蘇瑩瑩,劉松*

1(江南大學(xué),未來食品科學(xué)中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)

氣體囊泡是具有剛性空心結(jié)構(gòu)并充滿氣體的細(xì)胞器[1],廣泛存在于藍(lán)藻、異養(yǎng)細(xì)菌、厭氧光合細(xì)菌和嗜鹽古菌等原核生物中[2]。一般認(rèn)為,氣體囊泡可為藍(lán)藻細(xì)胞提供浮力,從而更好地利用光和養(yǎng)分[3]。在嗜鹽古菌中,氣體囊泡則有助于其在極端壓力和高鹽條件下存活[2,4]。結(jié)構(gòu)分析顯示,氣體囊泡主要由氣囊蛋白(gas vesicle protein, Gvp)構(gòu)成[5],在不同生物體中已經(jīng)鑒定出8～14個(gè)編碼可調(diào)控氣體囊泡形成的基因。嗜鹽古菌中,氣囊由2個(gè)相反的基因簇gvpANO和gvpFGHIJKLM組成[6],GvpA作為大多菌體氣囊的主要結(jié)構(gòu)蛋白,高度保守且具有很強(qiáng)的疏水性[7];gvpO則可能參與了gvpACN的轉(zhuǎn)錄激活或有助于其mRNA的穩(wěn)定性,敲除gvpO會顯著降低gvpA、gvpC和gvpN的轉(zhuǎn)錄水平且無法形成氣體囊泡[8]。研究表明,Gvp的表達(dá)受環(huán)境因素的調(diào)節(jié)[2]。在沙雷氏腸桿菌(Serratiasp.ATCC 39006)中觀察到的氣體囊泡,其形成就需要氧氣的刺激,并受到群體感應(yīng)信號分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的調(diào)控[9]。值得注意的是,重組表達(dá)編碼藍(lán)藻氣體囊泡基因簇能使大腸桿菌細(xì)胞浮于培養(yǎng)基表面[10]。因此,過量表達(dá)氣體囊泡基因簇能有效調(diào)控細(xì)胞的生理狀態(tài)。

在鏈霉菌基因組中研究者同樣發(fā)現(xiàn)了gvp基因簇,如天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)的gvpOAFGYZJLSK[2-3]。不同于藍(lán)藻和嗜鹽古菌,鏈霉菌gvp基因簇一般缺少gvpC、gvpN和gvpV等氣囊蛋白基因。值得注意的是,藍(lán)藻和嗜鹽古菌中的輔助蛋白GvpC能使氣體囊泡更穩(wěn)定抗壓,GvpN或GvpV則有助于促進(jìn)氣囊組裝[9]。因此,多數(shù)鏈霉菌并不能檢測到氣體囊泡的形成[11],過量表達(dá)鏈霉菌gvp基因簇也不能使大腸桿菌細(xì)胞漂浮[12]。一般認(rèn)為,鏈霉菌主要是利用GvpA的疏水性N端形成疏水表面,以便于其氣生菌絲穿過氣液界面[3]。最近,鏈霉菌(Streptomycessp.) CB03234-S中發(fā)現(xiàn)的基因簇gvpOAFGJLSK(圖1)缺少了鏈霉菌中常見的gvpY和gvpZ,并能在富含氮源的培養(yǎng)條件下觀測到胞內(nèi)的類似氣囊蛋白的結(jié)構(gòu)[13]。此外,過量表達(dá)gvpOAFGJLSK增加CB03234-S中的氣體囊泡數(shù)量和十元環(huán)烯二炔天賜霉素的產(chǎn)量,使其鏈霉菌菌體形態(tài)和代謝產(chǎn)生重要的影響[13]。因此,調(diào)控gvpOAFGJLSK的合成可能是促進(jìn)鏈霉菌產(chǎn)物合成的新途徑。

圖1 不同來源的gvp基因簇組成Fig.1 Composition of gvp gene clusters from different sources

基因組分析顯示,S.mobaraensisDSM40587的gvp基因gvpOAFGJLSK(gvp40587)與CB03234-S的gvp基因簇具有相同的組成(圖1),均不含gvpY和gvpZ。在本研究中,將S.mobaraensisDSM40587胰蛋白酶(S.mobaraensistrypsin,SMT)過量表達(dá)于缺失谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因(tg)的S.mobaraensisDSM40587(smY2019Δtg)中[14],研究了過量表達(dá)gvpA、gvpO及基因簇gvp40587對SMT合成、生長及代謝的影響。研究結(jié)果將有助于認(rèn)識Gvp功能,也為鏈霉菌產(chǎn)酶的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

S.mobaraensisDSM40587為本研究室保藏。tg缺失的S.mobaraensis(smY2019Δtg)為研究室前期工作中構(gòu)建[14]。大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)為本章實(shí)驗(yàn)所用克隆宿主。本研究使用的其他菌株與質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所使用的菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑

高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR GXL)、平末端磷酸化連接酶(Blunting Kination Ligation Kit),寶生物工程(大連)有限公司;高保真DNA聚合酶(KOD FX),東洋紡(上海)生物科技有限公司;一步克隆連接試劑盒One Step Cloning Kit(ClonExpressTMII),南京諾唯贊生物科技股份有限公司;限制性內(nèi)切酶、蛋白預(yù)制膠、蛋白質(zhì)Marker、MES蛋白電泳緩沖液,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;硫鏈絲菌素,生工生物工程(上海)股份有限公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、基因組提取試劑盒、ATP含量檢測試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;NADPH/NADP+測定試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司;底物Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯酰胺(BAPNA),美國Sigma公司;RNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司。其他常規(guī)試劑及藥品為國產(chǎn)或進(jìn)口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10。

GYM產(chǎn)孢培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,酵母粉4,麥芽粉3。

2×YT孢子萌發(fā)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨16,酵母粉10,NaCl 5。

種子培養(yǎng)基(g/L):甘油20,酵母粉5,胰蛋白胨20,K2HPO44,MgSO42,pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油20,酵母粉5,胰蛋白胨20,大豆粉20,KH2PO42,K2HPO44,MgSO42,CaCO32,pH 7.2～7.4。

固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加1.5%～2%瓊脂粉。121 ℃濕熱滅菌15 min后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 整合表達(dá)載體的構(gòu)建

以S.mobaraensisDSM40587基因組(GenBank No.CP083590)為模板,分別擴(kuò)增基因K7I03_26340上游1 056 bp(同源重組左臂)和下游999 bp(同源重組右臂)、SMT基因K7I03_25045片段(792 bp)和tg啟動(dòng)子片段。使用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I切割pJTU1278獲得同源重組質(zhì)粒片段。采用一步克隆試劑盒將上述5個(gè)片段融合,得到SMT整合表達(dá)質(zhì)粒pJTU1278-SMT。以S.mobaraensisDSM40587基因組為模板,分別擴(kuò)增tg位點(diǎn)上游1 406 bp(同源臂)、相關(guān)氣囊基因gvpA、gvpO及完整基因簇gvp40587。采用一步克隆試劑盒將gvpA、gvpO及完整基因簇gvp40587分別與tg同源臂和pJTU1278酶切片段連接,得到整合表達(dá)質(zhì)粒pJTU1278-gvpA、pJTU1278-gvpO和pJTU1278-gvp40587。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliJM109,并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。載體構(gòu)建及驗(yàn)證相關(guān)引物見表2。

表2 本研究所使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.2S.mobaraensis原生質(zhì)電轉(zhuǎn)化

取70 μLS.mobaraensis原生質(zhì)體溶液與5～10 μg構(gòu)建的整合表達(dá)質(zhì)粒混合,轉(zhuǎn)入0.1 cm電轉(zhuǎn)杯中,于2 500 V和25 Ω電擊1次;電擊結(jié)束立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇,最后轉(zhuǎn)移至無菌的1.5 mL EP管中,于30 ℃、220 r/min搖床中培養(yǎng)2 h。將培養(yǎng)液涂布至含30 μg/mL硫鏈絲菌素的GYM平板,培養(yǎng)5～6 d篩選含單交換的轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至無抗性GYM平板松弛培養(yǎng)3～4 d后,通過PCR驗(yàn)證和基因測序分析,篩選獲得雙交換轉(zhuǎn)化子。相關(guān)PCR驗(yàn)證引物見表2。

1.2.3 重組S.mobaraensis搖瓶發(fā)酵

將GYM平板上獲得的重組菌轉(zhuǎn)化子平板上劃線后,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～5 d。隨后用無菌涂布棒適量刮取GYM固體平板上的菌絲,將孢子懸液以終濃度106個(gè)/mL接種至種子培養(yǎng)基(30 μg/mL硫鏈絲菌肽),于30 ℃和220 r/min搖床中培養(yǎng)24～36 h后,以8%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接至含有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(30 μg/mL硫鏈絲菌肽)的250 mL三角瓶中,繼續(xù)于30 ℃和220 r/min搖床中培養(yǎng)72 h。

1.2.4 胰蛋白酶酰胺酶活力測定

每隔12 h,將不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵樣品取1 mL于10 000 r/min、10 min進(jìn)行離心,之后取上清至EP管中,放冰上待測。參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測定:以BAPNA為底物測定胰蛋白酶酰胺酶活力:將890 μL緩沖液溶液(50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl, 20 mmol/L CaCl2)與10 μL BAPNA (100 mmol/L)混合均勻;在37 ℃下預(yù)熱10 min后,迅速加入100 μL酶液混合均勻,在37 ℃、410 nm條件下測定其吸光值的變化值(ΔA410/min)。酶活定義為:在37 ℃下,ΔA410/min升高0.1即為胰蛋白酶的1個(gè)酰胺酶水解單位。計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳分析

取30 μL發(fā)酵上清液與10 μL的5xloading buffer混合均勻后,于90 ℃加熱10 min后待用。SDS-PAGE凝膠電泳具體操作方法參考Invitrogen公司Bis-Tris預(yù)制凝膠說明書。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

取基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h的發(fā)酵液,于4 ℃、12 000 r/min、2 min離心,收集菌體待用,隨后用RNA提取盒提取總RNA,根據(jù)說明書中的步驟進(jìn)行操作。對提取RNA的濃度、純度及完整性進(jìn)行驗(yàn)證,并以RNA為模板,使用PrimeScriptTMRT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,最終,在Light Cycler 480 System(Roche Diagnostics Ltd.,Rotkreuz,Switzerland)中使用SYBR Green I嵌合熒光法對qRT-PCR進(jìn)行分析。以S.mobaraensis基因組中的hrdB基因?yàn)閮?nèi)參基因,用2-ΔΔCt法計(jì)算不同樣品中不同基因的相對倍數(shù)變化。qRT-PCR使用的引物列于表3中。

對于局部損壞的素土后屋面，采用干土+草泥方式修補(bǔ)。對于完全需要重新改造的素土后屋面，拆除修平后，在原屋面上鋪設(shè)聚苯板保溫層+塑料薄膜或草泥抹面的簡易厚屋面。有立柱溫室和骨架荷載良好的溫室，采用墊板+聚苯板+鋼網(wǎng)砼層，墊板+聚苯板+CSM墻面材料等復(fù)合后屋面。對于原屋面為水泥抹面面層時(shí)，如裂縫、剝落現(xiàn)象，應(yīng)將原墻面鑿毛，否則，應(yīng)將原涂層鏟除，重新進(jìn)行水泥抹面，裂縫可采用防水瀝青灌縫處理。后屋面改造升級后，達(dá)到整個(gè)后屋面頂部成南高北低的斜坡，坡面平整無縫，具備防水、隔熱保溫的功能，并在后屋面加蓋保溫被，或覆蓋棚膜等方式，進(jìn)行防水保溫。

表3 qRT-PCR所用引物Table 3 Primers used for qRT-PCR

1.2.7 菌絲生長量測定

將不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵樣品取1 mL進(jìn)行離心,留下菌體,每隔12 h取樣1 mL至1.5 mL提前稱重的空EP管(m1)中。將菌液離心,10 000 r/min、10 min,留下菌體,EP管開蓋放至65 ℃烘箱中干燥直到恒重,取出稱量(m2)。計(jì)算菌體在不同時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量(m2-m1),繪制細(xì)胞干重曲線。

1.2.8 ATP測定

將不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵樣品取1 mL進(jìn)行離心,留下菌體,用PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,1.8 mmol/L KH2PO4,pH 7.4)洗滌3次后進(jìn)行超聲破碎1 min,隨后10 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清至另一EP管中,加入500 μL氯仿充分振蕩混勻,10 000 r/min、4 ℃離心3 min,取上清至冰上待測,胞內(nèi)ATP測定按ATP檢測試劑盒說明書操作。

1.2.9 NADPH/NADP+測定

將不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵樣品取1 mL進(jìn)行離心,留下菌體,用PBS洗滌3次后加入適量預(yù)冷的NADP+/NADPH提取液,輕輕吹打促進(jìn)細(xì)胞裂解,隨后10 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清至冰上待測,NADPH/NADP+測定按輔酶II NADP(H)含量試劑盒說明書操作。

1.2.10 透射電鏡分析

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶在S.mobaraensis中的整合表達(dá)

胰蛋白酶是一種重要的堿性絲氨酸蛋白酶[15],廣泛應(yīng)用于皮革、紡織、制藥和食品等行業(yè)[16]。為實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的高效表達(dá),將S.mobaraensisDSM40587來源的胰蛋白酶SMT完整的開放閱讀框與tg啟動(dòng)子和K7103_26340位點(diǎn)的左右同源臂融合并克隆至pJTU1278,構(gòu)建得到SMT整合表達(dá)質(zhì)粒pJTU1278-SMT(圖2-a)。將pJTU1278-SMT轉(zhuǎn)化smY2019Δtg,通過PCR驗(yàn)證和基因測序篩選得到在K7103_26340位點(diǎn)整合SMT表達(dá)框的smY2019Δtg-SMT(圖2-a、圖2-b)。

a-雙交換整合胰蛋白酶基因示意圖;b-DNA核酸電泳圖(M-DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量;1-smY2019Δtg;2-smY2019Δtg-SMT);c-重組菌發(fā)酵過程酶活力分析;d-重組菌發(fā)酵過程蛋白電泳分析(M-蛋白marker;1-12 h;2-24 h;3-36 h;4-48 h;5-60 h)圖2 胰蛋白酶在smY2019Δtg中的表達(dá)分析Fig.2 The analysis of trypsin expression in smY2019Δtg

分別對smY2019Δtg-SMT和smY2019Δtg發(fā)酵,測定胰蛋白酶酰胺酶活力和進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。酶活力分析顯示,在發(fā)酵上清液中胰蛋白酶活力在24 h達(dá)到最高值8.0 U/mL,發(fā)酵36 h后活力迅速下降(圖2-c)。盡管未過量表達(dá)SMT,smY2019Δtg發(fā)酵上清液仍能檢測到胰蛋白酶活力,并在發(fā)酵24 h達(dá)到最大值2.2 U/mL。SDS-PAGE分析顯示,smY2019Δtg-SMT的24 h和36 h發(fā)酵上清液有較明顯的SMT條帶(理論分子質(zhì)量26 kDa)(圖2-d),而在smY2019Δtg發(fā)酵上清液中未見明顯的SMT條帶。上述結(jié)果表明,smY2019Δtg內(nèi)源的SMT具有一定的表達(dá)量,采用tg啟動(dòng)子在K7103_26340位點(diǎn)整合表達(dá)SMT能顯著提升其胞外表達(dá)水平。

2.2 過量表達(dá)gvp基因?qū)σ鹊鞍酌赴l(fā)酵的影響

目前,Gvp在胞內(nèi)的組裝機(jī)制尚不清楚,相關(guān)基因在不同宿主中的功能存在一定的差異[17]。例如,過量表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白GvpA和輔助蛋白GvpC不能促進(jìn)嗜鹽古菌中氣體囊泡形成[18],而表達(dá)藍(lán)藻Anabaenaflos-aquae和Planktothrixrubescens中GvpA和GvpC則能使釀酒酵母中產(chǎn)生氣體囊泡[19]。為分析氣體囊泡對SMT分泌表達(dá)的影響,通過單交換在smY2019Δtg-SMT中tg位點(diǎn)整合表達(dá)內(nèi)源gvpA、gvpO和完整基因簇gvp40587,分別得到重組菌smY2019Δtg-SMT-gvpA,smY2019Δtg-SMT-gvpO和smY2019Δtg-SMT-gvp40587(圖3-a)。

將構(gòu)建的重組菌進(jìn)行發(fā)酵,胰蛋白酶酰胺酶活力和SDS-PAGE電泳分析SMT表達(dá)情況。結(jié)果顯示,smY2019Δtg-SMT-gvp40587發(fā)酵到36 h胞外胰蛋白酶活達(dá)到最大值13.14 U/mL,較smY2019Δtg-SMT最高酶活(24 h)提高了64.3%;整個(gè)發(fā)酵過程的smY2019Δtg-SMT-gvp40587胞外酶活力均明顯高于smY2019Δtg-SMT,后期酶活下降速度相對較慢(圖3-b)。與smY2019Δtg-SMT相同,smY2019Δtg-SMT-gvpA胞外最高胰蛋白酶活在24 h達(dá)到最高值,但較前者提高17%(圖3-b)。如圖3-c所示,smY2019Δtg-SMT-gvp40587和smY2019Δtg-SMT-gvpA發(fā)酵上清液胰蛋白酶條帶較smY2019Δtg-SMT明顯增粗(圖3-d)。然而,smY2019Δtg-SMT-gvpO胞外胰蛋白酶及電泳條帶均與smY2019Δtg-SMT差異不大(圖3-c、圖3-d)。上述結(jié)果表明,表達(dá)完整的氣囊蛋白基因簇相對于僅表達(dá)部分氣囊結(jié)構(gòu)蛋白基因能更有效的促進(jìn)SMT在S.mobaraensis中的合成。

2.3 S.mobaraensis中g(shù)vp基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

為確認(rèn)gvp基因在S.mobaraensis中的表達(dá)情況,分別對smY2019Δtg-SMT、smY2019Δtg-SMT-gvpA、smY2019Δtg-SMT-gvpO和smY2019Δtg-SMT-gvp40587進(jìn)行定量PCR分析。在smY2019Δtg-SMT-gvpA中,除了gvpA之外,gvpO、gvpS和gvpK均不同程度上調(diào)。在gsmY2019Δtg-SMT-gvpO中,gvpO、gvpG和gvpS有較明顯上調(diào)(圖4)。gvp基因簇各基因間的表達(dá)會互相影響已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道。例如,敲除嗜鹽古菌中g(shù)vpO基因?qū)е翯vpA表達(dá)量的顯著下調(diào)[8]。然而,確切g(shù)vp基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍不清楚,有待后續(xù)研究。在smY2019Δtg-SMT-gvp40587中,關(guān)鍵調(diào)控基因gvpO和結(jié)構(gòu)蛋白基因gvpA的轉(zhuǎn)錄水平較smY2019Δtg-SMT分別提高4.2倍和3.7倍;此外,其他gvp基因轉(zhuǎn)錄水平也均高于對照菌株(圖4)。值得注意的是,輔助蛋白基因gvpJ僅在smY2019Δtg-SMT-gvp40587中明顯上調(diào)(圖4)。一般認(rèn)為,gvpJ通過與gvpA相互作用提升氣囊的穩(wěn)定性[20]。因此,gvpJ表達(dá)水平的提升可能是smY2019Δtg-SMT-gvp40587中SMT高效合成的重要原因。

圖4 S.mobaraensis中g(shù)vp基因的轉(zhuǎn)錄分析Fig.4 Transcriptional analysis of gvp genes in S.mobaraensis

2.4 過量表達(dá)gvp基因?qū).mobaraensis生理狀態(tài)的影響

由于氣體囊泡內(nèi)部充滿氣體[1],過量表達(dá)gvp基因可能有助于供氧和ATP等能量物質(zhì)的合成。在Streptomycessp.CB03234-S中過量表達(dá)其內(nèi)源氣囊蛋白基因簇后,研究者發(fā)現(xiàn)了菌株的生長形態(tài)變化和次級代謝物產(chǎn)量增加[13],但并未對胞內(nèi)的ATP等生理狀態(tài)參數(shù)進(jìn)行測定。為分析過量表達(dá)gvp基因?qū).mobaraensis生理狀態(tài)的影響,分析了gvp基因過量表達(dá)菌株的菌體生長、ATP及還原力水平等生理狀態(tài)關(guān)鍵指標(biāo)。

結(jié)果顯示,smY2019Δtg-SMT-gvp40587的菌絲生長量在24～60 h略高于smY2019Δtg-SMT和其他gvp過表達(dá)菌株(圖5-a)。此外,smY2019Δtg-SMT-gvp40587胞內(nèi)的ATP含量和NADPH/NADP+明顯高于其他菌株,且在36 h時(shí)達(dá)到最大值;其中,smY2019Δtg-SMT-gvp40587的ATP含量和NADPH/NADP+分別較smY2019Δtg-SMT高1.4倍和0.4倍(圖5-b、c)。酶或蛋白質(zhì)的合成依賴于胞內(nèi)能量和前體供給[21]。因此,能量和還原力增加可能是SMT在smY2019Δtg-SMT-gvp40587高效合成的重要原因。值得注意的是,過量表達(dá)纖維素酶A導(dǎo)致了變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)TK24中NADPH的增加[22]。目前,關(guān)于鏈霉菌gvp基因簇功能的研究極少,過量表達(dá)gvp基因簇影響S.mobaraensis胞內(nèi)能量水平和前體供給的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。為確認(rèn)過量表達(dá)gvp基因簇是否增加了胞內(nèi)氣體囊泡數(shù)量,對上述重組菌進(jìn)行了透射電鏡分析。發(fā)酵培養(yǎng)基包含不溶的大豆粉,不易與S.mobaraensis菌絲分離,嚴(yán)重干擾了透射電鏡觀測。因此,選取固體培養(yǎng)獲得的菌絲進(jìn)行分析。然而,在smY2019Δtg-SMT-gvp40587和smY2019Δtg-SMT胞內(nèi)均未見明顯的氣囊蛋白形成(圖5-d),可能是由于固體培養(yǎng)環(huán)境不利于氣體囊泡的形成。在后續(xù)研究中,將換用其他不含固形物發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵制備smY2019Δtg-SMT-gvp40587和smY2019Δtg-SMT菌絲體。

a-重組菌生長情況;b-重組菌胞內(nèi)能量;c-重組菌還原力;d-透射電鏡分析圖5 過量表達(dá)gvp基因?qū).mobaraensis生長及代謝的影響Fig.5 The effects of overexpressing gvp genes on the cell growth and metabolism of S.mobaraensis

3 結(jié)論

盡管研究者已經(jīng)在大量的鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了gvp基因簇,然而其生理功能仍不清楚。本研究在整合表達(dá)胰蛋白酶的菌株smY2019Δtg-SMT中,分別過量表達(dá)了gvpA、gvpO以及整個(gè)gvp基因簇,首次發(fā)現(xiàn)了gvp基因簇或主要結(jié)構(gòu)基因gvpA能促進(jìn)酶在S.mobaraensis中表達(dá)。此外,過量表達(dá)gvp基因簇可顯著提高胞內(nèi)的ATP含量和NADPH/NADP+。因此,能量和還原力增加可能是SMT在gvp基因簇過量表達(dá)菌株中高效合成的重要原因。值得注意的是,Streptomycessp.CB03234-S和S.mobaraensis的gvp基因簇中均不含有多數(shù)鏈霉菌的gvpY和gvpZ,其缺失對于調(diào)控氣囊蛋白形成的作用還有待進(jìn)一步分析?；趃vp基因?qū)MT在S.mobaraensis中合成的重要影響,通過調(diào)控gvp基因的表達(dá)時(shí)間和強(qiáng)度可能成為提高合成蛋白及其他代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的新策略。