蘇虹霞,高靜,姜敏,賈堯

(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 漢中,723000)

“藥食同源”植物因含有豐富的藥食兩用作用和營(yíng)養(yǎng)保健功能,逐漸成為近年來營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品開發(fā)的新熱點(diǎn)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),“藥食同源”植物活性物質(zhì)具有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)等中藥藥理特點(diǎn),其研發(fā)亦為降尿酸藥物減毒增效及輔助治療高尿酸食品開發(fā)提供新思路[3]。痛風(fēng)是一種以高尿酸為特征的代謝性疾病,黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)是參與痛風(fēng)發(fā)生與發(fā)展過程中的關(guān)鍵酶。通過抑制XO,能夠有效降低血漿尿酸水平,可以此預(yù)防和治療痛風(fēng)及高尿酸血癥[4-5]。痛風(fēng)目前尚無完全治愈的方法,從天然植物中獲取有效成分用于緩解痛風(fēng)癥狀是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[6-7]。

青錢柳是珍貴的藥食同源植物,研究表明果膠類酸性多糖CP50是青錢柳多糖的主要活性成分之一[8-9]。分子中主要含有→4) GalA (1→、→4) Glc (1→、→4) Gal (1→糖苷鍵,在半乳糖的C6位存在分支結(jié)構(gòu)[10]。目前多糖在其降尿酸作用方面逐漸被發(fā)現(xiàn),已有文獻(xiàn)報(bào)道黃芪多糖[11]、茯苓多糖[12]等,均可通過抑制XO活性阻礙尿酸合成,從而減少體內(nèi)尿酸濃度。已有文獻(xiàn)報(bào)道青錢柳提取物對(duì)XO存在抑制作用[13-14],但青錢柳多糖抗高尿酸血癥的機(jī)理研究卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)合青錢柳多糖功效范圍廣、副作用低等特點(diǎn),通過探究青錢柳中多糖化合物對(duì)XO的抑制效果,探析其降尿酸作用的酶反應(yīng)機(jī)制,旨在為尋找調(diào)節(jié)體內(nèi)嘌呤代謝的天然降尿酸產(chǎn)品的研究和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳干葉購于湖南省張家界,粉碎后過40目篩,備用。

蒽酮、葡萄糖、黃嘌呤、XO、別嘌呤醇,麥克林公司;無水乙醇,天津鑫宇精細(xì)化工;乙酸乙酯,成都市科龍化工試劑廠;以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見分光光度計(jì),日本島津有限公司;DHG-9070A烘箱,上海齊欣科學(xué)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用蒽酮-硫酸法,以葡萄糖為對(duì)照品,參照易劍平等[15]的測(cè)定方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為A=0.006 3C+0.334 4(其中A為吸光度,C為葡萄糖樣品質(zhì)量濃度,μg/mL),R2=0.992 0,其線性范圍為10～100 μg。

1.3.2 青錢柳多糖水提工藝優(yōu)化及含量測(cè)定

WHO調(diào)查了近年來29個(gè)發(fā)展中國(guó)家的普通孕婦中子癇前期發(fā)病率0.02%～7.67%，平均發(fā)病率為2.16%。針對(duì)正常孕婦的子癇前期試驗(yàn)，發(fā)病率不高。Valio等[15]研究了妊娠35～37周的3 953例單胎普通孕婦，最終只有65例發(fā)展為子癇前期。一些針對(duì)高危孕婦進(jìn)行的研究中，子癇前期的發(fā)病率明顯上升[11]。本研究中的研究對(duì)象為子癇前期高危孕婦，271例病人中有11例發(fā)病，明顯提高了sFlt-1、PLGF對(duì)于子癇前期的預(yù)測(cè)價(jià)值。早期診斷子癇前期，盡早對(duì)于高危孕婦進(jìn)行干預(yù)及監(jiān)管，減少不良圍產(chǎn)期母嬰結(jié)局的發(fā)生具有重要意義。

現(xiàn)有研究表明,青錢柳多糖是青錢柳水提液中的主要活性成分之一[16]。青錢柳多糖的提取及含量測(cè)定參照王小江等[10]的方法略作調(diào)整。為除去青錢柳中的甙類、生物堿、有機(jī)酸等醇溶性物質(zhì),將15 g青錢柳粉末,以300 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇回流提取2 h,過濾,濾渣干燥用于后續(xù)多糖提取。

1.3.2.1 青錢柳多糖水提工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn):稱取0.5 g上述處理過的青錢柳粉末,分別以不同料液比(1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100, g∶mL)、浸提時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3 h)、浸提溫度(60、70、80、90、100 ℃)為單一自變量,固定其他提取條件不變,提取次數(shù)2次,考察不同單因素條件對(duì)青錢柳多糖得率的影響。

正交試驗(yàn):根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取料液比、時(shí)間和溫度3個(gè)因素,以青錢柳多糖得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn),對(duì)青錢柳多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.2.2 青錢柳多糖得率計(jì)算

將青錢柳水提液濃縮、50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇醇析、洗滌、干燥后,采用上述1.3.1中蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定青錢柳水提物中粗多糖CP50含量,按公式(1)計(jì)算樣品中多糖得率。

(1)

式中:ρ,由回歸方程得出的多糖質(zhì)量濃度,mg/mL;V,稀釋體積,mL;m,青錢柳多糖提取物的質(zhì)量,mg。

1.3.3 青錢柳粗多糖對(duì)XO抑制率研究

(2)

式中:A1,測(cè)活體系中含抑制劑的酶活力值;A2,測(cè)活體系中不含抑制劑的空白酶活力值。

1.4 XO與青錢柳多糖CP50分子對(duì)接機(jī)制研究

Auto Dock Tools 軟件可以預(yù)測(cè)青錢柳多糖與XO的相互作用信息,分子對(duì)接在Auto Dock Tools-1.5.7程序上執(zhí)行。依據(jù)文獻(xiàn)[10]得出青錢柳多糖分離純化后的主要成分CP50的結(jié)構(gòu)排列情況,將CP50的3D結(jié)構(gòu)在Chem3D Pro 14.0中生成,能量處理最小化。從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得了XO(PDB∶1FIQ)的X射線晶體結(jié)構(gòu)(http://www.rcsb.org/)。用AutoDock工具檢測(cè)并分配配體的旋轉(zhuǎn)鍵,去除所有水分子和配體、添加氫原子、加電荷、分配原子類型和修復(fù)多肽鏈的缺失和末端殘基。該蛋白質(zhì)是通過定義了一個(gè)網(wǎng)格框,將XO的整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)包圍起來,尺寸為40 ?×40 ?×40 ?和0.375 ?的網(wǎng)格間距,設(shè)置C鏈的活性中心坐標(biāo)為(X,Y,Z)=(37.733,20.262,18.48)。對(duì)接計(jì)算采用拉馬克遺傳算法,局部搜索,運(yùn)行次數(shù)為50次,所有其他雜項(xiàng)參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值。經(jīng)前處理和指令運(yùn)行后,根據(jù)結(jié)合能最低原則,選擇具有最低結(jié)合能和最高百分比頻率的對(duì)接模型作為最優(yōu)的結(jié)合模式。將AutoDock的輸出CP50-XO配合物的主導(dǎo)構(gòu)象用Pymol進(jìn)一步渲染,以提供可見的綁定情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳多糖水提法最佳工藝的確定

2.1.1 單因素試驗(yàn)

圖1～圖3分別為料液比、時(shí)間及溫度對(duì)青錢柳多糖得率的影響曲線。由圖1可知,青錢柳多糖得率從1∶20(g∶mL)到1∶40(g∶mL)遞增趨勢(shì)明顯,1∶40(g∶mL)到1∶100(g∶mL)遞增趨勢(shì)趨于平緩,從經(jīng)濟(jì)角度考慮,選用1∶40(g∶mL)為青錢柳多糖提取最佳料液比;由圖2可知,提取時(shí)間在1～2 h青錢柳多糖得率隨提取時(shí)間呈遞增趨勢(shì),在2～3 h青錢柳多糖得率隨提取時(shí)間逐漸遞減,這是因?yàn)殡S著水提時(shí)間延長(zhǎng),多糖在高溫下發(fā)生氧化分解,導(dǎo)致多糖得率下降。所以青錢柳多糖提取時(shí)間不宜過長(zhǎng)。綜上,本實(shí)驗(yàn)選取最佳提取時(shí)間為2 h;由圖3可知,提取溫度在60～90 ℃,青錢柳多糖得率呈遞增趨勢(shì),在90～100 ℃,多糖得率仍有增加,但增加速率減小,從經(jīng)濟(jì)角度考慮,本實(shí)驗(yàn)選取90 ℃為最適提取溫度。

圖1 不同料液比對(duì)青錢柳粗多糖提取的影響Fig.1 Effects of different material-liquid ratio on extraction of crude polysaccharides from Cyclocarya Paliurus

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)青錢柳粗多糖提取的影響Fig.2 Effects of different extraction times on extraction of crude polysaccharides from Cyclocarya Paliurus

圖3 不同溫度對(duì)青錢柳粗多糖提取的影響Fig.3 Effects of different temperature on extraction of crude polysaccharides from Cyclocarya Paliurus

2.1.2 正交試驗(yàn)

青錢柳多糖的提取正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)青錢柳多糖得率影響的順序?yàn)锳>B>C。熱水浸提法提取青錢柳多糖的最佳工藝條件組合為A2B2C3,即料液比為1∶40(g∶mL),提取時(shí)間為2 h,提取溫度100 ℃。在此較優(yōu)提取工藝條件下,熱水浸提青錢柳干葉多糖得率為1.67%。本實(shí)驗(yàn)得到的多糖得率與文獻(xiàn)報(bào)道的存在差異,可能與青錢柳干葉的采集時(shí)間和測(cè)定反應(yīng)條件等因素有關(guān)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of the orthogonal experiment

2.2 XO抑制率計(jì)算結(jié)果分析

體外測(cè)定不同質(zhì)量濃度(1、5、10、15、20 μg/mL)的別嘌醇和不同質(zhì)量濃度(200、400、600、800、1 000 μg/mL)的青錢柳粗多糖對(duì)XO的抑制結(jié)果如圖4所示,在不同質(zhì)量濃度抑制劑條件下,隨著抑制劑濃度的增大,XO的相對(duì)酶活性不斷降低。由此推斷出青錢柳提取物多糖對(duì)XO有抑制作用。由圖4可知,當(dāng)青錢柳粗多糖溶液質(zhì)量濃度為0～1 000 μg/mL時(shí),隨著質(zhì)量濃度的增加,青錢柳多糖對(duì)XO的抑制性逐漸增強(qiáng)基本呈線性相關(guān),表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系,在此范圍內(nèi)青錢柳粗多糖對(duì)酶的活性抑制率分別可達(dá)70.4%。利用SPSS對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,計(jì)算得別嘌醇和青錢柳粗多糖在本實(shí)驗(yàn)條下對(duì)XO的IC50分別為11.01、825.11 μg/mL。對(duì)XO的抑制效果,青錢柳多糖雖不及陽性對(duì)照物別嘌醇,但值得關(guān)注的是,75倍率的青錢柳水提液天然產(chǎn)物抑制值即可等同于相應(yīng)的陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦可為食源性青錢柳葉茶的沖泡條件提供應(yīng)用數(shù)據(jù)支持。

圖4 別嘌醇、青錢柳粗多糖對(duì)黃嘌呤氧化酶的作用Fig.4 Effects of the extracts of allopurinol and crude polysaccharides from Cyclocarya paliurus on xanthine oxidase

2.3 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果解析

分子對(duì)接是預(yù)測(cè)配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物可見結(jié)合模式的一種重要的方法[18]。文獻(xiàn)[10]表明青錢柳多糖的主要活性物質(zhì)為CP50,分子對(duì)接提高了我們對(duì)CP50和XO之間相互作用的理解,并直觀地說明了CP50和XO之間的相互作用。XO(PDB代碼:1FIQ)由獨(dú)立的亞單位組成,每個(gè)亞單位包含C鏈中的一個(gè)Mo中心、鏈中的2個(gè)不相同的鐵硫中心([2Fe-2S]簇)和B鏈中的一個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)輔因子[19]。通過使用2.0 ?的均方根偏差公差進(jìn)行聚類分析,根據(jù)能量大小排列構(gòu)象簇的結(jié)合能。結(jié)合能為負(fù)數(shù)表示蛋白質(zhì)與小分子存在結(jié)合的可能,通常數(shù)值<-5 kcal/mol被認(rèn)為結(jié)合可能性較大。結(jié)合能數(shù)據(jù)如表3所示,CP50與XO的最佳結(jié)合親和力<-5 kcal/mol,這意味著小分子CP50與XO具備較為理想的潛在活性效果,分子對(duì)接結(jié)果見圖5。

圖5 CP50-XO分子對(duì)接可視化圖Fig.5 Visualization of CP50-XO molecular docking

表3 分子對(duì)接獲得的小分子-蛋白結(jié)合親和力評(píng)估表Table 3 Small molecule-protein binding affinity evaluation table based on AutoDock Vina docking

圖6為CP50-XO分子對(duì)接Surface圖,綠色為XO的活性孔腔,粉色stick表示CP50分子,紅色是Mo-pt輔因子,圖像可以看出插入活性腔的CP50分子是通向XO活性位點(diǎn)的狹長(zhǎng)通道。這表明一旦抑制劑堵塞了活性腔,通道和周圍空間大部分會(huì)被堵塞,這可能導(dǎo)致底物(黃嘌呤、次黃嘌呤)的著陸受阻,并最終降低XO的催化能力。

圖6 CP50-XO分子對(duì)接表面圖Fig.6 Surface map of CP50-XO molecular docking

圖7為CP50-XO分子對(duì)接二維圖,CP50分子在Leu648、Leu873、Phe914、Phe1009、Leu1014、Pro1076、Ala1078、Glu1261、Glu802、Ser876、Arg880、Ala1079、Thr1010、Val1011氨基酸圍繞而成的口袋當(dāng)中,且與 Leu648、Leu873、Phe914、Phe1009、Leu1014、Pro1076、Ala1078和Glu1261疏水殘基相鄰,在結(jié)合圖6中CP50分子是插入活性孔腔,說明CP50可能與相關(guān)氨基酸殘基相互作用,表明CP50與XO的結(jié)合存在疏水相互作用。此外,Glu802和Arg880被證明在黃嘌呤的羥基化中起關(guān)鍵作用[20],表明CP50可能與基質(zhì)具有相同的結(jié)合區(qū)域。

圖7 CP50-XO相互作用二維圖Fig.7 Two-dimensional diagram of interaction CP50-XO

圖8中CP50-XO的三維結(jié)構(gòu)表明CP50分子和XO殘基Glu802、Ser876、Arg880、Ala1079、Thr1010、Val1011之間形成了氫鍵,表明氫鍵是CP50和XO之間結(jié)合的另一個(gè)主要作用。綜合來說,XO與青錢柳多糖CP50的主要作用為疏水和氫鍵作用,該作用可能是CP50對(duì)XO發(fā)生效果的主要作用類型。

圖8 CP50-XO相互作用三維圖Fig.8 3D map of interaction CP50-XO

3 結(jié)論

本研究得出青錢柳粗多糖CP50的較優(yōu)水提工藝為提取時(shí)間2 h,提取溫度為100 ℃,料液比1∶40(g∶mL)。基于上述實(shí)驗(yàn)條件,青錢柳粗多糖得率為1.67%。酶促實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,青錢柳多糖對(duì)XO有抑制作用,對(duì)XO抑制作用的IC50為0.825 mg/mL,其抑制效果雖不及陽性對(duì)照別嘌呤醇,亦可為天然源青錢柳葉茶的沖泡條件提供食源性應(yīng)用數(shù)據(jù)支持。分子對(duì)接進(jìn)一步證實(shí):疏水相互作用和氫鍵在形成穩(wěn)定的復(fù)雜構(gòu)象中的重要作用。CP50與酶的自發(fā)結(jié)合一般會(huì)導(dǎo)致XO二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化,從而進(jìn)一步改變酶的三級(jí)結(jié)構(gòu),阻止底物與酶的結(jié)合,從而有效抑制XO的活性,減少尿酸的產(chǎn)生。

綜上,本研究表明青錢柳多糖CP50對(duì)XO有較好的抑制效果,可為CP50作為一種有效的膳食多糖應(yīng)用于高尿酸血癥患者的飲食中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。