孟雨薇,陳偉波,周軍,2,李湘洲,2*

1(中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙,410004) 2(南方林業(yè)生態(tài)應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙,410004)

桑(MorusalbaL.)為?？粕俚穆淙~喬木或灌木,在世界各地分布廣泛。桑葉作為藥食同源植物,含有多種活性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、多糖、生物堿、多酚、維生素、礦物質(zhì)等[1],具有降低膽固醇[2]、防治糖尿病[3]、預(yù)防肥胖[4]、抗氧化[5]等功能。已有研究表明,桑葉中蛋白質(zhì)含量占其干基重的15%～30%,且不含膽固醇。由于桑葉蛋白質(zhì)含量和體內(nèi)消化率高,其被認(rèn)為是工業(yè)消費(fèi)的潛在植物蛋白質(zhì)來(lái)源[6]。但目前,桑葉主要用于桑蠶業(yè)的飼料以及提取生物堿等,僅少量加工為桑葉茶等飲料及功能產(chǎn)品,在食品等領(lǐng)域還未得到充分開發(fā)與應(yīng)用。

酚類化合物具有至少一個(gè)芳香環(huán)和一個(gè)或多個(gè)羥基,是一種天然抗氧化劑,此外酚類化合物還具有抑菌、抗過敏、抗衰老、抗腫瘤和抗糖尿病等功能,受到廣泛的關(guān)注[7]。酚類物質(zhì)作為桑葉的主要活性成分之一,主要包括綠原酸、蘆丁、白藜蘆醇等11種單體[8]。研究表明,酚類與蛋白、多糖和油脂等生物大分子之間可以通過氫鍵、疏水相互作用、范德華力和靜電相互作用發(fā)生可逆的非共價(jià)相互作用或通過蛋白質(zhì)中的親和殘基與醌形成共價(jià)鍵發(fā)生不可逆的共價(jià)相互作用[9],從而改變蛋白質(zhì)的消化功能,并對(duì)食品體系產(chǎn)生明顯的影響。ZHAO等[10]研究發(fā)現(xiàn)單寧酸和沒食子酸會(huì)降低魚皮膠原蛋白和酪蛋白的水解程度并影響其抗氧化性能。雷選[11]的研究表明,桑葚多酚可以抑制酪蛋白在小腸階段的水解。ZHOU等[12]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯相互作用形成的共價(jià)復(fù)合物抗消化能力較強(qiáng),在腸道中更加穩(wěn)定。

蛋白質(zhì)和酚類化合物在包括桑葉等多種食物或食物混合物中天然存在,這些化合物之間的相互作用在食品加工、運(yùn)輸、貯藏及食用后對(duì)機(jī)體的影響至關(guān)重要[13]。然而目前大部分研究主要集中于外源酚類物質(zhì)對(duì)蛋白性質(zhì)的影響,而對(duì)植物內(nèi)源酚類與蛋白的相互作用研究較少。綠原酸(chlorogenic acid, Cla)和白藜蘆醇(resveratrol, Res)作為桑葉內(nèi)源酚類物質(zhì),在加工和食用等過程中可能與桑葉蛋白(mulberry leaf protein, MLP)發(fā)生相互作用,從而影響桑葉蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特性,但此方面的研究報(bào)道較少。因此,本文選取桑葉內(nèi)源酚類物質(zhì)綠原酸和白藜蘆醇,利用紫外-可見光光譜、熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜分別研究其與桑葉蛋白的相互作用及對(duì)蛋白體外消化和抗氧化等功能性質(zhì)的影響,以期揭示食物內(nèi)源性酚類化合物與蛋白之間的影響規(guī)律,為桑葉功能性產(chǎn)品的開發(fā)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉蛋白,西安國(guó)豪生物科技有限公司;98%白藜蘆醇、98%綠原酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶,上海源葉生物科技有限公司;DPPH(純度>97.0%),梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;ABTS(純度>98.0%),上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-B水浴恒溫振蕩器,上海汗諾儀器有限公司;Alpha傅里葉紅外變換光譜儀,美國(guó)布魯克公司;TU-1801紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;F-7000型熒光分光光度計(jì),日本日立公司;電子分析天平,蘇州島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桑葉酚類/蛋白溶液的制備

稱取一定質(zhì)量的桑葉蛋白粉,溶解至0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)中,取上清液,4 ℃貯藏備用。另稱取一定質(zhì)量的Res和Cla,分別溶解至10 mol/L 和0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)中,配制成0.1 mmol/L的Res儲(chǔ)備液和2 mmol/L的Cla儲(chǔ)備液。

桑葉酚類/蛋白復(fù)合溶液:取4 mL MLP溶液于10 mL容量瓶中,分別加入不同體積的酚類化合物溶液,使終濃度分別為0、4、8、12、16、20 μmol/L,混勻,于37 ℃振蕩12 h。

1.3.2 紫外-可見光光譜分析

采用紫外-可見分光光度法測(cè)定MLP、酚類/蛋白復(fù)合溶液的紫外-可見吸收光譜。將樣品置于光程為1 cm 的比色皿中進(jìn)行掃描,掃描范圍為190～500 nm。

1.3.3 熒光光譜分析

利用F-7000熒光分光光度計(jì)測(cè)定不同溫度下(300、305、310 K)MLP和酚類/蛋白復(fù)合溶液的熒光光譜,以不含酚類物質(zhì)的MLP做空白對(duì)照。激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm,發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍300～400 nm。

采用Stern-Volmer方程對(duì)不同溫度下的熒光猝滅數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,分別探討Res、Cla對(duì)MLP的熒光猝滅機(jī)制。熒光猝滅的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:F為加入酚類物質(zhì)時(shí)MLP的熒光強(qiáng)度;F0為未加酚類物質(zhì)時(shí)MLP的熒光強(qiáng)度;Kq為速率常數(shù),動(dòng)態(tài)猝滅時(shí),各種猝滅劑對(duì)生物分子的最大碰撞猝滅常數(shù)Kq為2.0×1010L/(mol·s);τ0為無(wú)淬滅劑(Res、Cla)時(shí)生物大分子的平均熒光壽命,約為10-8s;Q為酚類物質(zhì)濃度;Ksv為Stern-Volmer淬滅速率常數(shù)。

對(duì)于靜態(tài)猝滅,利用雙對(duì)數(shù)方程分析結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。靜態(tài)猝滅的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:Ka為結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

利用Van’t Hoff方差對(duì)熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行擬合,進(jìn)一步判斷酚類物質(zhì)與桑葉蛋白間的相互作用力的類型。熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算如公式(3)、公式(4)所示:

(3)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKa

(4)

式中:ΔH表示焓變,kJ/mol;ΔG表示吉布斯自由能變化,kJ/mol;ΔS表示熵變,J/K;T為絕對(duì)溫度;Ka為結(jié)合常數(shù);R為氣體常數(shù),8.314 J/(mol·K)。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

將MLP溶液和桑葉酚類/蛋白復(fù)合溶液在-60 ℃中預(yù)冷凍6 h后進(jìn)行冷凍干燥,得到固形復(fù)合物。按樣品與溴化鉀粉末質(zhì)量比1∶40混合,壓片,分別在4 000～400 cm-1波數(shù)內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描,分辨率為2 cm-1,掃描32次。

1.3.5 差示掃描量熱(differential scanning calorimetry, DSC)分析

取4 mg樣品于坩堝中密封,以密封的空坩堝作為空白對(duì)照,測(cè)試溫度為25～150 ℃,升溫速率為10 ℃/min,氮?dú)饬魉贋?0 mL/min。

1.3.6 桑葉酚類/蛋白復(fù)合物體外消化吸收特性

參考肖雅麗[14]報(bào)道的方法進(jìn)行模擬體外消化實(shí)驗(yàn)。稱取一定量MLP及酚類/蛋白復(fù)合物,配制為質(zhì)量濃度10.0 mg/mL的溶液,用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH至1.5,溶液37 ℃水浴加熱5 min后,將胃蛋白酶與樣品溶液以1∶50的質(zhì)量比混合,在37 ℃下消化2 h,分別在0、10、20、30、60、120 min時(shí)取消化樣品,并將樣品加熱10 min滅活。取胃蛋白酶酶解120 min 的樣品,用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,將胰蛋白酶與樣品以1∶50的質(zhì)量比混合,在37 ℃下消化2 h,分別在0、10、20、30、60、120 min時(shí)取樣,并將樣品加熱10 min滅酶。

茚三酮法測(cè)定水解度(degree of hydrolysis, DH):稱取一定量酪氨酸溶于水中,分別配制成梯度濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的溶液,并分別加入1.0 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)和1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的茚三酮溶液,沸水中反應(yīng)20 min ,冷卻至室溫,570 nm處測(cè)定其吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。MLP的氨基含量測(cè)試同上,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MLP中氨基含量。取4.0 mL模擬消化樣品,加入1.0 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸溶液,于3 000 r/min 下離心10 min,以除去大分子物質(zhì)與雜質(zhì);取4.0 mL上清液,分別加入1.0 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)和1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的茚三酮溶液,于沸水中反應(yīng)20 min,冷卻至室溫,570 nm處測(cè)定其吸光度,水解度的計(jì)算如公式(5)所示:

(5)

1.3.7 抗氧化能力分析

采用DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力實(shí)驗(yàn)測(cè)定樣品的抗氧化能力。稱取3.94 mg DPPH溶于50 mL容量瓶?jī)?nèi),加無(wú)水乙醇定容,避光充分溶解,配制成0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液,4 ℃貯藏備用。分別取5 mL MLP溶液、20 μmol/L酚類溶液和含20 μmol/L酚類/蛋白復(fù)合物溶液與5 mL DPPH 乙醇溶液混合,避光反應(yīng)0.5 h,利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其在517 nm處的吸光值,DPPH自由基清除率的計(jì)算如公式(6)所示:

(6)

式中:A1為樣品吸光度;A0為空白對(duì)照組的吸光度。

稱取一定量ABTS溶于10 mL容量瓶?jī)?nèi),配制成7.0 mmol/L的ABTS溶液。稱取一定量的過硫酸鉀溶于10 mL容量瓶?jī)?nèi),配制成5.0 mmol/L的過硫酸鉀溶液。將兩者等體積混合后,避光室溫放置12 h。加蒸餾水稀釋,使其在734 nm處吸光度為(0.70±0.02)。將4 mL ABTS溶液與0.5 mL樣品混合,避光反應(yīng)6 min,在734 nm處測(cè)其吸光度,以相應(yīng)蒸餾水為對(duì)照。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的計(jì)算如公式(7)所示:

(7)

式中:Ai為樣品與ABTS反應(yīng)后的吸光度;A0為蒸餾水代替樣品與ABTS反應(yīng)后的吸光度;Aj為蒸餾水代替ABTS與樣品反應(yīng)后的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉中兩種酚類化合物與蛋白相互作用的紫外-可見光光譜分析

紫外-可見光光譜法通過測(cè)定從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的電子躍遷效應(yīng)來(lái)研究酚類與蛋白分子間的相互作用[15]。桑葉中不同濃度的Res、Cla分別與蛋白作用的紫外-可見光光譜分析結(jié)果見圖1。

a-Res;b-Cla圖1 不同濃度的Res、Cla對(duì)MLP溶液紫外-可見光光譜吸收的影響Fig.1 Effect of different concentrations of Res and Cla on the UV-Vis absorption spectrum of MLP

由圖1可知,MLP在205、255 nm處具有明顯的吸收峰。分別加入Res與Cla反應(yīng)后,酚類/蛋白產(chǎn)物在205、255 nm處的吸收峰增大,且隨著酚類濃度的增加,峰值呈上升趨勢(shì),同時(shí)吸收峰發(fā)生紅移,最大吸收峰均紅移約1 nm。吸收峰強(qiáng)度和位移的變化表明Res與Cla與MLP發(fā)生了相互作用而形成了新的復(fù)合物。這可能是由于Res及Cla與MLP中的疏水基團(tuán)結(jié)合形成絡(luò)合物,改變了MLP的空間構(gòu)造,掩蓋了MLP色氨酸和酪氨酸的芳香環(huán)疏水基團(tuán),降低了復(fù)合物的疏水性能[16]。Cla與MLP作用后在320 nm處出現(xiàn)吸收峰,并隨著Cla濃度的增加而吸收峰的強(qiáng)度增強(qiáng),表明MLP與Cla之間存在相互作用[17]。

2.2 桑葉中兩種酚類化合物與蛋白相互作用的熒光光譜分析

MLP的氨基酸組成中存在酪氨酸和苯丙氨酸,因含有苯環(huán)結(jié)構(gòu),在一定的激發(fā)波長(zhǎng)下能夠產(chǎn)生熒光[18]。在不同溫度下,不同濃度的Res與Cla分別與MLP相互作用的熒光光譜見圖2。

a-Res,300 K;b-Cla,300 K;c-Res,305 K;d-Cla,305 K;e-Res,310 K;f-Cla,310 K圖2 Res、Cla分別與MLP在不同溫度下相互作用的熒光光譜分析Fig.2 Fluorescence spectra of interaction between Res and Cla and MLP at different temperatures

由圖2可知,酚類/蛋白體系溶液的最大發(fā)射波長(zhǎng)約為340 nm,在300、305、310 K 3種作用溫度下,Res和Cla的加入均可降低MLP的熒光強(qiáng)度,且隨著Res和Cla濃度的增加,MLP發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),發(fā)射峰出現(xiàn)不同程度的藍(lán)移或紅移。此外,隨著溫度的升高,酚類對(duì)MLP熒光猝滅效果呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。例如,在Res和Cla濃度為20 μmol/L時(shí),溶液的熒光猝滅強(qiáng)度與MLP相比,在3種溫度下分別下降了293.119 6、300.772 9、113.014 3 a.u.和354.085 4、112.983 9、105.225 0 a.u.。這可能是由于MLP中酪氨酸和苯丙氨酸殘基與Res和Cla的芳香環(huán)發(fā)生相互作用[19],導(dǎo)致氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生變化,使蛋白內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅,并形成弱熒光的酚類/蛋白復(fù)合物。

利用Stern-Volmer方程分別分析了Res、Cla與MLP相互作用的猝滅機(jī)理、結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合常數(shù),結(jié)果見表1和表2。

表1 酚類與MLP相互作用的熒光猝滅常數(shù)與線性相關(guān)系數(shù)Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of phenolics and MLP

表2 酚類與MLP相互作用的結(jié)合位點(diǎn)、表觀結(jié)合常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Apparent binding constants, binding sites numbers and correlation coefficients of phenolics and MLP

由表1可知,在酚類化合物作用濃度范圍內(nèi)的曲線擬合具有較好的線性關(guān)系。在300、305、310 K的處理溫度下,Res和Cla的淬滅速率常數(shù)Ksv均隨著溫度的升高而逐漸減小。Res、Cla與MLP在上述3種溫度下的Kq分別為3.165×1012、2.922×1012、0.949×1012L/(mol·s)和3.728×1012、1.828×1012、0.805×1012L/(mol·s),均大于動(dòng)態(tài)猝滅的最大碰撞速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s),與動(dòng)態(tài)猝滅的特性相反[20]。因此可以推斷,Res、Cla對(duì)MLP的熒光猝滅可能均是由酚類化合物和蛋白相互作用引起的靜態(tài)猝滅,而不是由分子擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅[21],即熒光團(tuán)與猝滅劑形成了非熒光的復(fù)合物[22]。

由表2可知,酚類與MLP的結(jié)合常數(shù)均在104L/mol 左右,表明二者之間能形成穩(wěn)定的復(fù)合物[23]。隨著溫度的升高,2種酚類化合物與MLP結(jié)合常數(shù)均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),表明Res、Cla與蛋白質(zhì)均是通過氫鍵結(jié)合的放熱反應(yīng)[24]。在相同的溫度下,Res與MLP的結(jié)合常數(shù)Ka值大于Cla與MLP的結(jié)合常數(shù),說(shuō)明Res與MLP的結(jié)合能力更強(qiáng)。在300 K的溫度下,2種酚類與MLP的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n值為1左右,表明MLP上存在單個(gè)結(jié)合位點(diǎn),并且酚類與蛋白約以1∶1的摩爾比結(jié)合。從300 K升至310 K,2種酚類與MLP的結(jié)合位點(diǎn)下降,表明溫度對(duì)酚類與MLP結(jié)合形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性有影響,復(fù)合物隨著溫度的升高而變得不穩(wěn)定[25],可能是升溫破壞了酚類與MLP之間的非共價(jià)相互作用。

進(jìn)一步對(duì)酚類化合物與MLP之間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力進(jìn)行分析,ΔH、ΔS、ΔG的擬合結(jié)果見表3。

表3 酚類與MLP相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic constants of interaction between phenolics and MLP

非共價(jià)相互作用的作用力有氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、靜電相互作用力等。研究表明,當(dāng)ΔH>0且ΔS>0時(shí)主要作用力為疏水作用力;當(dāng)ΔH<0且ΔS>0時(shí)主要作用力為靜電力;當(dāng)ΔH<0且ΔS<0時(shí)主要作用力為氫鍵和范德華力[26]。由表3可知,不同溫度下Res、Cla與MLP反應(yīng)的ΔG均小于0,表明兩者之間的反應(yīng)均是自發(fā)進(jìn)行的,Res、Cla與MLP的結(jié)合過程均為放熱反應(yīng),升高溫度不利于兩者之間的結(jié)合。Res、Cla與MLP相互作用的ΔH和ΔS均小于0,表明氫鍵和范德華力在兩者結(jié)合中起主要作用。

2.3 桑葉中2種酚類化合物與蛋白的傅里葉變換紅外光譜分析

a-Res與MLP相互作用;b-Cla與MLP相互作用圖3 Res、Cla與MLP作用的紅外光譜分析Fig.3 FT-IR spectrum analysis of the interaction between Res, Cla and MLP

2.4 DSC分析

通過差示掃描量熱法可以分析酚類與MLP結(jié)合后對(duì)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 酚類與MLP形成的復(fù)合物的熱穩(wěn)定性分析Fig.4 Thermal stability analysis of phenolics and MLP complexes

由圖4可知,MLP在50.14 ℃時(shí)出現(xiàn)吸熱峰,對(duì)應(yīng)其熱變性溫度,其變性焓為3.40 J/g。當(dāng)Res、Cla與MLP相互作用后形成的復(fù)合物的熱變性溫度均大于MLP的熱變性溫度,表明Res、Cla的加入會(huì)提高M(jìn)LP的熱穩(wěn)定性。其中Res與MLP作用后形成的復(fù)合物的熱變性溫度提高了4.32 ℃,變性焓提高了10.91 J/g,而Cla與MLP結(jié)合后熱變性溫度提高了2.81 ℃,變性焓提高了9.97 J/g。這可能是Res、Cla與MLP發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用致使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而提高了蛋白質(zhì)的熱變性溫度[28]。

2.5 體外消化吸收特性分析

MLP及酚類/MLP復(fù)合物的體外消化過程中水解度變化結(jié)果見圖5。MLP及復(fù)合物在胃、腸2個(gè)消化階段總體呈上升趨勢(shì)。在胃消化階段,MLP及酚類/MLP復(fù)合物在消化開始時(shí)迅速水解,10 min后水解速度減緩,并隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng),水解度趨于平緩。水解度的大小依次為:MLP>MLP-Cla>MLP-Res。在胃消化階段,MLP水解度最高為25.43%。在腸消化階段,MLP及酚類/MLP復(fù)合物的水解度均明顯增加,在腸消化階段的水解度變化顯著高于胃消化階段,表明蛋白質(zhì)的消化主要發(fā)生在小腸消化階段。總體來(lái)看,水解度大小依次為:MLP>MLP-Cla>MLP-Res。MLP的水解度在胃、腸2個(gè)消化階段都是最高的,水解度可達(dá)55.06%,而MLP-Res的消化率最低,水解度僅為44.38%。MLP與酚類相互作用形成復(fù)合物后水解度降低,推測(cè)可能由于MLP受酚類化合物的影響,空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[29],復(fù)合物的形成抑制了消化酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解。Res、Cla和MLP之間的相互作用會(huì)影響蛋白質(zhì)的消化特性。

圖5 桑葉酚類/蛋白復(fù)合物在體外模擬胃腸道消化階段DH的變化Fig.5 Changes of DH of mulberry leaf polyphenol/protein complexes during simulated gastrointestinal digestion in vitro注:A～C代表同一時(shí)間下,MLP、MLP-Cla、MLP-Res消化率的差異顯著(P<0.05);d～j代表在胃消化階段,不同時(shí)間同一樣品消化率的差異顯著(P<0.05);h、i代表在腸消化階段,不同時(shí)間同一樣品消化率的差異顯著(P<0.05)

2.6 抗氧化能力分析

采用DPPH和ABTS方法比較了MLP、Res、Cla及其復(fù)合物的抗氧化能力,結(jié)果見圖6。

a-DPPH自由基;b-ABTS陽(yáng)離子自由基圖6 桑葉酚類/蛋白復(fù)合物對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力Fig.6 DPPHand ABTS, scavenging capacity of mulberry leaf polyphenol/protein complexes注:不同字母代表不同樣品差異顯著(P<0.05)

由圖6可知,MLP本身對(duì)于DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力較弱,而Res和Cla對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力較強(qiáng)。當(dāng)酚類與蛋白形成復(fù)合物后表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力,其對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力明顯強(qiáng)于MLP(P<0.05),但較酚類化合物本身均明顯降低(P<0.05)。這些結(jié)果表明酚類與桑葉蛋白形成復(fù)合物后使酚類化合物對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力受到一定的抑制,導(dǎo)致抗氧化能力降低。這可能是由于部分酚羥基與蛋白發(fā)生相互作用,可以向自由基提供氫和電子的位置被掩蓋,降低了其與自由基碰撞的幾率,導(dǎo)致酚類/桑葉蛋白復(fù)合物的抗氧化能力低于游離酚類化合物[30]。

3 結(jié)論

通過對(duì)桑葉中內(nèi)源酚類物質(zhì)Res、Cla分別與蛋白之間的相互作用及功能性質(zhì)進(jìn)行研究,表明2種桑葉內(nèi)源酚類化合物與蛋白均表現(xiàn)出較強(qiáng)的相互作用力,且可以形成較穩(wěn)定的復(fù)合物。Res、Cla對(duì)蛋白的熒光猝滅類型均是靜態(tài)猝滅,氫鍵和范德華力是主要作用力;Res、Cla與MLP之間相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,提高了MLP的熱穩(wěn)定性,抑制了消化酶對(duì)MLP的水解,提高了MLP本身對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力。研究結(jié)果將為桑葉作為食物基質(zhì)中可能存在的酚類與蛋白之間的相互作用及對(duì)其功能特性的影響提供依據(jù)。