海吉瑪制藥公司;pcDNA、pcDNA-GATA3-AS1購自上海索寶生物科技有限公司。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-361-3p分別轉(zhuǎn)染至Jurkat細(xì)胞,記為si-NC組、si-GATA3-AS1組、miR-NC組、miR-361-3p組;共轉(zhuǎn)染si-GATA3-AS1和anti-miR-NC、si-GATA3-AS1和anti-miR-361-3p至Jurkat細(xì)胞,記為si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組、si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p組。

1.4RT-qPCR 提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,lncRNA GATA3-AS1、miR-361-3p分別以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和U6為內(nèi)參,相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。lncRNA GATA3-AS1上游引物:5′-AAGTTGAGCGGGGTATGT-3′,下游:5′-TTTCTGGCCTTTGGTGTC-3′;miR-361-3p上游引物:5′-CTGCACTCCCCCACCTG-3′,下游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;GAPDH上游引物:5′-AGAACGGGAAGCTTGTCATC-3′,下游:5′-CATCGCCCCACTTGATTTTG-3′;U6上游引物:5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′,下游:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5MTT 將各組Jurkat細(xì)胞以2.5×104個(gè)/ml接種于96孔板(100 μl/孔),培養(yǎng)48 h后,加入20 μl/孔MTT,培養(yǎng)4 h,棄上清,加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO),室溫震蕩孵育5 min,酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度(OD)值。

1.6Transwell 將各組Jurkat細(xì)胞接種于Transwell小室上室(5×104個(gè)/孔),下室加入含10%胎牛血清的600 μl培養(yǎng)液,在37 ℃下孵育24 h后,用棉簽擦去未穿膜的細(xì)胞。多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染液染色。置于顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.7Western印跡提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒定量。各組上樣量60 μg,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)上,5%脫脂牛奶封閉,一抗4 ℃孵育過夜,加入二抗孵育2 h,顯影,定影,Image J軟件分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA GATA3-AS1和miR-361-3p在T細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較,T細(xì)胞淋巴瘤組織lncRNA GATA3-AS1表達(dá)水平(1.00±0.16 vs 4.15±0.52)顯著升高,miR-361-3p表達(dá)水平顯著降低(1.00±0.12 vs 0.49±0.06,P<0.05);與人T淋巴細(xì)胞H9組比較,T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞Jurkat、CCRF-CEM和SUP-T1組中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1表達(dá)水平顯著升高,miR-361-3p組表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA GATA3-AS1和miR-361-3p在T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)

2.2干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較,si-GATA3-AS1組OD值、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及GATA3-AS1、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低,p21表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表2、圖1、圖2。

1～6:si-NC組、si-GATA3-AS1組、miR-NC組、miR-361-3p組、si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組、si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p組,下圖同圖1 各組T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

圖2 各組T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3lncRNA GATA3-AS1靶向調(diào)控miR-361-3p表達(dá) StarBase預(yù)測顯示lncRNA GATA3-AS1序列含有與miR-361-3p互補(bǔ)的核苷酸序列。見圖3。與轉(zhuǎn)染miR-NC的WT-GATA3-AS1比較,轉(zhuǎn)染miR-361-3p熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與pcDNA組miR-361-3p表達(dá)(1.01±0.12)比較,pcDNA-GATA3-AS1組(0.42±0.03)顯著降低(P<0.05);與si-NC組miR-361-3p表達(dá)(1.00±0.08)比較,si-GATA3-AS1組(2.93±0.39)顯著升高(P<0.05)。lncRNA GATA3-AS1靶向負(fù)調(diào)控miR-361-3p表達(dá)(P<0.05)。見圖1、表3。

圖3 GATA3-AS1與miR-361-3p的互補(bǔ)核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4過表達(dá)miR-361-3p對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-361-3p組miR-361-3p及p21表達(dá)顯著升高,OD值、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見圖1、圖2、表4。

表4 過表達(dá)miR-361-3p對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5下調(diào)miR-361-3p逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組比較,si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p組miR-361-3p及p21表達(dá)水平顯著降低,OD值、遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表5。

表5 下調(diào)miR-361-3p逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

lncRNAs的異常表達(dá)與淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中,過表達(dá)lncRNA TCLlnc1促進(jìn)T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和遷移〔8〕。LINC01013在間變性大細(xì)胞淋巴瘤組織中表達(dá)上調(diào),敲除LINC01013抑制侵襲性間變性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的侵襲〔9〕。在結(jié)外自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤組織和細(xì)胞中,lncRNA XIST表達(dá)顯著增加,敲除lncRNA XIST通過miR-497/B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-w軸抑制結(jié)外自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和遷移〔10〕。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中,lncRNA MALAT1表達(dá)上調(diào),敲減lncRNA MALAT1通過miR-195/PD-L1軸抑制OCI-Ly10細(xì)胞增殖、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和免疫逃逸能力,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔11〕。LINC00908在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào),下調(diào)LINC00908通過靶向上調(diào)miR-671-5p抑制彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和侵襲〔12〕。lncRNA PCAT1在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào),其高表達(dá)與患者的臨床分期及淋巴瘤國際預(yù)后評(píng)分(IPI)評(píng)分有關(guān),lncRNA PCAT1通過miR-508-3p/核因子(NF)IB軸促進(jìn)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔13〕。與上述研究結(jié)果一致,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)可降低Jurkat細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

研究表明,lncRNAs可作為競爭性內(nèi)源RNA負(fù)調(diào)控相關(guān)miRNA表達(dá)來調(diào)節(jié)淋巴癌進(jìn)展〔10～13〕。miR-361-3p在人類多種癌癥中發(fā)揮抑癌基因作用,如miR-361-3p在骨髓瘤細(xì)胞中低表達(dá),上調(diào)miR-361-3p通過靶向腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡,并抑制細(xì)胞增殖〔14〕。miR-361-3p在復(fù)發(fā)性前列腺癌患者中低表達(dá),過表達(dá)miR-361-3p可通過抑制ARv7和MAP激酶結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸激酶(MKNK)2表達(dá)提高前列腺癌細(xì)胞的恩扎魯胺敏感性〔15〕。在宮頸癌組織和細(xì)胞中,CircUBAP2 表達(dá)上調(diào),下調(diào)miR-361-3p可部分逆轉(zhuǎn)敲減CircUBAP2表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用〔16〕。circ_0075960通過調(diào)控miR-361-3p/SH2B1軸促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展〔17〕。敲減circ_0011385通過上調(diào)miR-361-3p抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和凋亡〔18〕。miR-361-3p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著降低,其低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān),抑制miR-361-3p表達(dá)通過靶向上調(diào)SH2B1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長、增殖、集落形成、侵襲和遷移〔19〕。與上述研究結(jié)果一致,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,過表達(dá)miR-361-3p可降低Jurkat細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,且下調(diào)miR-361-3p逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA GATA3-AS1表達(dá)對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。