孫冬雪，徐忠坤，高云佳*，殷洪梅，張慶英，屠鵬飛

1.北京大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191；2.北京華醫(yī)神農(nóng)醫(yī)藥科技有限公司，北京 102206；3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；4.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001；5.中藥提取精制新技術(shù)重點研究室，江蘇 連云港 222047

龍血通絡(luò)膠囊是以龍血竭酚類提取物單一投料制成的中成藥，具有活血化瘀通絡(luò)的功效，用于腦卒中恢復(fù)期血瘀證，癥見半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、脈弦或澀，療效顯著[1-5]。

目前，有關(guān)龍血通絡(luò)膠囊的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報道中有關(guān)指紋/特征圖譜和含量測定均采用高效液相色譜法（HPLC）[6-9]，含量測定多以7,4′-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B 為指標(biāo)性成分。HPLC 存在檢測時間長、分離效果不理想等缺點，為了能更加全面、高效、準(zhǔn)確地評價龍血通絡(luò)膠囊的質(zhì)量，本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）建立龍血通絡(luò)膠囊的特征圖譜，標(biāo)定11 個共有特征峰，并同時測定其中5 個成分的含量[10-11]，縮短了檢測時間，提高了色譜峰的分離度，全面優(yōu)化了龍血通絡(luò)膠囊的質(zhì)量控制方法。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BT25S型、BSA124S型、BSA2202S型電子天平（德國賽多利斯公司）；明澈-D型超純水一體化系統(tǒng)（德國默克密理博公司）。

1.2 試藥

龍血通絡(luò)膠囊由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，13 批樣品分別批號為201004、201005、201104、210101、210102、210201、210204、210301、210305、210401、210406、200501、200709，規(guī)格為0.33 g/粒，編號為S1～S13。

對照品7,4′-二羥基黃酮（批號：111787-201002，純度：98.6%）、龍血素A（批號：111660-200402，純度≥98%）、龍血素B（批號：111558-201407，純度：99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；龍血素C（批號：DST200319-261，純度≥98%）、4,4′-二羥基-2,6-二甲氧基二氫查耳酮（批號：DST220623-074，純度≥98%）均購自德斯特生物科技有限公司；紫檀芪（批號：PS2095-0050 MG，純度>98%）購自成都普思生物科技股份有限公司；7,4′-二羥基-5-甲氧基高異黃烷酮、3,4′-二羥基-5-甲氧基二苯乙烯均為實驗室分離制備，純度均≥98.0%；乙腈、甲醇均為色譜純；磷酸為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～18 min，24%～33%A；18～26 min，33%～37%A；26～40 min，37%～47%A）；柱溫為35 ℃；流速為0.5 mL·min-1；檢測波長為280 nm；進(jìn)樣體積為2 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取7,4′-二羥基黃酮、4,4′-二羥基-2,6-二甲氧基二氫查耳酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪對照品適量溶于甲醇中，配制成質(zhì)量濃度分別為50、60、120、80、90 μg·mL-1的混合對照品溶液A。再分別取龍血素C、7,4′-二羥基-5-甲氧基高異黃烷酮、3,4′-二羥基-5-甲氧基二苯乙烯對照品適量溶于甲醇中，配制成質(zhì)量濃度分別為20、50、40 μg·mL-1的對照品溶液B、C、D。

2.3 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，加75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 特征圖譜的建立及方法學(xué)驗證

2.4.1 精密度試驗 取樣品S12 按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖中各特征峰的保留時間，以9號峰（龍血素A）為參照峰，以各特征峰的相對保留時間的RSD 為考察指標(biāo)，結(jié)果均小于0.5%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取樣品S12 按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖中各特征峰的保留時間，以9號峰（龍血素A）為參照峰，以各共有峰的相對保留時間的RSD 為考察指標(biāo)，結(jié)果均小于0.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取樣品S12 共6 份，按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，記錄色譜圖中各特征峰的保留時間，以9 號峰（龍血素A）為參照峰，以各共有峰的相對保留時間的RSD為考察指標(biāo)，結(jié)果均小于0.5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 特征圖譜的建立 取13 批龍血通絡(luò)膠囊樣品（S1～S13），按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，記錄色譜圖和各特征峰的保留時間。

將13 批樣品的特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）軟件中，對13批龍血通絡(luò)膠囊樣品進(jìn)行分析，生成對照圖譜（圖1）。13 批龍血通絡(luò)膠囊樣品（S1～S13）的色譜與對照圖譜的相似度分別為0.999、0.999、0.994、0.999、0.998、0.995、0.995、0.988、0.991、0.992、0.999、0.985、0.975，均大于0.95，表明本品批間質(zhì)量一致性良好。

圖1 龍血通絡(luò)膠囊的UPLC特征圖譜

2.4.5 共有特征峰的指認(rèn) 取2.2 項下對照品溶液A、B、C、D，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。通過對照品的保留時間和紫外吸收對比，確定峰1為7,4′-二羥基黃酮、峰5為7,4′-二羥基-5-甲氧基高異黃烷酮、峰6為龍血素C、峰7為4,4′-二羥基-2,6-二甲氧基二氫查耳酮、峰8 為3,4′-二羥基-5-甲氧基二苯乙烯、峰9 為龍血素A、峰10 為龍血素B、峰11為紫檀芪（圖1）。

2.5 多成分的含量測定

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱取7,4′-二羥基黃酮、4,4′-二羥基-2,6-二甲氧基二氫查耳酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪對照品適量，分別加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.564 0、0.330 0、0.762 0、0.428 0、0.452 5 mg·mL-1的對照品儲備液。分別取5 個對照品儲備液，制備系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制線性回歸曲線。結(jié)果見表1。

表1 龍血通絡(luò)膠囊中5個成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.2 精密度試驗 取樣品S12 按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。7,4′-二羥基黃酮、4,4′-二羥基-2,6-二甲氧基二氫查耳酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪5 個成分峰面積的RSD 分別為0.07%、0.10%、0.22%、0.35%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取樣品S12 按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。7,4′-二羥基黃酮、4,4′-二羥基-2,6-二甲氧基二氫查耳酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪5個成分峰面積的RSD 分別為0.49%、0.16%、0.27%、0.40%、0.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取樣品S12 共6 份，按2.3 項下方法制備供試品溶液，再取2.2 項下混合對照品溶液A，按2.1 項下色譜條件測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)一點法計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，7,4′-二羥基黃酮、4,4′-二羥基-2,6-二甲氧基二氫查耳酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪5 個成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.11、6.80、15.00、8.63、9.26 mg·g-1，RSD分別為0.43%、0.49%、0.44%、0.59%、0.24%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（S12）約0.1 g，取9份，分別按1∶1.5、1∶1、1∶0.5加入7,4′-二羥基黃酮對照品溶液，按2.3項下方法制備不同質(zhì)量濃度的供試品溶液，每個質(zhì)量濃度平行制備3份，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率。參照上述操作，分別計算4,4′-二羥基-2,6-二甲氧基二氫查耳酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪的回收率，結(jié)果見表2。

表2 龍血通絡(luò)膠囊中5個成分的加樣回收率試驗結(jié)果

2.5.6 樣品檢測 取13 批龍血通絡(luò)膠囊樣品（S1～S13）按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)一點法計算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

表3 龍血通絡(luò)膠囊樣品中5個成分的含量測定結(jié)果mg/粒

3 討論

3.1 提取方式的優(yōu)化

本研究分別考察了供試品的樣品量（0.1、0.2、0.5 g）、提取方式（超聲、回流）、提取溶劑（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇）、提取時間（15、30、60 min）、提取溶劑體積（10、25、50 mL）對龍血通絡(luò)膠囊特征圖譜及含量測定的影響。綜合考慮各成分的提取率及操作簡便性，最終確定最佳供試品制備方法為取樣品約0.2 g，加75%甲醇25 mL，超聲30 min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究采用二極管陣列檢測器對龍血通絡(luò)膠囊樣品進(jìn)行光譜掃描（200～400 nm），各成分色譜峰在280 nm 下均有較好的吸收，故選擇280 nm 作為檢測波長。通過進(jìn)一步考察同一型號不同批次的色譜柱（Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱，150 mm×3.0 mm，2.7 μm，批號分別為S.N.USCFW05921、S.N.USCFW16967、S.N.USCFW17761）、流動相系統(tǒng)（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液）、柱溫（25、30、35 ℃）、流速（0.3、0.4、0.5 mL·min-1）、進(jìn)樣體積（1、2、3 μL）對特征圖譜和含量測定的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)色譜條件為Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，柱溫為35 ℃，流速為0.5 mL·min-1，檢測波長為280 nm，進(jìn)樣體積為2 μL 時，色譜信息較全面、各色譜峰峰形好、分離度較好。

3.3 結(jié)果分析

本研究采用UPLC 建立的龍血通絡(luò)膠囊的特征圖譜，在40 min 內(nèi)實現(xiàn)了特征峰的高效分離。分析13批龍血通絡(luò)膠囊樣品，從特征圖譜中標(biāo)定了11個共有特征峰，指認(rèn)了其中8 個特征峰，13 批樣品特征圖譜的相似度均大于0.95，說明本品批間質(zhì)量穩(wěn)定，一致性良好。在龍血通絡(luò)膠囊UPLC 特征圖譜基礎(chǔ)上，綜合考慮化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特征、含量和分離度，選擇其中5 個成分7,4′-二羥基黃酮、4,4′-二羥基-2,6-二甲氧基二氫查耳酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪作為含量測定指標(biāo)性成分。含量測定結(jié)果顯示5 個化學(xué)成分的含量分別為1.67～1.99、2.14～4.02、4.05～5.31、2.80～3.72、3.04～3.86 mg/粒。

本研究采用UPLC同時測定特征圖譜和5個特征成分的含量，縮短了檢測時間，提高了色譜峰的分離度，可用于對龍血通絡(luò)膠囊進(jìn)行全面、高效、準(zhǔn)確的質(zhì)量評價。