史梅莓,楊愷,呂鵬軍,張其圣,,陳功,,王勇,汪冬冬,尹禮國,伍亞龍*

1(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院有限公司,四川 成都,611130) 2(四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術研究院,四川 眉山,620000) 3(四川益動源生物科技有限公司,四川 眉山,620000)4(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)

泡菜是我國典型的傳統(tǒng)發(fā)酵食品,因其獨特的風味、脆嫩清香的口感受到大眾喜愛。隨著市場需求的增長,泡菜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)展迅速,而采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方式,其復雜的微生物群落演替容易受環(huán)境的影響,工業(yè)化生產(chǎn)其品質(zhì)難以穩(wěn)定,且發(fā)酵周期長。研究表明,人工接種發(fā)酵是穩(wěn)定產(chǎn)品品質(zhì)的有效方法[1]。泡菜是以乳酸菌為主導發(fā)酵而成,包括乳桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬等優(yōu)勢菌[2-3]。其中,腸膜明串珠菌、植物乳桿菌等常用作四川泡菜發(fā)酵菌株。如樸泓潔等[4]接種腸膜明串珠菌發(fā)酵四川泡菜,發(fā)現(xiàn)可以縮短發(fā)酵周期,加強了泡菜食用安全性;隋明等[5]利用植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌作為發(fā)酵劑,獲得了口感和質(zhì)量較好的甘藍泡菜;經(jīng)騏源等[6]研究表明布氏乳桿菌、植物乳桿菌、毛榛畢赤酵母發(fā)酵泡蘿卜,能賦予產(chǎn)品良好的營養(yǎng)價值和風味。

風味是評價泡菜品種的重要指標之一,在發(fā)酵過程中,除原輔料本身賦予風味之外,微生物的代謝活動是泡菜獨特風味形成的重要因素[7]。有研究表明,接種泡菜發(fā)酵過程中菌種相對單一,其細菌群落結構更加穩(wěn)定,易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)中的品質(zhì)把控,但其風味較為單一,自然發(fā)酵泡菜風味物質(zhì)更為豐富[8-9]。而LUO等[10]研究表明混合發(fā)酵劑發(fā)酵泡菜其感官性能更好,具有替代老鹵水制備四川泡菜的潛力。多輪發(fā)酵作為四川泡菜最常見的發(fā)酵方式,一般是泡菜成熟后保留原有的泡菜水,更換新鮮蔬菜,反復循環(huán)后形成含有大量微生物、有機酸等的穩(wěn)定系統(tǒng)[11],而目前對于不同菌株對多輪發(fā)酵四川泡菜品質(zhì)影響的報道較少。因此,本研究以植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、食竇魏斯氏菌作為發(fā)酵菌株,研究單菌與多菌對多輪發(fā)酵四川泡菜風味品質(zhì)的影響,以期開發(fā)出泡菜品質(zhì)穩(wěn)定、風味接近自然發(fā)酵泡菜的發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅皮蘿卜、甘藍、紅小米椒、姜等蔬菜,均購于超市;植物乳桿菌PC45(LactobacillusplantarumPC45)、腸膜明串珠菌PC137(LeuconostocmesenteroidesPC137)、食竇魏斯氏菌PC149(WeissellacibariaPC149),四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院有限公司實驗室保藏;氯化鈉、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀,成都市科隆化學品有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GCMS-TQ8040氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津儀器公司;VF-WAXms(60 m×0.25 mm,0.25 μm)色譜柱,美國安捷倫公司;ESJ200-4A電子天平,沈陽龍騰電子有限公司;XH-B旋渦混合器,江蘇天翎儀器有限公司;LDZF-75L-II立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;BSP-150生化培養(yǎng)箱,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;SW-CJ-1FD潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;PHSJ-3F pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;LC-MS-M1磁力攪拌器,上海力辰邦西儀器科技有限公司;TG-16高速離心機,四川蜀科儀器有限公司;DW-86L338 J超低溫保存箱,青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液制備

將植物乳桿菌PC45、腸膜明串珠菌PC137和食竇魏斯氏菌PC149分別接種于MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)18 h(菌體濃度約為108CFU/mL),6 000 r/min離心5 min后棄去上清液,用同體積的無菌生理鹽水(0.85% NaCl,質(zhì)量分數(shù))洗滌2次后重懸備用。

1.3.2 泡菜的制備與取樣

(1)泡菜配方(g):紅皮蘿卜300、甘藍200、水 1 000、白砂糖10、食鹽42、紅小米椒5、老姜片20、花椒0.3。

(2)泡菜的制備:紅皮蘿卜、甘藍、紅小米椒、生姜等用清水除去表面雜質(zhì)污物,再用純凈水清洗,瀝干、切分,其中紅皮蘿卜切成2 cm×1 cm×1 cm小長方塊,甘藍清洗干凈切成2 cm×3 cm小段,生姜切成厚薄均勻的薄片,鮮紅小米辣均勻切段;玻璃壇子先用沸水燙洗2～3遍后用酒精棉擦洗備用;將所有原料加入壇中后加入15 mL菌懸液,混勻后壇沿加水密封,20 ℃恒溫培養(yǎng),以不加菌懸液的自然發(fā)酵泡菜作為對照組。

(3)取樣:采用3輪發(fā)酵方式,0～5 d為第1輪發(fā)酵,第5天進行換菜;6～8 d為第2輪發(fā)酵,第8天進行換菜;9～11 d為第3輪發(fā)酵。即取0、1、2、3、4、5、6、8、9、11 d的泡菜水測定pH、總酸;取0、3、5、8、11 d泡菜水測定揮發(fā)性風味成分;取第5天的泡菜進行感官評價。

1.3.3 pH和總酸的測定

用pH計測定泡菜水pH;總酸的測定按照GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》中的pH計電位滴定法進行測定,pH 8.2為滴定終點,總酸含量以乳酸計。

1.3.4 泡菜揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

樣品處理和檢測條件[12]:取樣液2 mL和5 μL內(nèi)標(4-甲基-2-戊醇甲醇溶液,質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL)加入15 mL頂空進樣瓶中,混勻密封置于40 ℃恒溫槽中水浴加熱平衡30 min,將老化后的固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)萃取頭插入到頂空進樣瓶中吸附30 min,于250 ℃條件下解析5 min,每個樣品獨立測定2次。GC條件:不分流進樣模式;進樣溫度40 ℃;進樣口溫度250 ℃;總流量50 mL/min;載氣He;載氣流量1.2 mL/min。柱溫40 ℃(0 min)以16 ℃/min到75 ℃(保持0 min),以2 ℃/min到94 ℃(保持1 min),以2 ℃/min到110 ℃(保持1 min),以3 ℃/min到122 ℃(保持1 min),以2 ℃/min到130 ℃(保持1 min),以2 ℃/min到136 ℃(保持1 min),以2 ℃/min到143 ℃(保持1 min),以6 ℃/min到200 ℃(保持5 min)。MS條件:電子離子源(EI),電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃;接口溫度250 ℃;檢測器電壓0.1 kV;Scan采集方式,掃描質(zhì)量范圍m/z35.00～350.00 amu。

定性和定量分析:色譜峰對應的質(zhì)譜與NIST17、FFNSC1.3譜庫檢索對比,保留匹配度>80%的鑒定結果,得到各揮發(fā)性風味物質(zhì)。采用4-甲基-2-戊醇甲醇(0.5 μg/mL)為內(nèi)標進行半定量分析,響應值都設為1,計算出各組分的質(zhì)量濃度。

氣味活度值(odor activity value,OAV)分析:查閱各揮發(fā)性風味物質(zhì)的閾值,以OAV表示每種香氣物質(zhì)的濃度與其閾值的比值來評估該物質(zhì)對樣本整體風味的貢獻程度,OAV>1作為重要香氣成分。

1.3.5 感官評價

邀請6名有品評經(jīng)驗的人員對泡菜樣品進行感官評定。分別從色澤、酸味、脆度、香氣、形態(tài)5個方面進行評價,分數(shù)為1～5分,即可忽略的、小、中、強和非常強。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,Origin 2018軟件進行繪制結果圖,SIMCA 14.1軟件進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

2 結果與分析

2.1 不同單菌和多菌發(fā)酵泡菜

2.1.1 不同單菌和多菌對泡菜pH和總酸的影響

發(fā)酵過程中泡菜pH和總酸的變化情況如圖1所示,單菌和多菌接種發(fā)酵對泡菜發(fā)酵速度具有顯著的影響,尤其是在發(fā)酵初期。單菌發(fā)酵組如圖1-a和圖1-c所示,各組pH和總酸分別在發(fā)酵第1、2天和前3 d的差別較大,發(fā)酵至第2天時,接種腸膜明串珠菌pH下降至3.64,總酸為0.19 g/100 mL,而自然發(fā)酵pH和總酸分別為4.79、0.08 g/100 mL;3 d后各組之間差距減小,單菌接種發(fā)酵速度為腸膜明串珠菌>食竇魏斯氏菌>植物乳桿菌?；炀l(fā)酵組(圖1-b、圖1-d)對泡菜發(fā)酵速度也有一定影響,尤其是添加了腸膜明串珠菌的各個組合,其發(fā)酵速度顯著快于其他組,發(fā)酵至第2天時,添加腸膜明串珠菌的組合pH均在3.7左右,總酸為0.16～0.18 g/100 mL,而L-W組pH為4.13,總酸為0.10 g/100 mL;3 d后各組別的pH差異較小,總酸則略有差異,尤其是前期發(fā)酵速度較快且以腸膜明串珠菌主導發(fā)酵的單菌和多菌發(fā)酵組,其整個發(fā)酵過程中的總酸顯著高于其他組別,一直延續(xù)到發(fā)酵結束。

a-單菌pH值;b-多菌pH值;c-單菌總酸含量;d-多菌總酸含量圖1 不同單菌和多菌對四川泡菜pH和總酸的影響Fig.1 Effects of different single-bacteria and multi-bacteria on pH and total acid of Sichuan pickles注:LP:植物乳桿菌;Leu.m:腸膜明串珠菌;WC:食竇魏斯氏菌;L-E:植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌(體積比1∶1);E-W:腸膜明串珠菌∶食竇魏斯氏菌(體積比1∶1);L-W:植物乳桿菌∶食竇魏斯氏菌(體積比1∶1);L-E-W:植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌∶食竇魏斯氏菌(體積比1∶1∶1)(下同)

接種發(fā)酵對發(fā)酵前期影響較大,單一菌株接種發(fā)酵顯示接種腸膜明串珠菌、食竇魏斯氏菌可以顯著加快發(fā)酵速度;混合接種發(fā)酵結果表明,與腸膜明串珠菌組合的各發(fā)酵組發(fā)酵速度較快。大量研究表明,腸膜明串珠菌、食竇魏斯氏菌是啟動泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌株,在接種發(fā)酵初期會迅速繁殖,改變泡菜酸性環(huán)境,顯著加速泡菜的發(fā)酵速度[13-14]。泡菜的菌群結構復雜,在發(fā)酵過程中會逐步演變?yōu)槿郝浣Y構較為單一的穩(wěn)定體系,且蔬菜本身攜帶有大量乳酸菌,經(jīng)過不斷地群落演替和換菜,接菌對后期發(fā)酵已不起主導作用[15]。而發(fā)酵后期總酸存在差異,可能與腸膜明串珠菌具有高產(chǎn)酸能力,早期產(chǎn)生大量酸并不斷積累,使發(fā)酵結束總酸含量不同有關[16]。

2.1.2 泡菜中揮發(fā)性風味成分

通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分析接種單菌和多菌泡菜多輪發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風味物質(zhì),發(fā)酵0、3、5、8、11 d的泡菜液共檢測到揮發(fā)性風味物質(zhì)85種,包括醇類27種、醛酮類17種、酯類16種、酸類2種、烴類13種、含硫化合物2種、苯環(huán)類5種、其他化合物3種。如圖2所示,隨著發(fā)酵的進行,各組泡菜的風味成分更加豐富,酯類、含硫化合物、酸類等多種物質(zhì)增加。

圖2 不同單菌和多菌對四川泡菜揮發(fā)性成分的影響Fig.2 Effects of different single-bacteria and multi-bacteria on the volatile components of Sichuan pickles

所有組泡菜風味成分均以醇類為主,相對含量在55%以上;醇類物質(zhì)對泡菜風味有重要作用,是酯化反應的重要前體物質(zhì),到發(fā)酵后期,乙醇、桉葉油醇、芳樟醇、4-萜品醇、α-松油醇等物質(zhì)含量增加,并產(chǎn)生異戊醇、己醇、2-十一醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇等,多種醇類物質(zhì)賦予了泡菜愉快的香氣。醛類物質(zhì)閾值較低,可以賦予泡菜花香、果香,尤其是在第8、11天時,壬醛、正葵醛、甲基壬基甲酮、2-十三烷酮、乙偶姻等醛酮類物質(zhì)含量較高。酯類是賦予泡菜風味的重要物質(zhì)之一,在發(fā)酵中后期醇類與有機酸反應形成了豐富的酯類物質(zhì),其中異硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基異硫氰酸酯、3-(甲硫基)丙基異硫氰酸酯、三芥子酸甘油脂等酯類含量較高,這些香氣物質(zhì)主要來源于是十字花科蔬菜,是十字花科蔬菜中大量存在的硫苷酶解產(chǎn)物,具有殺菌、抗癌等作用[17],其香氣濃郁,使泡菜呈現(xiàn)辛辣風味,有研究表明異硫氰酸酯類是甘藍泡菜的特征風味物質(zhì)[18]。隨著微生物的生長繁殖,酸類物質(zhì)含量增加,不僅可增加泡菜的酸味,對酯類物質(zhì)的生成也作出了一定的貢獻。烴類物質(zhì)包括烷烴和烯烴,其香氣閾值較高,對泡菜的風味貢獻不大。含硫化合物主要包括二甲基二硫醚和二甲基三硫,在第5、8天的泡菜中相對含量較高,發(fā)酵結束時由于微生物的作用部分發(fā)生降解,有研究表明含硫化合物是蘿卜泡菜的重要風味物質(zhì)[19]。苯環(huán)類物質(zhì)主要以2,4-二叔丁基苯酚為主,發(fā)酵后期有少量的對乙基苯酚、1,3-二叔丁基苯等物質(zhì)出現(xiàn)。此外,茴香腦、4-烯丙基苯甲醚等物質(zhì)具有茴香香氣,對泡菜的風味作出了一定的貢獻。

泡菜中的香氣不僅與其含量有關,與其閾值也有很大關系。采用OAV法確定第5、11天時對泡菜風味起重要貢獻的風味成分,以OAV>1作為重要香氣成分。由表1可知,共得到16種重要香氣成分,且各組均以二甲基三硫、桉葉醇、芳樟醇3種成分貢獻度最大,與第5天相比,第11天時新增加乙偶姻、乙酸苯乙酯兩種成分,乙偶姻具有令人愉快的奶油香,乙酸苯乙酯則具有似玫瑰、蜂蜜香氣。其中第5天時,二甲基三硫、桉葉醇、芳樟醇、α-松油醇物質(zhì)在Leu.m組中貢獻最大;正辛醛、壬醛、正葵醛在L-E組貢獻最大。第11天時,二甲基三硫、二甲基二硫醚、乙偶姻、異硫氰酸烯丙酯、3-(甲硫基)丙基異硫氰酸酯、三芥子酸甘油酯均在L-W組貢獻最大;其次,桉葉醇、芳樟醇、α-松油醇、乙酸苯乙酯在E-W組中貢獻最大。此外,D-檸檬烯、大茴香腦其OAV值始終在對照組中較高。

表1 泡菜發(fā)酵第5、11天時的重要風味成分Table 1 Important flavor components of pickles fermentation at the 5th and 11th days

對各組發(fā)酵0、3、5、8、11 d泡菜的揮發(fā)性風味成分進行無監(jiān)督的PCA,共得到3個主成分,R2X=0.846,Q2=0.617,二者均大于0.5,說明PCA效果較好。如圖3所示,除個別樣品外絕大部分樣品均在置信區(qū)間內(nèi),不同的發(fā)酵時間以及不同的組別之間距離存在差異。第0天時,各組較為集中,且和其他發(fā)酵時間的樣品能很好的區(qū)分開,表明隨著發(fā)酵的進行,泡菜液中的揮發(fā)性成分發(fā)生了變化。第3、5天的樣品距離較近,同一發(fā)酵時間里各組距離有差異,而第8、11天同一發(fā)酵時間各組更為分散,說明接菌發(fā)酵對多輪泡菜的揮發(fā)性風味成分具有較大的影響,同一組別在不同的發(fā)酵時間揮發(fā)性成分具有差異。發(fā)酵結束時,LP、L-W兩組與CK組距離較近,說明該兩組在風味上更加接近自然發(fā)酵泡菜,XIANG等[20]研究結果表明相對于單菌發(fā)酵,植物乳桿菌和食竇魏斯氏菌共接種可以提高四川泡菜揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類及含量,從而提高整體的感官接受度。

圖3 不同單菌和多菌接種發(fā)酵四川泡菜揮發(fā)性成分PCAFig.3 PCA of volatile components in Sichuan pickles inoculated with different single-bacteria and multi-bacteria

2.1.3 感官評價

感官評價是判斷泡菜品質(zhì)的重要方法,發(fā)酵泡菜的感官評分結果如圖4所示,不同的接種發(fā)酵泡菜的感官品質(zhì)具有一定差異。各組泡菜在形態(tài)上差異不大,Leu.m、L-E兩組泡菜顏色鮮艷,色澤較好,Leu.m和對照組表現(xiàn)出更強的酸味,而在脆度上對照組的泡菜表現(xiàn)最佳;在泡菜風味上,Leu.m組泡菜具有令人較為不愉悅的氣味,普遍較難接受,且所有添加腸膜明串珠菌的組均有該令人不愉悅的氣味,強烈程度不一;在所有接菌發(fā)酵組中,L-W組泡菜香氣得分值最高,其風味更接近傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜,更受大家喜歡。

圖4 感官評價結果Fig.4 Sensory evaluation results

綜上所述,L-W組泡菜尤其在風味上與傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜相似,因此確定L-W組為最佳組。

2.2 不同比例植物乳桿菌和食竇魏斯氏菌對泡菜的影響

2.2.1 不同比例植物乳桿菌和食竇魏斯氏菌對泡菜pH和總酸的影響

前期試驗中接種發(fā)酵3 d后各組差異較小,且泡菜基本成熟,因此采用發(fā)酵時間為3 d,觀察不同比例的食竇魏斯氏菌和植物乳桿菌對泡菜pH和總酸的影響。如圖5所示,各組泡菜的pH和總酸變化趨勢基本一致。隨著植物乳桿菌比例的增加,泡菜pH更低,總酸更高,當植物乳桿菌和食竇魏斯氏菌的體積比為6∶4、8∶2時,pH和總酸差異不大,因此確定植物乳桿菌和食竇魏斯氏菌體積比為6∶4較佳。

a-pH變化;b-總酸變化圖5 不同比例植物乳桿菌與食竇魏斯氏菌發(fā)酵泡菜中pH和總酸的變化Fig.5 Changes of pH and total acid in pickles fermented with Lactobacillus plantarum and Weissella cibaria with different proportions

2.2.2 感官評價

不同比例植物乳桿菌和食竇魏斯氏菌發(fā)酵泡菜的感官評價結果如圖6所示,所有組泡菜在形態(tài)和脆度上差異較小。接種較高比例植物乳桿菌發(fā)酵泡菜,其色澤更佳,酸味表現(xiàn)更突出,泡菜風味較好。

圖6 感官評價結果Fig.6 Sensory evaluation results

3 結論

本研究以植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、食竇魏斯氏菌為出發(fā)菌株,研究不同單菌及多菌對泡菜pH、總酸、揮發(fā)性風味成分以及感官評價的影響。結果表明,接菌可以快速啟動泡菜發(fā)酵,3種單菌產(chǎn)酸速度為腸膜明串珠菌>食竇魏斯氏菌>植物乳桿菌,且可以快速豐富泡菜的色澤,呈現(xiàn)為腸膜明串珠菌組>植物乳桿菌組>食竇魏斯氏菌組,泡菜質(zhì)量更加穩(wěn)定。通過GC-MS分析泡菜揮發(fā)性風味成分,結果顯示到發(fā)酵結束時,7組發(fā)酵泡菜共檢出揮發(fā)性風味物質(zhì)包括醇類、醛酮類、酯類、酸類、烴類、含硫化合物、苯環(huán)類以及其他化合物共85種,其中以醇類為主;OAV分析共得到16種重要香氣成分;PCA結果顯示植物乳桿菌、植物乳桿菌-食竇魏斯氏菌2組泡菜風味更接近于自然發(fā)酵泡菜。而在感官評價中發(fā)現(xiàn),接種腸膜明串珠菌的單菌組及其多菌組的泡菜,均產(chǎn)生令人不愉悅的氣味,較難接受,其余組中以植物乳桿菌-食竇魏斯氏菌組泡菜最佳。當植物乳桿菌與食竇魏斯氏菌復配,且體積比為6∶4時,泡菜風味好,可接受度高。綜上所述,發(fā)酵速度并不是判斷接菌發(fā)酵泡菜品質(zhì)的主要因素,合理的發(fā)酵速度和適宜的菌種組合才是關鍵,研究結果可作為一種發(fā)酵劑為進一步應用于多輪泡菜發(fā)酵奠定基礎。