嚴(yán)云峰,閆 震,2

(1. 山東大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 山東省水環(huán)境污染控制與資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266237;2. 山東大學(xué)蘇州研究院,江蘇 蘇州 215123)

甲烷既是可再生的清潔能源,也是第二大溫室氣體,全球甲烷排放量中有超過70%來自地球厭氧環(huán)境中棲息的產(chǎn)甲烷古菌[1]。作為地球上最古老的生命之一,產(chǎn)甲烷古菌在生物地球碳循環(huán)中扮演著重要角色,它的生長代謝及其產(chǎn)甲烷過程與地球氣候的變化息息相關(guān)[2]。目前已知的生物甲烷排放主要來自乙酸型與H2/CO2型兩條產(chǎn)甲烷途徑,而乙酸型產(chǎn)甲烷途徑貢獻(xiàn)了其中的三分之二[3-4]。因此,深刻認(rèn)識乙酸型產(chǎn)甲烷途徑的微觀作用機(jī)制,可為甲烷的減排及其作為能源的合理利用奠定理論基礎(chǔ)。

乙酸型甲烷八疊球菌(Methanosarcinaacetivorans)是一種嚴(yán)格厭氧的產(chǎn)甲烷古菌,屬于廣古菌門、甲烷微菌綱、甲烷八疊球菌科、甲烷八疊球菌屬[5-6]。M.acetivorans于1984年從美國加利福尼亞州附近海域的海洋沉積物中分離獲得[7],數(shù)十年來,M.acetivorans已成為研究乙酸型產(chǎn)甲烷途徑的模式菌株。不僅如此,由于代謝途徑的多樣性與可遺傳操控性,M.acetivorans表現(xiàn)出作為開發(fā)合成生物學(xué)底盤和構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠的巨大潛力[8]。

因此,筆者在綜述M.acetivorans的產(chǎn)甲烷代謝途徑、遺傳改造策略和細(xì)胞工廠構(gòu)建3個(gè)方面研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上,分析M.acetivorans與其他進(jìn)行乙酸型產(chǎn)甲烷代謝的產(chǎn)甲烷古菌在這三方面的異同,并對進(jìn)一步設(shè)計(jì)和構(gòu)建其作為微生物細(xì)胞工廠所面臨的問題與挑戰(zhàn)進(jìn)行展望。

1 乙酸型產(chǎn)甲烷途徑

圖1 乙酸型產(chǎn)甲烷代謝途徑及3種能量代謝模式(修改自文獻(xiàn)[4,8])Fig.1 Aceticlastic methanogenesis and three modes of energy metabolism(Modified from reference [4,8])

2 遺傳改造策略

2.1 傳統(tǒng)的基因編輯方法

在生化和生理學(xué)研究基礎(chǔ)之上,對乙酸型產(chǎn)甲烷古菌的進(jìn)一步了解與改造需要借助分子生物學(xué)的遺傳改造策略。不同于其他產(chǎn)甲烷古菌,Methanosarcina屬的乙酸型產(chǎn)甲烷古菌不僅能利用多種底物進(jìn)行生長代謝產(chǎn)甲烷[32],而且M.acetivorans和M.barkeri作為遺傳操作的模式產(chǎn)甲烷古菌,還能在固體培養(yǎng)基中很好地維持單細(xì)胞形態(tài)[33],這些特征都為乙酸型產(chǎn)甲烷古菌的遺傳改造提供了便利[34]。

一方面,傳統(tǒng)的遺傳改造策略是利用片段同源重組或位點(diǎn)特異性整合來完成對宿主染色體上基因的敲除、插入或置換(圖2)[35-38]。通常有2種方法可用于構(gòu)建靶基因敲除菌株(圖2(a)和圖2(b))[36],一種是利用pMP44衍生質(zhì)粒經(jīng)過兩次同源重組實(shí)現(xiàn)基因的無標(biāo)記敲除(表1)[35-39],前提是靶基因是非必需的且敲除后生長速率不受影響,理論上基因成功敲除的概率為50%[38];另外一種是先利用線性化的pJK301衍生質(zhì)粒經(jīng)兩側(cè)同源重組進(jìn)行靶基因敲除,再導(dǎo)入pMR55質(zhì)粒,利用翻轉(zhuǎn)重組酶(Flp)識別和重組兩側(cè)的特異性位點(diǎn)(FRT),從而去除篩選和反篩選標(biāo)記基因(pac-hpt)編碼的操縱子標(biāo)記,特點(diǎn)是FRT“疤痕”將保留在刪除位置(表1)[35-36]。目的基因在染色體上的插入通常利用位點(diǎn)特異性整合的方式將整個(gè)質(zhì)粒整合到特定的hpt位點(diǎn)(圖2(c)),通常選用pAB79衍生質(zhì)粒或pJK026A系列衍生質(zhì)粒,特點(diǎn)是均可以通過ΦC31位點(diǎn)特異性重組整合至M.acetivorans基因組內(nèi)[39-41]。相應(yīng)地,要求宿主菌株應(yīng)攜帶組成型表達(dá)的ΦC31位點(diǎn)特異性重組酶基因(int)和整合到染色體hpt上的ΦC31attP位點(diǎn)。M.acetivorans的基因進(jìn)行陽性檢測對于染色體上關(guān)鍵基因的確定至關(guān)重要。使用四環(huán)素(Tc)依賴性啟動子PmcrB(tetO)對檢測基因啟動子進(jìn)行原位置換,利用四環(huán)素抗性阻遏蛋白(TetR)與啟動子內(nèi)的操作子序列(tetO)作用機(jī)制來控制檢測基因的表達(dá)水平,再比較在基因不同表達(dá)水平下菌體生長情況來確定基因的必要性[39,42]。啟動子原位置換是利用線性化的pGK050A系列衍生質(zhì)粒通過兩側(cè)同源重組來實(shí)現(xiàn)。同樣地,重組時(shí)利用的pac-hpt操縱子標(biāo)記可通過導(dǎo)入pMR55質(zhì)粒來去除,從而實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記的遺傳改造(圖2(d))[35]。

另一方面,傳統(tǒng)的遺傳改造策略是利用可自主復(fù)制的穿梭載體在不整合至宿主基因組的情況下完成目的基因的表達(dá)。研究人員以M.acetivorans自身的pC2A質(zhì)粒為基礎(chǔ),開發(fā)出一系列可在E.coli/Methanosarcina中自主復(fù)制的穿梭載體[34,43],在M.acetivorans單個(gè)細(xì)胞中利用pC2A復(fù)制子可獲得約6個(gè)拷貝數(shù)[39,44]。以常用的穿梭質(zhì)粒pWM321為例[34],質(zhì)粒上含有可在E.colipir+DH5α中復(fù)制的R6K復(fù)制子、可供篩選的氨芐青霉素抗性基因以及可在M.acetivorans中復(fù)制的pC2A復(fù)制子和可供篩選的嘌呤霉素抗性基因(表1)。同時(shí),pWM321質(zhì)粒還提供一個(gè)大型的多克隆位點(diǎn)方便目的基因相關(guān)表達(dá)原件的插入。需要注意的是,為避免自主復(fù)制質(zhì)粒整合到染色體上,轉(zhuǎn)化時(shí)所用的宿主應(yīng)缺失ΦC31int基因且不包含任何ΦC31附著位點(diǎn)[38]。

另外,傳統(tǒng)的遺傳改造策略還包括通過改造和優(yōu)化核心啟動子及核糖體結(jié)合序列(RBS)增強(qiáng)蛋白的表達(dá)。在古菌和真核生物中,轉(zhuǎn)錄起始速率由相同的3個(gè)核心啟動子元件控制,分別是TATA盒、RNA Ⅱ聚合酶轉(zhuǎn)錄因子識別元件(BRE)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)。另外,古菌中RBS的翻譯啟動與細(xì)菌類似,都是基于Shine-Dalgarno序列識別[45]。Karim等[46]通過將合理設(shè)計(jì)的突變引入Mcr的β亞基(mcrB)基因的核心啟動子和RBS中,建立了對M.acetivorans蛋白質(zhì)水平的表達(dá)調(diào)控,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過改造核心啟動子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)可使M.acetivorans的調(diào)控蛋白質(zhì)水平在60倍范圍內(nèi)發(fā)生可預(yù)測的變化。這一發(fā)現(xiàn)為乙酸型產(chǎn)甲烷菌代謝工程改造提供了更精準(zhǔn)的調(diào)控策略。

2.2 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)

CRISPR-Cas9技術(shù)具有精準(zhǔn)、高效和脫靶率低等特點(diǎn),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于真核和原核生物的基因編輯[47]。近年來,針對產(chǎn)甲烷古菌的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)已成功應(yīng)用于M.acetivorans[48-49]與H2/CO2型產(chǎn)甲烷古菌M.maripaludis[50]改造,這無疑為產(chǎn)甲烷古菌的遺傳改造提供了新策略。

Nayak等[48-49]研究發(fā)現(xiàn),利用Cas9介導(dǎo)的同源定向修復(fù)手段進(jìn)行基因的插入和敲除是非常精準(zhǔn)且高效的(圖3(a))。一方面,所有的轉(zhuǎn)化子在基因組內(nèi)都能發(fā)生所需的突變且沒有脫靶活性;另一方面,遺傳改造所需時(shí)間由傳統(tǒng)方法的8～12周縮短至3～4周,將多個(gè)sgRNAs在同一轉(zhuǎn)錄本中表達(dá),進(jìn)而引導(dǎo)Cas9在不影響轉(zhuǎn)化效率的前提下同時(shí)對宿主染色體引入多個(gè)突變,極大地減少了構(gòu)建復(fù)雜菌株所需的時(shí)間。另外,通過設(shè)置合適的對照實(shí)驗(yàn),基于Cas9的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化結(jié)果就可以很好地確定染色體上基因的必要性,還可以操縱必需基因,如添加串聯(lián)親和標(biāo)簽等[49]。在M.acetivorans中,以CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用為例,Cas9的表達(dá)、sgRNA以及同源修復(fù)片段(DNA Donor)的合成都依賴于pDN_CRISPR系列質(zhì)粒的構(gòu)建[48]。完整的pDN衍生質(zhì)粒上除了關(guān)鍵的pC2A復(fù)制子和pac-hpt篩選標(biāo)記外,還包括PmarB(tetO1)引導(dǎo)表達(dá)的化膿鏈球菌Cas9、甲醇誘導(dǎo)型啟動子PmtaCB1介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的sgRNA和同源修復(fù)片段(切割位點(diǎn)兩側(cè)各500～1 000 bp的同源序列)。如果采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒并以自主復(fù)制的方式在菌體內(nèi)表達(dá),必須注意的是為避免質(zhì)粒整合至基因組內(nèi),轉(zhuǎn)化時(shí)所用的宿主應(yīng)缺失ΦC31int基因且不包含任何ΦC31附著位點(diǎn)。此外,近期Nayak等[48]研究發(fā)現(xiàn),通過sgRNA引導(dǎo)Cas9特異性切割產(chǎn)生致命的DNA雙鏈斷裂(DBS)不僅可以通過修復(fù)片段的同源重組來進(jìn)行基因編輯,而且可以通過與Methanocellapaludicola非同源末端連接(NHEJ)機(jī)制共表達(dá)的方式在微同源區(qū)產(chǎn)生長度不等的缺失來完成遺傳改造。

圖3 CRISPR-Cas9和CRISPRi-dCas9遺傳改造機(jī)制(修改自文獻(xiàn)[48,50])Fig.3 CRISPR-Cas9 and CRISPRi-dCas9 genetic modification mechanisms(Modified from reference [48,50])

在產(chǎn)甲烷古菌中的基因編輯策略除了利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的sgRNA引導(dǎo)Cas9切割和定向修復(fù)進(jìn)行基因的缺失和插入之外,還可以利用sgRNA引導(dǎo)存在缺陷或失活的dCas9與DNA結(jié)合(CRISPRi-dCas9),在不產(chǎn)生切割的前提下阻斷基因轉(zhuǎn)錄的起始和延伸來抑制基因表達(dá)(圖3(b))。Dhamad等[50]通過將pDN衍生質(zhì)粒中的Cas9替換為dCas9來制備目的pDL系列衍生質(zhì)粒,并以M.acetivorans中參與固氮的基因簇[51-53]為靶向評估dCas9介導(dǎo)的靶基因抑制效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)sgRNA靶向固氮基因(nif)的兩個(gè)獨(dú)立區(qū)域(啟動子Pnif和關(guān)鍵基因nifD)時(shí),nif轉(zhuǎn)錄本的豐度降低幅度>90%,M.acetivorans的固氮功能喪失;當(dāng)sgRNA靶向固氮酶輔因子合成必需基因(nifB)時(shí),nifB轉(zhuǎn)錄的本豐度降低幅度>85%,固氮功能未完全喪失;當(dāng)sgRNA靶向nif阻遏子編碼基因(nrpR1)時(shí),nif操縱子轉(zhuǎn)錄本的豐度增加,M.acetivorans可以通過固氮作用正常生長。這一系列結(jié)果揭示了CRISPRi-dCas9系統(tǒng)在靶基因抑制方面的突出效果,為產(chǎn)甲烷古菌的遺傳改造提供了新思路和新方法。

總的來說,產(chǎn)甲烷古菌的遺傳改造是一個(gè)相對較新的發(fā)展領(lǐng)域,其獨(dú)特的代謝過程和重要的生態(tài)學(xué)意義使其成為近年來遺傳研究的熱點(diǎn)。此外,產(chǎn)甲烷古菌可以作為整個(gè)古菌域的遺傳改造模型,針對現(xiàn)有基因編輯方法的優(yōu)化改進(jìn)以及擴(kuò)大產(chǎn)甲烷古菌遺傳改造的研究范圍都有著較好的研究前景。

3 以M. acetivorans為底盤細(xì)胞的細(xì)胞工廠構(gòu)建

3.1 基于產(chǎn)甲烷途徑構(gòu)建細(xì)胞工廠

厭氧消化是實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化最有效的技術(shù)之一,實(shí)現(xiàn)形式是產(chǎn)生以甲烷為主要成分的生物沼氣,對環(huán)境污染物處理和可再生能源生產(chǎn)具有重要意義。厭氧消化最終的產(chǎn)甲烷階段由產(chǎn)甲烷古菌負(fù)責(zé),這也是整個(gè)厭氧消化反應(yīng)的關(guān)鍵限速和控制步驟。然而,多數(shù)產(chǎn)甲烷古菌對環(huán)境因素極其敏感,如pH的突然變化、鹽或有機(jī)物濃度的增加、負(fù)載速率的改變或有毒化合物的引入,通常會導(dǎo)致系統(tǒng)故障,這會極大地影響產(chǎn)甲烷階段的代謝速率。與其他產(chǎn)甲烷古菌相比,Methanosarcina屬菌株對所處環(huán)境的變化有著更強(qiáng)的抵抗性。de Vrieze等[54]發(fā)現(xiàn),M.acetivorans與M.barkeri可耐受的總銨質(zhì)量濃度高達(dá)7 g/L、鹽質(zhì)量濃度高達(dá)18 g/L(以Na+計(jì))以及乙酸鹽質(zhì)量濃度高達(dá)15 g/L,并且可以抵抗0.8～1.0個(gè)單位的pH變化?；谶@些特點(diǎn),當(dāng)環(huán)境因素影響生物沼氣生成的穩(wěn)定性和高效性時(shí),可將M.acetivorans作為合適的生物增強(qiáng)型接種物強(qiáng)化厭氧消化過程中的甲烷再生。

隨著以M.acetivorans為底盤微生物的遺傳改造技術(shù)的快速發(fā)展,以M.acetivroans純培養(yǎng)物作為微生物細(xì)胞工廠的研究也越來越受到關(guān)注。Lessner等[55]通過引入來源于Pseudomonasveronii的編碼廣泛特異性酯酶基因mekB,將M.acetivorans的酯酶活性提高80倍,使其將源自乙酸甲酯和丙酸甲酯的甲基轉(zhuǎn)化為甲烷,進(jìn)一步增加了Methanosarcina可用底物的范圍。Aldridge等[56]利用Methanosarcina作為細(xì)胞工廠合成化工原料異戊二烯：其一是將異戊二烯合成酶基因ispS導(dǎo)入M.acetivorans中,在以甲醇為底物的分批培養(yǎng)條件下,M.acetivorans的異戊二烯產(chǎn)量是細(xì)菌Clostridiumljungdahlii的6×106倍,是自養(yǎng)型藍(lán)細(xì)菌Synechocystis的179倍;其二是將ispS基因?qū)隡.barkeri中后發(fā)現(xiàn),能以甲醇或者H2/CO2為底物生產(chǎn)異戊二烯,不過產(chǎn)率分別為M.acetivorans(底物為甲醇)的3.8%和2.4%[56]。近期,Sch?ne等[57]通過敲除編碼M.acetivorans產(chǎn)甲烷途徑的關(guān)鍵酶Mtr的基因與適應(yīng)性進(jìn)化培養(yǎng),可重構(gòu)其產(chǎn)甲烷生長代謝途徑為CO依賴型的產(chǎn)乙酸生長代謝途徑,這對于進(jìn)一步了解產(chǎn)甲烷途徑的功能進(jìn)化過程以及拓寬產(chǎn)甲烷古菌作為微生物細(xì)胞工廠的應(yīng)用范圍具有重要意義。

3.2 基于反向產(chǎn)甲烷途徑構(gòu)建細(xì)胞工廠

在厭氧發(fā)酵鏈的末端,產(chǎn)甲烷古菌產(chǎn)生的生物甲烷,一部分被同處于厭氧環(huán)境的甲烷氧化古菌(ANME)所消耗,未被消耗的部分排放入大氣,若能有效利用ANME在厭氧環(huán)境中作為“甲烷匯”的重要功能,就可緩解甲烷排放入大氣對地球造成的溫室效應(yīng)[58]。ANME所進(jìn)行的甲烷厭氧氧化屬于熱力學(xué)吸能反應(yīng),需要耦合體外電子受體,如硝酸鹽、三價(jià)鐵或四價(jià)錳的還原才能進(jìn)行[59],這造成ANME生長極其緩慢,目前還沒有純培養(yǎng)物被分離,更沒有可進(jìn)行遺傳改造的分子生物學(xué)技術(shù),所以很難開發(fā)作為細(xì)胞工廠進(jìn)行甲烷生物轉(zhuǎn)化研究。由于ANME與產(chǎn)甲烷古菌起源于廣古菌門共同的祖先,應(yīng)用基于宏組學(xué)技術(shù)對ANME的富集培養(yǎng)物研究發(fā)現(xiàn),與產(chǎn)甲烷途徑及其能量代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因在ANME宏基因組也普遍存在并具有較高的表達(dá)豐度,基于此,ANME被認(rèn)為采用反向的產(chǎn)甲烷途徑進(jìn)行甲烷厭氧氧化。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)Methanosarcina與ANME的若干分支親緣關(guān)系較近,因此以M.acetivorans與M.barkeri等純菌株為底盤細(xì)胞研究反向產(chǎn)甲烷途徑提供了理想平臺。Yan等[60]通過生物化學(xué)技術(shù)研究M.acetivorans與胞外三價(jià)鐵的電子互營機(jī)制,揭示了胞外三價(jià)鐵驅(qū)動甲烷厭氧氧化的分子機(jī)制(圖4)。近期,Yu等[61]研究發(fā)現(xiàn),M.barkeri可利用三價(jià)鐵或陽性電極作為電子受體進(jìn)行甲烷厭氧氧化,但是否可以進(jìn)行以甲烷作為唯一碳源的生長代謝還有待進(jìn)一步研究。

圖中左側(cè)為M. acetivorans產(chǎn)甲烷代謝途徑,右側(cè)為M. acetivorans反向產(chǎn)甲烷代謝途徑。其中反應(yīng)(1)是反向產(chǎn)甲烷代謝途徑的第一步,反應(yīng)不可逆且需輔以三價(jià)鐵作為電子受體;反向產(chǎn)甲烷途徑的反應(yīng)(2)中所需Na+來自Fdred氧化過程中產(chǎn)生;其余反應(yīng)步驟均可逆圖4 M. acetivorans產(chǎn)甲烷代謝途徑和反向產(chǎn)甲烷途徑的比較(修改自文獻(xiàn)[4])Fig.4 Comparison of methanogenic metabolic pathway and reverse methanogenic pathway of M. acetivorans(Modified from reference [4])

利用遺傳改造技術(shù)構(gòu)建以M.acetivorans為底盤細(xì)胞的甲烷轉(zhuǎn)化細(xì)胞工廠也在如火如荼地進(jìn)行中。Soo等[62]將ANME編碼反向產(chǎn)甲烷代謝途徑第一步催化甲烷氧化的關(guān)鍵酶Mcr的基因克隆至M.acetivorans以強(qiáng)化甲烷厭氧氧化,輔以三價(jià)鐵作為電子受體,可實(shí)現(xiàn)以M.acetivorans作為微生物細(xì)胞工廠轉(zhuǎn)化甲烷為生物燃料前體乙酸。McAnulty等[63]將Clostridiumacetobutylicum中編碼3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶的基因(hbd)克隆至甲烷氧化強(qiáng)化型M.acetivorans中以此合成乳酸,最高獲得約6 μmol的乳酸產(chǎn)量。另外,McAnulty等[64]還將甲烷氧化強(qiáng)化型M.acetivorans、電活性細(xì)菌Geobactersulfurreducens以及經(jīng)甲烷馴化的污泥共培養(yǎng),可將甲烷轉(zhuǎn)化為電能,具體機(jī)制為M.acetivorans利用反向產(chǎn)甲烷途徑捕獲甲烷并產(chǎn)生乙酸,甲烷馴化污泥中的微生物(如Paracoccusdenitrificans),通過提供電子穿梭體促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移,G.sulfurreducens以乙酸鹽來產(chǎn)生電子,以創(chuàng)建微生物燃料電池,將甲烷直接轉(zhuǎn)化為電能。表2總結(jié)了近年來將乙酸型甲烷八疊球菌作為細(xì)胞工廠的應(yīng)用實(shí)例。

表2 乙酸型甲烷八疊球菌作為細(xì)胞工廠的應(yīng)用

4 結(jié)論與展望

詳細(xì)解析乙酸型產(chǎn)甲烷途徑及其能量代謝過程,不僅有重要的環(huán)境生態(tài)意義,也是開發(fā)以乙酸型產(chǎn)甲烷古菌作為底盤細(xì)胞構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠的理論基礎(chǔ)。作為乙酸型產(chǎn)甲烷古菌的模式菌株,M.acetivorans具有代謝途徑多樣、遺傳調(diào)控策略清晰、純培養(yǎng)技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn),這些都為以M.acetivorans為細(xì)胞工廠開發(fā)甲烷的生產(chǎn)及其高值化轉(zhuǎn)化技術(shù)提供了可能。盡管如此,與其他模式微生物相比,M.acetivorans相關(guān)的分子遺傳改造技術(shù)開發(fā)和細(xì)胞工廠構(gòu)建還處于初級階段,仍然面臨諸多問題與挑戰(zhàn)。首先,與其他模式微生物相比,M.acetivorans的生長代謝效率偏低,特別是M.acetivorans的培養(yǎng)、分子遺傳操控等技術(shù)都需要在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行,這些是開發(fā)更為方便快捷的分子遺傳改造技術(shù)的瓶頸,嚴(yán)重限制了以它作為細(xì)胞工廠來生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率。其次,對M.acetivorans進(jìn)行遺傳改造的分子生物學(xué)工具包還僅為國外的個(gè)別課題組開發(fā)并擁有,并未由Addgene等公益性組織共享,這對于構(gòu)建M.acetivorans細(xì)胞工廠帶來了很多的不便。最后,單一的M.acetivorans細(xì)胞工廠穩(wěn)定性較低、環(huán)境適應(yīng)能力較弱、不易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模,所以M.acetivorans作為微生物細(xì)胞工廠的巨大潛力還有待進(jìn)一步發(fā)掘。

為解決M.acetivorans生長效率慢的問題,可利用基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型與13C同位素示蹤等技術(shù)分析碳代謝流,從全局規(guī)模系統(tǒng)地認(rèn)識代謝網(wǎng)絡(luò),預(yù)測限制甲烷代謝效率的可調(diào)控靶點(diǎn),再利用代謝工程技術(shù),如啟動子工程、RNA調(diào)控元件等,平衡各代謝流的基因表達(dá),優(yōu)化控制各條代謝流的通量,方可實(shí)現(xiàn)對于產(chǎn)甲烷和甲烷轉(zhuǎn)化代謝效率的理想優(yōu)化。為解決無法從公共渠道獲得M.acetivorans的遺傳改造分子生物工具包的問題,可以嘗試?yán)皿w外合成的Cas9、sgRNA及DNA Donor共轉(zhuǎn)化的方式替代復(fù)雜的質(zhì)粒構(gòu)建過程來進(jìn)行古菌基因編輯,特別地,這一方法已成功應(yīng)用于真菌和酵母等細(xì)胞的遺傳改造。最后,為解決單一M.acetivorans細(xì)胞工廠穩(wěn)定性差、環(huán)境適應(yīng)能力弱的問題,可將M.acetivorans與其他微生物共培養(yǎng),構(gòu)建以M.acetivorans為中心的合成微生物群落,通過M.acetivorans與其他微生物的營養(yǎng)互營或種間電子傳遞過程,提升微生物組細(xì)胞工廠的穩(wěn)定性,緩解環(huán)境因子對于M.acetivorans自身代謝生長的負(fù)面影響,拓展M.acetivorans作為細(xì)胞工廠的應(yīng)用范圍。