周北雅,郭艷東,薛雅鞠,袁江月,紀(jì)秀玲,李 壯,黃玉紅,3

(1.渤海大學(xué) 數(shù)學(xué)科學(xué)學(xué)院,遼寧 錦州 121000;2.中國科學(xué)院 過程工程研究所,北京 100190;3.中國科學(xué)院 綠色過程制造創(chuàng)新研究院,北京 100190)

蛋白酶不僅能夠在較寬的pH和溫度范圍內(nèi)將蛋白質(zhì)肽鏈水解成可溶的短肽和游離氨基酸,而且在各種表面活性劑、氧化劑、漂白劑、增白劑和有機溶劑等體系中具有穩(wěn)定性[1],所以對洗滌、皮革、紡織、飼料、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的發(fā)展有著重要的意義[2-3]。

蛋白酶來源豐富,廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi),其中,微生物由于其生長周期短、生產(chǎn)成本低,可以連續(xù)供應(yīng)所需的產(chǎn)品,已成為蛋白酶商業(yè)生產(chǎn)的首選[4]。微生物蛋白酶幾乎占據(jù)著全球商業(yè)蛋白酶市場的三分之二[5]。在工業(yè)酶中,蛋白酶是占比最大的工業(yè)生物催化劑,根據(jù)MarketsandMarkets的數(shù)據(jù),2020年世界工業(yè)酶市場價值為59億美元,預(yù)計2026年將達(dá)到87億美元,年復(fù)合增長率為6.5%[6]。預(yù)計到2027年,全球蛋白酶市場的規(guī)模將達(dá)到27億美元,我國的市場規(guī)模預(yù)計將達(dá)到5.505億美元,年復(fù)合增長率為7.6%;其他國家,如日本和加拿大,預(yù)計在2020年至2027年期間,年復(fù)合增長率分別為2.7%和4.4%,而德國將以約3%的復(fù)合年增長率增長[7]。隨著酶在食品和飲料行業(yè)應(yīng)用的發(fā)展,預(yù)計到2026年,食品領(lǐng)域?qū)⒄碱I(lǐng)酶應(yīng)用市場的最大份額[8]。因此,本文主要對蛋白酶的來源、功能、催化機制、酶工程改造、基因工程菌株構(gòu)建和應(yīng)用進行綜述,以期為相關(guān)的科研工作和生產(chǎn)企業(yè)提供參考。

1 功能蛋白酶的微生物來源及分類

目前,產(chǎn)蛋白酶的微生物包括細(xì)菌、真菌以及放線菌[9],它們可利用不同的底物生產(chǎn)不同功能的蛋白酶。微生物菌株所生產(chǎn)蛋白酶的種類主要取決于生產(chǎn)環(huán)境,如,在屠宰場、肉類和家禽加工廠附近的土壤環(huán)境中的細(xì)菌具有生長周期短、對生長環(huán)境要求低、代謝過程特殊以及所產(chǎn)蛋白酶活性高等優(yōu)點[10-11],因此,從這些環(huán)境中篩選的微生物被廣泛應(yīng)用在工業(yè)酶生產(chǎn)中。

一般來講,細(xì)菌生產(chǎn)蛋白酶的最適pH為6.0～9.0、最適溫度為30～50 ℃[12]。芽孢桿菌屬因其較強的蛋白酶分泌能力,目前已成為蛋白酶最重要的細(xì)菌來源[13]。真菌是最早被發(fā)現(xiàn)可以生產(chǎn)蛋白酶的微生物,特別是一些非致病性真菌生產(chǎn)的蛋白酶應(yīng)用十分廣泛,如黑曲霉(A.niger)[14]、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)[15]、金孢屬(Chrysosporium)[16]、石膏小孢子菌(Microsporumgypseum)以及鐮刀菌(Fusariumsolani)[17]等。雖然有些真菌可以高效分泌蛋白酶,但是它們會破壞人體以及動物的皮膚外層角蛋白,引發(fā)疾病,因此限制了這些致病菌株的商業(yè)應(yīng)用。可以產(chǎn)生蛋白酶的放線菌菌株,主要包括鏈霉菌屬(Streptomycessp.)[18]和熱放線菌屬CDF(Thermoactinomycessp.CDF)[19]。Jaouadi等[20]發(fā)現(xiàn),鏈霉菌屬AB1(Streptomycessp. AB1)產(chǎn)生的蛋白酶可完全降解羽毛,并且對洗滌劑和有機溶劑都表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性和較高的耐受性[20]。

經(jīng)過幾十年的發(fā)展,我國蛋白酶的生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟,并初具規(guī)模。目前國內(nèi)大部分商業(yè)蛋白酶主要是高溫耐堿性。另外,由于蛋白酶獨特的催化活性,目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、紡織、皮革等傳統(tǒng)行業(yè),發(fā)展前景十分廣闊。但是,我國蛋白酶行業(yè)相對于國外起步較晚,與國際水平相比還有較大差距,仍需要進一步研究與探索。表1總結(jié)了目前商業(yè)蛋白酶的種類、來源、反應(yīng)條件和應(yīng)用范圍等。

表1 商業(yè)蛋白酶

2 蛋白酶的分類

由于蛋白酶來源廣泛,所以理化性質(zhì)也不盡相同,根據(jù)功能及催化特性、pH特性或催化作用位點的不同,蛋白酶可以被分成不同的類型[21]。

2.1 根據(jù)蛋白酶的功能及催化特性分類

根據(jù)蛋白酶的功能及催化特性,可將其分為9個家族,分別是天冬氨酸蛋白酶(A)、半胱氨酸蛋白酶(C)、谷氨酸蛋白酶(G)、金屬蛋白酶(M)、天冬酰胺酸蛋白酶(N)、混合蛋白酶(P)、絲氨酸蛋白酶(S)、蘇氨酸蛋白酶(T)和未知功能的蛋白酶(U)[42]。

2.1.1 天冬氨酸蛋白酶

天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23.-),是一類酸性蛋白酶,在酸性(pH 3.0～4.0)條件下仍有活性,廣泛分布于真菌、植物和脊椎動物以及艾滋病病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄病毒中[43],主要參與機體的新陳代謝以及生物調(diào)控。它的酶活性中心由2個催化性天冬氨酸殘基Asp32和Asp215組成。該蛋白酶分為3個家族,即胃蛋白酶、胃蛋白酶反轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白[44]。天冬氨酸蛋白酶的分子量通常為(3.5～5.0)×104,由320～340個氨基酸殘基組成。目前從酵母菌和真菌中提取的天冬氨酸蛋白酶已被純化和克隆并用于實驗研究和工業(yè)生產(chǎn)中,包括米曲霉(A.oryzae)、煙曲霉(A.fumigatus)和黑曲霉(A.niger)等[45]。

2.1.2 半胱氨酸蛋白酶

半胱氨酸蛋白酶(EC 3.4.22.-),其催化作用依賴于活性位點的半胱氨酸殘基,酶活性中心一般由His、Cys和Asp組成,分子量為(2.0～3.5)×104、最適pH為4.5～7.0、最適溫度為50～70 ℃[46],其中木瓜蛋白酶是最常見的半胱氨酸蛋白酶[47]。由于巰基極易被氧化,半胱氨酸蛋白酶只有在還原劑存在的情況下才具有活性,所以許多半胱氨酸蛋白酶在其反應(yīng)介質(zhì)中需要添加還原劑。迄今為止,已經(jīng)鑒定了11種人類半胱氨酸組織蛋白酶,包括B、C、F、H、L、O和X,它們普遍存在于人體所有結(jié)構(gòu)中,另一些則僅限于特定的細(xì)胞或組織中進行特異反應(yīng),如蛋白酶K、S、V和W[48]。半胱氨酸蛋白酶在生物體的生理代謝和發(fā)育的各個方面都發(fā)揮著重要的作用：在植物體內(nèi),它參與植物細(xì)胞調(diào)控的多個過程,如,細(xì)胞的死亡、調(diào)控貯藏蛋白積累、器官衰竭、管狀細(xì)胞分化和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等[48];在動物和人類體內(nèi),它們負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞衰老和凋亡、激素前處理等[49]。

2.1.3 金屬蛋白酶

金屬蛋白酶(EC 3.4.24.-),特指活性中心含有金屬離子的蛋白酶,最適pH為5.0～9.0。目前已經(jīng)確定的金屬蛋白酶家族大約30個,其中17個家族只含有內(nèi)肽酶、12個家族只含有外肽酶、1個家族同時含有內(nèi)肽酶和外肽酶。它的酶活性中心由His-Glu-Xaa-Xaa-His組成。金屬蛋白酶的代表是嗜熱菌蛋白酶,其中組氨酸殘基為鋅提供配體,谷氨酸殘基則直接參與催化功能[50]。金屬蛋白酶可以被乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇四乙酸(EGTA)等螯合劑抑制[46],但對半胱氨酸抑制劑或巰基不敏感。

2.1.4 絲氨酸蛋白酶

絲氨酸蛋白酶(EC 3.4.21.-),是最有特色的一類蛋白酶,已鑒定出700多種絲氨酸蛋白酶,是自然界中最豐富的酶之一。絲氨酸蛋白酶的活性中心都含有必需氨基酸殘基Ser-His-Asp催化三聯(lián)體,它們分布在活性位點的兩側(cè),一側(cè)是Ser195,另一側(cè)是Asp102和His57[51],幾乎三分之一的蛋白酶都可以歸類為絲氨酸蛋白酶[52]。在MEROPS database中,根據(jù)催化機制可將絲氨酸蛋白酶分為13個家族[53]。最典型的3種絲氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。絲氨酸蛋白酶參與血液凝固、食物消化、防御機制、免疫反應(yīng)和組織重組等生理過程。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,它主要用于治療止血和血栓形成、皮膚病、炎癥治療及病毒感染等方面,而工業(yè),它主要應(yīng)用于洗滌劑和食品等行業(yè)[54]。絲氨酸蛋白酶在生物體的代謝過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。隨著合成生物學(xué)、宏基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展與進步,絲氨酸蛋白酶在未來會得到更多的關(guān)注,會有更廣泛的應(yīng)用。

2.1.5 蘇氨酸蛋白酶

蘇氨酸蛋白酶(EC 3.4.25.-),是一種新型蛋白酶,在活性中心的蘇氨酸殘基對其催化機制有重要作用,與絲氨酸蛋白酶具有相似的催化特性,產(chǎn)自細(xì)菌、古細(xì)菌或真核生物。N端蘇氨酸的羥基充當(dāng)?shù)鞍姿庥H核基團[55]。蘇氨酸蛋白酶基因在基因組中出現(xiàn)的頻率比絲氨酸蛋白酶基因低1.1%;因為20S蛋白酶體和26S蛋白酶體被認(rèn)為是蘇氨酸蛋白酶前體,20S和26S蛋白酶體在古細(xì)菌和真核生物中都可以快速降解蛋白質(zhì),能夠在多個位點切割多肽生成短肽,其中95%的短肽長度小于20個氨基酸殘基[56]。

2.1.6 谷氨酸蛋白酶

谷氨酸蛋白酶(EC 3.4.23.19)是一種酸性蛋白酶,此類酶所有活性中心都含有一個谷氨酸殘基,與枯草桿菌蛋白酶結(jié)構(gòu)具有相似性[57]。當(dāng)以酪蛋白為底物時,其最適pH為2.0。谷氨酸蛋白酶是由2個反向平行的β-折疊組成的三維結(jié)構(gòu),包含2個獨特的催化二聯(lián)體Gln53和Glu136殘基。目前,已經(jīng)從很多菌株中分離出谷氨酸蛋白酶,如,踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)、擔(dān)子菌(Phanerochaetechrysosporium)和核盤菌(Sclerotinasclerotiorum)等[58]。

2.2 根據(jù)蛋白酶催化的pH范圍分類

根據(jù)蛋白酶表現(xiàn)出較高活性的pH范圍,可將蛋白酶分為3類：酸性蛋白酶(pH 2.0～6.0)、中性蛋白酶(pH 6.0～8.0)和堿性蛋白酶(pH 8.0～13.0)[59]。酸性蛋白酶在酶活性中心含有一個或多個羧基,其中最具代表性的是胃蛋白酶。中性蛋白酶屬于內(nèi)切酶的一種,可將大分子蛋白水解為氨基酸,且反應(yīng)條件溫和,是目前用于蛋白質(zhì)水解處理的一類重要的蛋白酶。堿性蛋白酶,當(dāng)它具有絲氨酸活性中心(在其催化中心含有Asp-His-Ser三聯(lián)體),稱為絲氨酸蛋白酶;當(dāng)它具有催化所需的金屬離子時,稱為金屬蛋白酶,是目前應(yīng)用最廣泛的一類蛋白酶[60],該蛋白酶的性能受多種因素影響,如pH、離子強度和溫度等[61]。

2.3 根據(jù)蛋白酶的作用位點分類

根據(jù)蛋白酶作用位點的位置,可將蛋白酶分為內(nèi)肽酶和外肽酶,在分子內(nèi)部作用非末端氨基酸殘基的肽鍵,稱為內(nèi)肽酶(EC 3.4.21.-～3.4.24.-、3.4.99.-)。外肽酶(EC 3.4.11.-～3.4.19.-)則是在C端或N端切割氨基酸間的肽鍵,外肽酶根據(jù)肽段的大小、起始肽段的末端以及肽鏈的長度等特性又被分為氨肽酶或羧肽酶[5]。

2.3.1 外肽酶

氨肽酶水解多肽鏈中N端的氨基酸,釋放出單個氨基酸、二肽或三肽。氨肽酶主要存在于細(xì)胞中,存在于不同的亞細(xì)胞室,在肽激素的分解和各種酶的加工中發(fā)揮重要作用[62]。氨肽酶的最適pH為6.0～9.0,位于不同的亞細(xì)胞室,包括細(xì)胞質(zhì)、溶酶體和細(xì)胞膜,也可以分泌到細(xì)胞外介質(zhì)中。氨肽酶是一種具有很高應(yīng)用價值的生物催化劑,通過定點誘變和重組DNA技術(shù),可提高氨肽酶的特異性和穩(wěn)定性,高活性氨肽酶在各個工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[63]。

羧肽酶主要水解肽鏈C端的氨基酸,釋放單一氨基酸或二肽。根據(jù)活性中心殘留氨基酸的特征,羧肽酶主要包括3類：絲氨酸羧肽酶、半胱氨酸羧肽酶和金屬羧肽酶。羧肽酶的主要來源包括動物、植物和微生物,其中動物來源主要是豬或牛的胰腺,植物來源是小麥、水稻和番茄等,微生物來源主要是酵母、曲霉菌等[64]。

2.3.2 內(nèi)肽酶

內(nèi)肽酶,也就是通常所說的蛋白酶,主要作用于蛋白質(zhì)多肽鏈內(nèi)部的肽鍵,使蛋白質(zhì)長鏈分解成短肽片段。內(nèi)肽酶根據(jù)主要負(fù)責(zé)催化活性基團的反應(yīng)類型進一步分類,主要包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和蘇氨酸蛋白酶[65]。

3 功能蛋白酶的催化機制

功能蛋白酶分子作用機制不僅對蛋白酶理性和半理性設(shè)計改造至關(guān)重要,同樣對蛋白酶應(yīng)用領(lǐng)域的拓展具有重要意義。目前,蛋白酶的分子作用機制的研究成果并不多,因此本文總結(jié)部分蛋白酶的催化機制。

3.1 天冬氨酸蛋白酶催化機制

天冬氨酸蛋白酶主要由β鏈二級結(jié)構(gòu)組成,β鏈位于活性位點的底部,包含一對天冬氨酸殘基,在2個天冬氨酸羧基之間有一個氫鍵水分子,參與催化反應(yīng)[66],大部分的天冬氨酸蛋白酶至少有一個β發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)域(圖1(a))[45,67]。圖1(b)則解釋了天冬氨酸蛋白酶的作用機制。

1)水分子通過氫鍵與兩個天冬氨酸殘基結(jié)合,并作為親核試劑攻擊肽鍵的羰基碳。天冬氨酸殘基Asp218作為堿,奪取水分子的質(zhì)子H+,隨后H2O上的O作為親核試劑攻擊底物肽鍵上的羰基;同時天冬氨酸殘基Asp32向肽鍵的羰基氧提供質(zhì)子H+,形成四面體中間體。

2)天冬氨酸殘基Asp218上的質(zhì)子H+轉(zhuǎn)移至底物肽鍵的N原子上,使得底物的“剪刀狀”構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)變;同時天冬氨酸殘基Asp32上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移至底物肽鍵的羰基氧上,導(dǎo)致底物肽鍵中的C—N鍵斷裂,生成2種產(chǎn)物,并生成帶負(fù)電的天冬氨酸殘基Asp218用于后續(xù)的催化過程[45]。

3.2 半胱氨酸蛋白酶催化機制

半胱氨酸蛋白酶的催化機制基本上有2個主要步驟,?；兔擋；?圖2)[68]：①His159上N原子上的孤對電子與Cys25上S—H形成離子鍵,奪取質(zhì)子H+,形成質(zhì)子化的His159;②失去質(zhì)子H+的Cys25,親核進攻底物肽鍵上的羰基碳,形成一個四面體的中間體;③質(zhì)子化的His159的質(zhì)子轉(zhuǎn)移到四面體中間體的N原子上,并斷裂C—N鍵,形成伯胺和另一種?；虚g產(chǎn)物,在這個過程中,這兩步可以分步進行,也可以同時進行;④His159上的N原子奪取分子上的質(zhì)子并形成OH-,OH-親核進攻?；虚g產(chǎn)物上的羰基碳脫酰化,最終生成兩種脫?；a(chǎn)品。

圖2 半胱氨酸蛋白酶的催化機制[68]Fig.2 Catalytic mechanism of cysteine protease[68]

3.3 絲氨酸蛋白酶的催化機制

絲氨酸蛋白酶的催化機制[69]如圖3所示。①絲氨酸蛋白酶上的Ser殘基上的—OH官能團被“堿”奪取質(zhì)子,作為親核試劑進攻底物肽鍵上的羰基碳,形成帶有負(fù)氧離子的四面體中間體;②被“堿”奪取的質(zhì)子轉(zhuǎn)移至肽鍵的N原子上,且C—N鍵斷裂,形成氨基產(chǎn)物和?；虚g產(chǎn)物;③酰化的中間產(chǎn)物作為“堿”進一步奪取H2O的質(zhì)子H+,去質(zhì)子化的H2O親核進攻?；虚g產(chǎn)物的羰基碳,形成帶有氧負(fù)離子的脫酰化中間產(chǎn)物;④氧負(fù)離子通過電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致Ser殘基上的O原子與底物C原子之間的C—O鍵斷裂,形成羧基產(chǎn)物以及絲氨酸蛋白酶的再生。

圖3 絲氨酸蛋白酶催化機制[69]Fig.3 Catalytic mechanism of the serine protease[69]

3.4 蛋白酶去除蛋白污漬的作用機制

蛋白酶加入洗滌劑可去除血跡污漬,在洗滌過程中,紅細(xì)胞在水和洗滌劑的混合物中溶解,紅細(xì)胞中的血紅蛋白和其他蛋白質(zhì)被釋放出來,洗滌劑中加入的蛋白酶,將血紅蛋白中的珠蛋白和其他大蛋白水解成多肽,多肽在水中的溶解性能較好,進而可去除血跡[70]。相關(guān)的文獻(xiàn)也證實了該觀點,具體機制如圖4所示[5,71]。

圖4 蛋白酶去除蛋白污漬的作用機制[5,71]Fig.4 Mechanism of protease in removing protein stains[5,71]

3.5 蛋白酶降解角質(zhì)的作用機制

角質(zhì)廢棄物(如羽毛、豬毛等)含有大量的蛋白質(zhì)(>90%),但是結(jié)構(gòu)復(fù)雜(含有大量的二硫鍵、氫鍵和范德華力等作用),其二級結(jié)構(gòu)的后翻譯修飾過程(如糖基化和磷酸化等),增加了其生物抗性,很難被降解。Huang等[72]利用基因組、分泌組等手段,對絲狀真菌O.corvina、細(xì)菌Bacillus等進行分析并結(jié)合異源表達(dá)及蛋白的分離純化技術(shù)發(fā)現(xiàn)了7種新的高效降解角質(zhì)蛋白酶系,包括內(nèi)切蛋白酶(S8),外切蛋白酶(M28)和寡肽酶/金屬蛋白酶(M3)、AA11多糖單加氧酶(LPMOs)(圖5(a))、M12、S1、T3,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同功能蛋白酶的協(xié)同作用能夠有效降解角蛋白。

圖5 3種蛋白酶的協(xié)同作用降解角蛋白[72]Fig.5 Keratin degraded by the synergistic action of three proteases endoprotease (S8),exoprotease (M28),oligopeptidase/metalloprotease (M3) and sulfite/disulfide reductase[72]

因為LPMOs(AA11)在絲氨酸和蘇氨酸糖基化過程中破壞N-乙酰氨基葡萄糖部分之間的β-1,4鍵,這會導(dǎo)致角蛋白頭部結(jié)構(gòu)的電荷發(fā)生變化(圖5(b))。這種變化會導(dǎo)致角蛋白結(jié)構(gòu)解聚,有利于3種蛋白酶(S8、M28和M3)作用,并進一步將角蛋白絲降解為可溶性的短肽和氨基酸等[72]。

另外,Huang等[73]闡明了芽孢桿菌Bacillussp.8A6降解角蛋白的機制：代謝產(chǎn)物亞硫酸鹽和金屬蛋白酶M12破壞角蛋白分子結(jié)構(gòu),便于絲氨酸蛋白酶S8A進一步水解,得到的長肽再被絲氨酸蛋白酶S1A降解,最后寡肽和二肽會通過ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi),這個過程中,分泌型家族T3γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶為細(xì)胞提供半胱氨酸。

3.6 蛋白酶用于植物功能肽制備的作用機制

大豆中含有的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白中存在二硫鍵,降解困難,但是蛋白質(zhì)二硫鍵還原酶可分解蛋白質(zhì)中存在的胱氨酸二硫鍵,蛋白水解酶將變性蛋白質(zhì)水解成肽和氨基酸[74],從而降解大豆,促進大豆中粗蛋白和氨基酸的消化。來源于牛奶、大豆和谷物的蛋白質(zhì)水解物的水解基本上是通過內(nèi)肽酶和外肽酶的共同作用,圖6給出了蛋白質(zhì)水解過程中所涉及的酶[62]。

圖6 食物蛋白質(zhì)水解過程中所涉及的酶[62]Fig.6 Enzymes involved in the process of food protein hydrolysis[62]

4 高效功能蛋白酶的篩選及基因工程菌株構(gòu)造

盡管研究微生物蛋白酶已久,但尋找新的蛋白酶基因,構(gòu)建產(chǎn)酶菌株仍然十分重要。從天然環(huán)境中篩選出能高產(chǎn)酶的野生菌株,借助高效表達(dá)菌株對該野生菌株蛋白酶基因進行表達(dá),可有效提高蛋白酶的產(chǎn)量,獲得高性能的蛋白酶。通過酶工程技術(shù),可改善蛋白酶的一個或多個特性,如極端pH和溫度耐受性、底物特異性和穩(wěn)定性等。目前,許多革蘭氏陽性菌已被用于構(gòu)建高效的蛋白表達(dá)系統(tǒng),包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和短芽孢桿菌[75]。

最近Yahaya等[76]總結(jié)了提高角蛋白產(chǎn)量的分子策略,包括質(zhì)粒選擇、啟動子工程、染色體整合、信號肽和前肽工程及密碼子優(yōu)化等,為角蛋白的異源表達(dá),構(gòu)建基因工程菌株提供有益的指導(dǎo)。Peng等[77]基于前肽工程在枯草芽孢桿菌WB600中高效表達(dá)了地衣芽孢桿菌BBE11-1的角蛋白酶基因,再進行組合突變,獲得突變酶活為原始酶(127.6 kU/mg)的186%;另外,從解淀粉芽孢桿菌K11中克隆了中性蛋白酶編碼基因Banpr,在枯草芽孢桿菌菌株WB600中構(gòu)建重組質(zhì)粒pUB110-Banpr并成功表達(dá),在搖瓶中酶活可達(dá)(8 995±250) U/mL;進一步優(yōu)化發(fā)酵條件,在15 L發(fā)酵罐中,酶活達(dá)到28 084 U/mL,遠(yuǎn)高于廣泛使用的工業(yè)菌株枯草芽孢桿菌AS.1398,這可用于規(guī)模化生產(chǎn)和工業(yè)應(yīng)用中[78]。

雖然構(gòu)建基因工程菌株生產(chǎn)功能蛋白酶的技術(shù)已經(jīng)趨于成熟,但是目前我國蛋白酶生產(chǎn)方面仍然存在一些問題：①在蛋白酶生產(chǎn)過程中缺乏高效表達(dá)系統(tǒng),導(dǎo)致蛋白酶的工業(yè)生產(chǎn)表達(dá)量難以達(dá)到國際最高水平。目前功能蛋白酶的高效表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建集中于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母,而蛋白酶在這些底盤細(xì)胞中表達(dá)時仍存在蛋白表達(dá)量低和細(xì)胞生長受限等問題,限制了蛋白酶的高效表達(dá),與工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶仍有差距。②目前缺乏高端的低溫蛋白酶,且生產(chǎn)的蛋白酶的活性、穩(wěn)定性以及抗自切的能力均有待突破。因為構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)高效的功能蛋白酶大多需要在較高溫度下才能高效表達(dá)出活性,且蛋白酶本身存在的自酶切性質(zhì),導(dǎo)致其極為不穩(wěn)定。③在蛋白酶研究過程中,蛋白酶的種類和催化機制差異較大,所以蛋白的酶酶活難以用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)評判。綜上所述,蛋白酶的高效表達(dá)、活性及穩(wěn)定性的提高以及高端低溫蛋白酶的生產(chǎn)將是未來工業(yè)蛋白酶研究的主要方向。表2總結(jié)了近年來高效功能蛋白酶原始生產(chǎn)及基因工程菌株。

表2 功能蛋白酶及基因工程菌株

5 功能蛋白酶的應(yīng)用

蛋白酶是三大工業(yè)酶類之一,利用蛋白酶水解蛋白比傳統(tǒng)的化學(xué)法更加環(huán)保、反應(yīng)條件更溫和。一方面,傳統(tǒng)的熱化學(xué)方法條件苛刻,還會造成不穩(wěn)定氨基酸(如絲氨酸、精氨酸和蘇氨酸等)的降解;另一方面,一些特殊的化學(xué)品可能會造成環(huán)境污染的問題,因此利用蛋白酶的方法更受到人們的青睞[79]。迄今為止,蛋白酶在洗滌、紡織、皮革、飼料與食品、醫(yī)藥行業(yè)及生物能源等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。

5.1 洗滌行業(yè)

用于洗滌劑的蛋白酶必須具備酶活性高、在一定的pH和溫度范圍內(nèi)有足夠的穩(wěn)定性、與其他洗滌劑成分有高度相容性等特性[80]。絲氨酸蛋白酶的分子量為(1.8～9.0)×104,在廣泛的pH范圍內(nèi)具有高活性和高穩(wěn)定性,對底物具有的特異性。在洗滌過程中,與洗滌劑相容的蛋白酶將蛋白質(zhì)污漬中的多肽鏈降解成可溶性肽和氨基酸,這些肽和氨基酸很容易被去除[81]。

Paul等[71]研究發(fā)現(xiàn),來自依利諾斯類芽孢桿菌PaenibacilluswoosongensisTKB2的堿性蛋白酶在pH 9.0時表現(xiàn)出最佳活性,將該酶與洗滌劑結(jié)合后,在不改變質(zhì)地的條件下,短時間內(nèi)不僅可有效去除血漬,還可以去除蛋黃和巧克力的混合污漬,且不破壞纖維強度和結(jié)構(gòu),產(chǎn)生的污水也不會影響生態(tài)系統(tǒng)。Bouacem等[82]從黏金黃桿菌Caldicoprobacterguelmensissp.Nov.D2C22T中分離得到的細(xì)胞外耐熱絲氨酸堿性蛋白酶SAPCG,分子量為5.58×104,可溶于各種商業(yè)洗滌劑,有效去除血漬。Patil等[83]從環(huán)狀芽孢桿菌B.circulansMTCC 7942分離并純化的耐高溫、耐有機溶劑的堿性絲氨酸蛋白酶,最適pH為10.0、最適溫度為60 ℃、分子量為4.3×104,且在有機溶劑中保持活性,可加入洗滌劑用于去除牛奶、汗液和血液等污漬。Ranakrishna等[84]將短小芽孢桿菌B.pumilusGRK產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶用作洗滌劑中的生物添加劑,在不影響纖維及其質(zhì)地的情況下,成功去除了布料上的血漬,是一種無毒、環(huán)保并且可生物降解的添加劑。

蛋白酶還可用作清理下水道和排水口中堵塞的頭發(fā)角蛋白的清潔劑。以角蛋白酶和非硫還原劑組合開發(fā)出一種清潔劑組合物,在安全環(huán)保的條件下,能夠高效清潔下水道中水垢和頭發(fā)等污垢,具體的產(chǎn)品有BioGuard Plus[85]。

5.2 紡織行業(yè)

作為一種天然動物蛋白纖維,羊毛制成的衣物保暖且舒適,但由于羊毛纖維的特殊鱗片結(jié)構(gòu),難以在紡織加工中進行扎染加工,特別其內(nèi)部含有高度交聯(lián)的二硫鍵,有很強的生物抗性,因此,在應(yīng)用前,需要對羊毛進行處理。

傳統(tǒng)的化學(xué)方法處理羊毛纖維時,常使用氧化劑,這雖使鱗片變軟,但氈縮性能下降,特別是該方法腐蝕性強,會傷及纖維皮質(zhì)層。物理方法處理羊毛纖維主要利用等離子體處理技術(shù),經(jīng)過該方法處理后的羊毛抗纖維斷裂能力得到提高,褪色效果也減弱,但此方法處理過程復(fù)雜,對處理裝置要求高,因此,目前還僅僅停留在實驗室階段。還有使用可吸收有機氯化物(AOX)來加工羊毛的工藝,雖然可控制羊毛纖維的氈縮性[115],但是這種處理工藝會影響纖維的質(zhì)量,同時化學(xué)物品也會對環(huán)境造成危害。另外,其他化學(xué)方法的處理過程,包括清洗、漂白或染色,也會產(chǎn)生有毒化學(xué)品的排放[85]。

使用蛋白酶處理羊毛纖維是一種安全環(huán)保的方式,它不僅能夠降解羊毛角質(zhì)層而不會對其他纖維部分造成任何損害,還能提高羊毛織物的質(zhì)量,被認(rèn)為是傳統(tǒng)化學(xué)方法的最佳替代方式[116]。芽孢桿菌B.subtilisBBE11-1分泌的絲氨酸蛋白酶,經(jīng)適當(dāng)濃縮后與Savinase復(fù)配,能有效防止羊毛縮水,同時降低羊毛織物的質(zhì)量損失[117]。另一種絲氨酸蛋白酶(約3.2×104),Lv等[118]將其基因在金黃桿菌ChryseobacteriumL99 sp. Nov中表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該酶反應(yīng)條件溫和,40 U/mL的蛋白酶可以有效防止羊毛縮水;而假單胞菌Pseudomonas3096-4分泌的粗角蛋白酶處理羊毛織物6 h后氈縮率為4.1%(低于5%),符合國際毛紡織組織(IWTO)TM31的可機洗標(biāo)準(zhǔn)。另外,解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensMA20、枯草芽孢桿菌B.subtilisMA21[120]、鏈霉菌屬Streptomycessp. 2M21[121]、嗜麥芽窄食單胞菌StenotrophomonasmaltophiliaBBE11-1[122]和黃青霉菌株P(guān).chrysogeniumX5[123]來源的蛋白酶都有應(yīng)用于紡織行業(yè)的潛力。

此外,紡織業(yè)的廢棄材料一直是環(huán)境污染的一大問題。隨著生活水平的提高,人們越來越追求時尚,每年有大量服裝在使用后被丟棄,回收這些衣物及其資源化利用已經(jīng)成為一大挑戰(zhàn),蛋白酶在該領(lǐng)域有著較好的應(yīng)用前景。因為蛋白酶可以從羊毛和聚酯混紡織物中選擇性降解羊毛纖維。Navone等[124]采用Ronozyme?ProAct蛋白酶兩步法降解羊毛纖維,先后添加不同劑量的蛋白酶和巰基乙酸鈉還原劑對羊毛纖維進行不同時間的處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：織物混合物中的天然纖維被完全降解,通過光譜和粒度分析回收的合成纖維,與原始樣品相比,酶對聚酯處理后的性能沒有顯著的影響。因此,處理后的聚酯纖維可以再造成聚酯紗,用于制造新成衣或其他產(chǎn)品,可促進循環(huán)經(jīng)濟的發(fā)展。

5.3 皮革行業(yè)

在皮革行業(yè)中,皮毛的脫毛過程是一大挑戰(zhàn)。脫毛即在不破壞皮膚和毛發(fā)結(jié)構(gòu)的情況下去除皮膚上的毛發(fā)[125],包括浸泡、脫毛、軟化和曬黑這4個步驟,常用的化學(xué)試劑為Na2S和CaO,這2種物質(zhì)可以有效地去除皮毛,但同時會對環(huán)境造成污染,并對工作人員的健康造成危害。另外,Na2S和其他化學(xué)品一起排放到環(huán)境中,造成水污染。如果進行化學(xué)處理水污染,還會導(dǎo)致水體生態(tài)紊亂,使得生化需氧量(BOD)、化學(xué)需氧量(COD)、總?cè)芙夤腆w(TDS)和懸浮固體總量(TSS)等增加[126]。與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比,利用蛋白酶處理皮革是一種經(jīng)濟有效的方法,因為該工藝不會釋放化學(xué)毒物,所以用生物催化劑代替無機硫化物來處理皮革在保護環(huán)境和脫毛效率方面都有很大的優(yōu)勢[127]。

已經(jīng)有商業(yè)蛋白酶用于脫毛過程的浸泡、脫毛和軟化,如Aquaderm?、NUE?、Pyrase?和Clarizyme。另外,還有一些商業(yè)角蛋白酶,Koropon?SC 5K,Basozym?CS 10和Pyrase?250 MP主要用于皮革行業(yè)中的軟化工藝部分[128]。Paul等[129]將伍松類芽孢桿菌PaenibacilluswoosongensiTKB2通過固態(tài)發(fā)酵的方式產(chǎn)蛋白酶,并使用響應(yīng)面的方法優(yōu)化產(chǎn)酶條件,將優(yōu)化前后的粗蛋白酶用于脫毛,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與非優(yōu)化條件下的蛋白酶相比,該蛋白酶可在14 h內(nèi)將山羊皮脫毛;經(jīng)過普通顯微鏡和電子顯微鏡對脫毛結(jié)果進行評估,并與常規(guī)的化學(xué)方法進行比較,用蛋白酶處理的山羊皮質(zhì)量更好,不會破壞內(nèi)部的膠原蛋白層,造成的污染也比較少。

Santha Kalaikumari等[130]研究發(fā)現(xiàn)：擬青衣芽孢桿菌BacillusparalicheniformisMKU3可高效生產(chǎn)蛋白酶,在72 h內(nèi)的最大酶產(chǎn)量為1 872.5 U/mL,在大型生物反應(yīng)器中只需24 h就可產(chǎn)生蛋白酶;將此蛋白酶用于羊皮脫毛,掃描電子顯微鏡分析顯示,脫毛的羊皮沒有毛發(fā)殘留、毛孔增大;橫斷面分析也顯示毛發(fā)連同根部被完全去除,處理過的樣品區(qū)域也顯得非常光滑且皮革質(zhì)量良好;對脫毛后的廢水進行分析,COD降低約30%、TDS和TSS分別減少了70%和96%。Zhang等[131]發(fā)現(xiàn),來自副短小芽孢桿菌BrevibacillusparabrevisCGMCC 10798的絲氨酸蛋白酶的分子量為2.8×104,用該蛋白酶處理山羊皮并與化學(xué)法處理山羊皮進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過蛋白酶處理后的皮膚呈白色、觸感更柔軟光滑;而通過化學(xué)方法得到的皮膚顏色較深,有皺紋且觸感較硬。還有Macedo等[132]發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌BacillussubtilisS14的角蛋白酶,在脫毛過程中不會損傷膠原蛋白。Prakash等[133]等發(fā)現(xiàn),來自嗜鹽芽孢桿菌BacillushaloduransPPKS-2的蛋白酶可有效用于去除山羊皮上的毛發(fā)。Jaouadi等[134]發(fā)現(xiàn),從短桿菌BrevibacillusbrevisUS575菌株中新分離的胞外角蛋白酶(KERUS)有著強大的脫毛能力且對膠原蛋白的損傷最小?？傊?角蛋白酶能作用于皮毛,打開毛孔,使毛囊松弛,從而從根部徹底去除毛發(fā),且不會損害毛發(fā)。與化學(xué)法相比,經(jīng)角蛋白酶處理后皮革的拉伸力更好,皮革的膠原結(jié)構(gòu)沒有損害,染色效果也有所提高[101]?？梢?使用蛋白酶法脫毛比傳統(tǒng)的化學(xué)方法更高效且環(huán)保。

5.4 飼料及食品行業(yè)

飼料的成分主要是玉米、豆粕和膨化大豆等,其中,豆粕是豬、牛等動物日糧中最廣泛使用的氨基酸來源,但是豆粕中含有過敏性蛋白,如大豆球蛋白(約占40%)和β-伴大豆球蛋白(約占30%)等[135]。特別地,這些過敏性蛋白中胱氨酸的二硫鍵不僅會影響消化[74],而且會引起動物胃腸道黏膜損傷、腹瀉和免疫功能紊亂[136]。雖然通過預(yù)處理可以提高飼料的利用率和營養(yǎng)價值,但成本相對較高,相比之下,酶催化方法更為經(jīng)濟有效[137]。在飼料中添加角蛋白酶可以提高豬的氨基酸營養(yǎng)消化率和回腸表觀消化率[138]。因為存在于消化道內(nèi)的內(nèi)源性蛋白水解酶主要用于消化蛋白質(zhì),包括胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶等[139],而外源蛋白酶作為單組分產(chǎn)品,與各種酶混合使用已成功用于家禽飼養(yǎng)。最近,Hu等[140]發(fā)現(xiàn),在玉米-豆粕型飼料中添加外源酸性蛋白酶可線性提高粗蛋白質(zhì)的消化率,另外賴氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸和酪氨酸的回腸消化率也有所提高。

Cowieson等[141]研究添加外源性蛋白酶對肉雞的生產(chǎn)性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率和各種腸道健康指標(biāo)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：添加蛋白酶可提高腸道的拉伸強度、絨毛高度,更可減少上皮厚度并降低杯狀細(xì)胞數(shù)量,這些形態(tài)變化均表明腸道完整性和彈性有所增強。Mahmood等[142]研究發(fā)現(xiàn),在飼料中添加外源蛋白酶會提高家禽的生長性能和蛋白質(zhì)消化率。Zhang等[143]研究發(fā)現(xiàn),在飼料中添加外源性蛋白酶35～65日后,可以改善仔豬的腸道健康,促進營養(yǎng)物質(zhì)消化,提高生長性能。Tactacan等[144]研究證實,在斷奶仔豬中的飼料中補充蛋白酶可提高其生長速度。

常用的商業(yè)蛋白酶有Cibenza?DP100和Versazyme。如,將Versazyme添加到飼料中,可改善動物的生長性能、胸肉產(chǎn)量和腸絨毛結(jié)構(gòu)[145],加快動物生長。另一種角蛋白酶Cibenza?DP100可用于促進仔豬生長[74]。Ronozyme?ProAct絲氨酸蛋白酶由地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis生產(chǎn),Saleh等[146]發(fā)現(xiàn),在飼料中添加該酶可提高仔豬的生長和飼料轉(zhuǎn)化率,當(dāng)添加水平為200～300 mg/kg,可能提高蛋白質(zhì)的利用率,生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)利用、肉雞脂質(zhì)過氧化等都有改善,這可能是由于蛋白酶可以分解抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)(如胰蛋白酶抑制劑),從而提高氨基酸的利用率。

蛋白酶還可應(yīng)用于食品工業(yè)中,因為一些內(nèi)肽酶和外肽酶可裂解蛋白水解物末端(N和C端)或肽段內(nèi)部的疏水氨基酸,以此來去除食品中的苦味[147]。大豆蛋白會引起人或動物的過敏反應(yīng),這主要是由免疫球蛋白E(IgE)引起的,利用胃蛋白酶和糜蛋白酶對大豆2S蛋白進行水解,可以降低大豆蛋白的致敏性[148]。天冬氨酸蛋白酶作為奶酪中凝乳酶的替代品,在烘焙食物中可以提高谷蛋白的溶解度,還可用于啤酒和葡萄酒中霧狀物及沉淀的去除等[149]。

由此可見,蛋白酶在飼料及食品領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用,具有良好的應(yīng)用前景。

5.5 化妝品行業(yè)

角蛋白酶可作用于人體皮膚以及其他的角質(zhì)組織,在化妝品行業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價值[150]。與化學(xué)工藝相比,在化妝品中使用生物技術(shù)獲得的有生理活性的化合物,具有抗氧化、抗衰老、抗皺和美白等生物特性,且無副產(chǎn)物[151]。如,生物活性肽有助于調(diào)節(jié)生物反應(yīng),包括改善皮膚生理機能。低分子量(<103)的角蛋白降解得到的功能短肽能夠滲透到皮膚中并改善皮膚的保濕能力,增加皮膚的彈性[152]。因此,將蛋白酶添加到化妝品的配方中,不僅可以降解蛋白質(zhì)釋放多肽,使皮膚更加光滑細(xì)膩,而且還產(chǎn)生消炎、淡斑和美白等功效[153]。頭發(fā)由角蛋白和少量脂質(zhì)組成,陽光、高熱量和日常的染發(fā)燙發(fā)、漂洗等都會給頭發(fā)造成一定的損害,如將角蛋白酶添加到洗發(fā)水、護發(fā)素等洗護用品中,可以改善頭發(fā)的質(zhì)量,減少頭發(fā)纖維斷裂,增加頭發(fā)光澤等[154]。

Kshetri等[155]發(fā)現(xiàn),來自Bacillussp. RCM-SSR-102的角蛋白酶KER102(分子量為3.0×104)是一種堿性絲氨酸金屬蛋白酶,它可將角蛋白廢物轉(zhuǎn)化為具有生物活性的角蛋白水解物,得到的蛋白質(zhì)水解物顯示出抗氧化性和抗酪氨酸酶的活性[155]。酪氨酸酶是一種使黑色素形成的限速酶,因此具有抗酪氨酸酶活性的物質(zhì)有利于皮膚的美白,將其用于化妝品中,可改善皮膚的彈性并提高皮膚的保濕能力[152]。熊果苷是一種酪氨酸酶抑制劑,被廣泛應(yīng)用于美白化妝品中。熊果苷十一烯酸酯可以由枯草芽孢桿菌的蛋白酶(Bioprase),催化酯交換反應(yīng)而合成[156],熊果苷十一烯酸酯可有效降低黑色素的產(chǎn)生,與對照組相比,使用0.1 mmol/L熊果苷酯孵育B16黑色素細(xì)胞6 d后,黑色素的生成水平下降到初始的30%左右[157]。使用BacillussubtilisAMR產(chǎn)生的角蛋白酶降解羽毛可得到多種蛋白質(zhì)水解物,其中包含角蛋白肽和氨基酸,利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)檢測結(jié)果顯示,水解物中含有分子量為(0.8～1.0)×104的多肽;通過掃描電鏡分析顯示,這些低分子量的多肽護發(fā)產(chǎn)品能夠顯著提高毛發(fā)纖維的亮度和柔軟度[154]。

角蛋白酶還可應(yīng)用于人們使用的脫毛膏產(chǎn)品中,如BacillussubtilisDP1生產(chǎn)的堿性蛋白酶,在pH 為8.0～12.0條件下保存16 h之后,依然保持90%的穩(wěn)定性,用該角蛋白酶代替脫毛膏中的巰基乙酸鹽來制備生物脫毛膏,與商業(yè)脫毛膏相比,脫毛效率顯著提高[158],這說明將角蛋白酶添加到脫毛膏中有著廣闊的前景。

5.6 醫(yī)藥行業(yè)

在醫(yī)藥行業(yè),蛋白酶也有廣泛的應(yīng)用,主要用于治療痤瘡、指甲疾病以及朊病毒等方面。

5.6.1 指甲和皮膚

指甲甲床的真菌感染與指甲脫落是目前最常見的兩種疾病,大多數(shù)指甲疾病難以治愈,尤其是甲床下方發(fā)生感染的疾病。目前的治療方案包括口服抗真菌藥和外敷用藥,然而這些治療方法同時也存在著副作用(如疼痛、肝損傷等),同時還存在藥物之間的相互作用對人體造成的危害[159]。因此,開發(fā)了在局部應(yīng)用某種藥物的替代療法,但是此方法因藥物在整個甲床上的滲透性差,導(dǎo)致療效有限[160]。角蛋白酶可以結(jié)合還原劑二硫蘇糖醇,提高對指甲的滲透性從而使藥物順利進入指甲內(nèi)部[161],在一定程度上通過損害甲板的完整性以增加藥物的滲透性。目前,用于對指甲疾病治療的商業(yè)產(chǎn)品包括Fixa Fungus TM、Kernail-soft PB和Pure100 Keratinase[17]。

Tiwary等[162]將從地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisER-15中獲得的角蛋白酶與一種新型單體γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT30)的復(fù)合物(命名為KerN),作用于指甲,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：KerN能夠使甲基質(zhì)松弛,腐蝕甲背表面,進而使藥物滲透進指甲內(nèi)部,用于治療甲癬。Gupta等[163]將來自枯草桿菌B.subtilisRSE163的角蛋白酶與銀屑病外用的局部藥物結(jié)合,用于增強藥物的吸收和滲透[163]。除了用于指甲疾病外,蛋白酶還可應(yīng)用于皮膚組織中,作為皮膚的滲透劑以增強藥物透過皮膚表面,向里層傳遞。

5.6.2 痤瘡

痤瘡在青少年中是一種常見的皮膚疾病,主要是分泌過多的角蛋白導(dǎo)致皮脂堵塞。一些角蛋白酶可以溶解死細(xì)胞和堵塞皮脂腺的角蛋白,因此可用于治療痤瘡[85]。如,一些商業(yè)角蛋白酶的產(chǎn)品Keratopeel PB 和Keratoclean Sensitive PB可用于痤瘡治療。來自地衣芽孢桿菌B.licheniformisPWD和大腸桿菌E.coli的角蛋白酶已用于痤瘡的治療[161]。另外,金屬蛋白酶對于治療痤瘡也有重要的作用[164]。

5.6.3 朊病毒的治療

朊病毒是引起神經(jīng)退行性疾病的傳染因子,這些疾病具有傳染性和致命性,如傳染性海綿狀腦病(TSE)會影響許多哺乳動物[165]。朊病毒一般是由正常的蛋白質(zhì)變性所導(dǎo)致的。目前朊病毒的傳播方式主要包括人類食用受污染的肉類,屠宰場、醫(yī)院的污水以及被污染的醫(yī)療器械引起的醫(yī)源性傳播。當(dāng)前朊病毒的凈化方法主要是使用高溫、極端pH以及刺激性化學(xué)品[160]。然而這些方法不僅對環(huán)境有危害,而且容易損傷醫(yī)療器械,使得科學(xué)家們開始轉(zhuǎn)向角蛋白酶治療朊病毒的應(yīng)用研究。

Okoroma等[166]將來自地衣芽孢桿菌B.licheniformisN22的角蛋白酶與銅綠假單胞菌P.aeruginosaNCIMB 8626的生物表面活性劑一起作用于被朊病毒(PrPSc)感染的離體細(xì)胞,在65 ℃下孵化10 min后,該酶將瘙癢型朊病毒降解至無法檢測到的PrPSc信號水平;同時發(fā)現(xiàn),角蛋白酶的催化機制和生物表面活性劑的溶解特性起到了重要作用。該方法可用于凈化醫(yī)療器械中的朊病毒。

從Bacillus分離的MSK103絲氨酸蛋白酶屬于枯草桿菌蛋白酶,最適pH為9.0～10.0、最適溫度為60～70 ℃,Yoshioka等[167]將該蛋白酶用于被朊病毒感染的小鼠、倉鼠和牛的腦勻漿,微孔板去污結(jié)果表明,它能夠有效降解被PrPSc感染后的腦勻漿且無須洗滌劑和熱的預(yù)處理。該蛋白酶也可用于易受PrPSc污染的精密儀器的凈化。

除了上述的蛋白酶外,Sharma等[168]發(fā)現(xiàn),γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶-谷胱甘肽(GGT-GSH)和角蛋白酶rKP2的協(xié)同作用可有效降解替代朊病毒蛋白Sup 35NM,因此,這種組合未來也可用于降解朊病毒。Mitsuiki等[169]從諾卡氏菌屬Nocardiopsissp. TOA-1分離得到堿性蛋白酶NAPase,將該酶用于被感染的倉鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在pH 11.0和60 ℃條件下,4 μg的NAPase在3 min可將瘙癢的朊病毒蛋白完全降解。

5.6.4 其他

不同配方的無紡布組織和一些含有由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶的軟膏在皮膚病方面也有很好的治療效果[170]。

5.7 生物能源

角蛋白酶也可用于生物能源領(lǐng)域。角蛋白酶水解羽毛產(chǎn)生的氮,不僅可以促進土壤微生物生長、改善植物生長、增加土壤的保水能力[171],而且可以通過對角蛋白廢物的厭氧消化生產(chǎn)沼氣用作燃料。理論上,揮發(fā)性固體中的蛋白質(zhì)的甲烷產(chǎn)量可以達(dá)到0.496 m3/kg,但實際上廢羽毛產(chǎn)生的甲烷產(chǎn)量只有0.21 m3/kg[172]。目前,可通過角蛋白酶處理揮發(fā)性固體以提高甲烷產(chǎn)量,Salminen等[173]使用來自轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的商用堿性內(nèi)肽酶Multifect P-3000?結(jié)合熱處理,對羽毛進行預(yù)處理,使甲烷產(chǎn)率提高了37%～51%。Mahdy等[174]利用丹麥Novozymes公司的蛋白酶Alcalase 2.5L和Viscozyme對小球藻預(yù)處理來產(chǎn)生沼氣,得到較高的甲烷產(chǎn)量(每克COD產(chǎn)137 mL CH4)。Patinvoh等[175]利用芽孢桿菌C4產(chǎn)生的角蛋白酶對雞毛進行預(yù)處理,與未處理的羽毛相比,在厭氧消化55 d后,相對于使用污泥和細(xì)菌作為接種物,產(chǎn)量分別提高237%和124%[175]。Mahdy等[176]通過添加蛋白酶Alcalase對小球藻進行水解,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：厭氧生物降解率達(dá)到86%,且沼氣的產(chǎn)量提升了一倍。雖然角蛋白酶在能源行業(yè)具有極高的應(yīng)用潛力,但是目前相關(guān)蛋白處理技術(shù)仍不成熟,所以基于角蛋白酶生產(chǎn)的沼氣仍需進一步研究。

6 總結(jié)與展望

蛋白酶由于其特性,越來越受到人們的關(guān)注。不同特性的蛋白酶在不同的行業(yè)發(fā)揮著巨大的作用,一些以蛋白酶為基礎(chǔ)的產(chǎn)品已經(jīng)商業(yè)化,但是目前有關(guān)蛋白酶的研究成果仍然有限,尤其是在催化轉(zhuǎn)化的機制方面,還需要學(xué)者進一步的探究。

此外,我國大部分蛋白酶都依賴進口,且蛋白酶序列被國外高度壟斷,特別是我國目前缺乏低溫堿性蛋白酶、在工業(yè)上具有穩(wěn)定性的蛋白酶和抗自切的蛋白酶。因此,可通過改造、重組、修飾等方式來改善蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能。目前,通過基因修飾和蛋白質(zhì)工程來提高蛋白酶產(chǎn)量的方法已經(jīng)被廣泛使用,利用生物信息學(xué)的工具有助于進一步改善蛋白酶性能。在日益擴大的工業(yè)中,利用蛋白酶也是一種環(huán)境友好的方式,隨著對蛋白酶的不斷研究和探索,未來蛋白酶會有更廣闊的發(fā)展空間和良好的應(yīng)用前景。

隨著人民生活水平的提高,高端蛋白酶產(chǎn)品在人們?nèi)粘Ｉ钪酗@得十分重要,這更需要加大科研的投入,創(chuàng)制有自主知識產(chǎn)權(quán)的蛋白酶,以國家戰(zhàn)略及市場需求為導(dǎo)向,基于生物酶研發(fā)的先進酶挖掘、高效進化和(半)理性設(shè)計技術(shù),從序列源頭挖掘、篩選和設(shè)計具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新基因序列,利用自主構(gòu)建的生產(chǎn)菌株,建立高強度生產(chǎn)技術(shù)并獲得新產(chǎn)品,實現(xiàn)“基礎(chǔ)研究—技術(shù)創(chuàng)新—工業(yè)應(yīng)用”的全鏈條設(shè)計和新型蛋白酶產(chǎn)品的開發(fā)。