郭方圓 張方方 孫悅

摘 要：隨著對(duì)葡萄酒釀造過程中非釀酒酵母的不斷深入了解，人們對(duì)非釀酒酵母在葡萄酒釀造中帶來的特征性香氣口感越發(fā)重視，但對(duì)于不同的非釀酒酵母能帶來的香氣的研究還不夠深入，難以區(qū)分非釀酒酵母菌株。因此，本文介紹了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA法、傅里葉變換紅外吸收光譜法、串聯(lián)重復(fù)tRNA指紋圖譜法、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性法、微衛(wèi)星DNA標(biāo)記法等5種DNA分子標(biāo)記技術(shù)的方法和原理，同時(shí)探討了DNA分子標(biāo)記技術(shù)在國內(nèi)外非釀酒酵母菌株區(qū)分中的應(yīng)用狀況與前景。

關(guān)鍵詞：非釀酒酵母菌株；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA法；傅里葉變換紅外吸收光譜法；串聯(lián)重復(fù)tRNA指紋圖譜法；擴(kuò)增片段長度多態(tài)性法

Research Progress in the Identification Technology of Non-Saccharomyces cerevisiae Strains

GUO Fangyuan1， ZHANG Fangfang2， SUN Yue1

（1.School of Food and Wine， Ningxia University， Yinchuan 750021， China; 2.Angel Yeast Co.， Ltd.， Hubei Key Laboratory of Yeast Function， Yichang 443000， China）

Abstract： With the continuous in-depth understanding of non-Saccharomyces cerevisiae in the process of wine brewing， people pay more attention to the characteristic aroma and taste of non-Saccharomyces cerevisiae in wine brewing， but the research on the aroma that different non-Saccharomyces cerevisiae can bring is not deep enough， and it is difficult to distinguish non-Saccharomyces cerevisiae strains. Therefore， this paper introduces the methods and principles of five DNA molecular marker technologies， including random amplified polymorphic DNA， Fourier transform infrared spectroscopy， tandem repeat-tRNA fingerprint， amplified fragment length polymorphism， and microsatellite DNA method. At the same time， it discusses the application status and prospects of DNA molecular marker technology in the differentiation of non-Saccharomyces cerevisiae strains at home and abroad.

Keywords： non-Saccharomyces cerevisiae strains; random amplified polymorphic DNA; Fourier transform infrared spectroscopy; tandem repeat-tRNA fingerprinting method; amplified fragment length polymorphism

在葡萄酒釀造過程中，酵母影響葡萄酒的風(fēng)味，其中非釀酒酵母被越來越多的研究者所重視。不同地域葡萄酒的獨(dú)特口感和香氣差別主要源于各地區(qū)獨(dú)特的非釀酒酵母。因此，找到區(qū)分不同非釀酒酵母菌株的鑒別方法，確定相應(yīng)的非釀酒種屬，可為研究各類非釀酒酵母的理化特性和提升葡萄酒釀造水平打下基礎(chǔ)。本文通過介紹幾種DNA分子標(biāo)記方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)，探討其在非釀酒酵母菌株區(qū)分中的應(yīng)用狀況與前景。

1 RAPD標(biāo)記法

1.1 RAPD技術(shù)在非釀酒酵母菌株區(qū)分中的應(yīng)用

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA法（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）是一種DNA多態(tài)性檢測技術(shù)。RAPD的原理是以不同菌株的基因組DNA為模板，采用隨機(jī)的寡聚核苷酸為引物，在熱穩(wěn)定DNA多聚酶的作用下，對(duì)基因組PCR擴(kuò)增，可以檢測到整個(gè)基因組的DNA，顯示出不同菌株之間的差異。

LOPANDIC等[1]用RAPD技術(shù)對(duì)Metschnikowia的10個(gè)種進(jìn)行研究，RAPD-PCR指紋圖譜支持了該屬在種水平的分離。李冬梅等[2]以RAPD技術(shù)可以明確鑒別Candida albicans和Candida tropicalis種內(nèi)差異。徐勇等[3]采用RAPD技術(shù)成功對(duì)Candida sp、Pachysolen tanophilu、Pichi stipit不同種進(jìn)行區(qū)分。

1.2 RAPD優(yōu)缺點(diǎn)

RAPD技術(shù)簡單且效率高，短時(shí)間內(nèi)可獲得大量DNA多態(tài)性片段。該技術(shù)在特異性方面表現(xiàn)突出，可檢測到單個(gè)堿基的置換；在反應(yīng)引物方面，無須專門設(shè)計(jì)相關(guān)引物就可以使用；在購買成本方面，由于使用量少，成本較為低廉。此外，RAPD技術(shù)可以直接對(duì)所檢測的DNA多態(tài)性進(jìn)行分析。但RAPD技術(shù)復(fù)性溫度低、特異性較低、PCR循環(huán)次數(shù)因引物濃度不同而不同和基因組DNA復(fù)雜等，因而重復(fù)性較低，易受外界DNA污染的干擾。此外，引物的篩選和反應(yīng)條件的優(yōu)化往往也需要花費(fèi)較多的時(shí)間。

2 FT-IR法

2.1 FT-IR在非釀酒酵母菌株區(qū)分中的應(yīng)用

傅里葉變換紅外吸收光譜學(xué)（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)T-IR）于20世紀(jì)90年代開發(fā)，用于微生物的鑒定和表征，其工作原理是紅外輻射由光源發(fā)射，并通過干涉儀穿過樣品，產(chǎn)生干涉條紋?！案缮鎴D”由探測器記錄為信號(hào)，然后將其放大，最后將其傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中，在計(jì)算機(jī)中執(zhí)行傅里葉變換并將干涉圖轉(zhuǎn)換為光譜。

GRANGETEAU等[4]使用FT-IR技術(shù)從58株Candida. zemplinina分離株中鑒定出19株不同菌株。宋雅迪等[5]采用FT-IR技術(shù)對(duì)6種高滲酵母（Saccharomyces cerevisiae、Meyerozyma caribbica、Wickerhamomyces anomalus、Torulaspora delbrueckii、Crytococcus magnus、Sporobolomyces roseus）進(jìn)行分類。

2.2 FT-IR優(yōu)缺點(diǎn)

FT-IR光譜的優(yōu)點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)速度快，易于使用，對(duì)所測樣品沒有損傷，不產(chǎn)生污染；光譜質(zhì)量高，通透性好，靈敏度高；對(duì)所有微生物具有普遍適用性，應(yīng)用范圍廣；光譜掃描范圍寬；具有表征非酵母種內(nèi)生物多樣性的能力和鑒別許多菌株的可能性。但光譜相對(duì)較敏感，易受到外界環(huán)境和實(shí)驗(yàn)儀器的影響，在進(jìn)行相關(guān)定性分析時(shí)，會(huì)有相應(yīng)的限制，影響了FT-IR光譜的應(yīng)用范圍和應(yīng)用領(lǐng)域。

3 TRtRNA指紋圖譜法

3.1 TRtRNA指紋圖譜法在非釀酒酵母菌株區(qū)分中的應(yīng)用

串聯(lián)重復(fù)tRNA（Tandem Repeat-tRNA，TRtRNA）指紋圖譜法考慮到串聯(lián)重復(fù)序列隨機(jī)分散在所有真核生物基因組中，tRNA基因保守且存在于不同染色體中的幾個(gè)拷貝基因中，這是基于串聯(lián)重復(fù)序列的不同寡核苷酸與基于保守tRNA區(qū)域的第二個(gè)寡核苷酸相結(jié)合的方法。

BARQUET等[6]通過TRtRNA指紋圖譜法實(shí)現(xiàn)了H. vineae、H. uvarum和H. opuntiae種間和種內(nèi)差異性分析。田進(jìn)等[7]采用TRtRNA指紋圖譜法研究118株野生有孢漢遜酵母屬酵母菌，測出該屬種內(nèi)差異。王春曉等[8]采用26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列分析方法將59株酵母菌鑒定為6個(gè)酵母菌種，并采用串聯(lián)重復(fù)tRNA指紋圖譜法展示了17個(gè)基因型。

3.2 TRtRNA指紋圖譜法優(yōu)缺點(diǎn)

TRtRNA指紋圖譜法流程相對(duì)簡單，整體流程可重復(fù)，對(duì)非釀酒酵母具備較高的鑒別能力；相對(duì)于擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）技術(shù)，TRtRNA指紋圖譜法對(duì)DNA的質(zhì)量和數(shù)量的要求低，技術(shù)相較而言更為簡單。但tRNA基因隨機(jī)分散，單獨(dú)使用串聯(lián)重復(fù)序列基因?qū)Ψ轻劸平湍傅蔫b定能力較低。同時(shí)，某些菌株的TRtRNA指紋圖譜單一，未展現(xiàn)TRtRNA指紋圖譜差異。

4 AFLP法

4.1 AFLP在非釀酒酵母菌株區(qū)分中的應(yīng)用

AFLP是一種基于聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增檢測基因組限制性片段的高分辨基因分型工具。通常在變性聚丙烯酰胺凝膠上擴(kuò)增和檢測50～100個(gè)限制性酶切片段。ESTEVE-ZARZOSO等[9]采用AFLP技術(shù)從一次自發(fā)發(fā)酵中分離出180個(gè)菌落，H uvarum分為11種不同的菌株，H vineae分為6種不同的菌株：C zemplinina分為4種不同的菌株。ALBERTIN等[10]采用AFLP技術(shù)對(duì)47株H. uvarum進(jìn)行研究，結(jié)果表明AFLP可以有效進(jìn)行H. uvarum菌株水平的差異分析。

4.2 AFLP的優(yōu)缺點(diǎn)

AFLP方法已被證明對(duì)酵母基因分型非常有用。與大多數(shù)其他分型技術(shù)相比，該技術(shù)更具鑒別性、多態(tài)性、可重復(fù)性和可靠性。在一個(gè)泳道中揭示許多多態(tài)性條帶的能力是AFLP標(biāo)記的主要優(yōu)點(diǎn)，且能同時(shí)分析凝膠上的許多條帶，使得AFLP非常高效。該方法顯示出較高的鑒別能力和良好的再現(xiàn)性，其能在物種和菌株水平上進(jìn)行有效鑒別。然而，該技術(shù)的缺點(diǎn)是非常費(fèi)力，片段分離需要大型、高度復(fù)雜的聚丙烯酰胺凝膠或自動(dòng)測序儀，數(shù)據(jù)也難以進(jìn)行相關(guān)分析處理，需應(yīng)用復(fù)雜的生物信息學(xué)程序，這些特征限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。

5 微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記法

5.1 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在非釀酒酵母菌株區(qū)分中的應(yīng)用

微衛(wèi)星指“短DNA序列的重復(fù)”，根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端的互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，根據(jù)分離片段的多態(tài)性區(qū)分不同的菌株。ALBERTIN等[11]使用微衛(wèi)星分型技術(shù)對(duì)Brettanomyces bruxellensis菌株進(jìn)行遺傳分析，區(qū)分鑒定了18株中的13株。ALBERTIN等[12]通過開發(fā)8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)110株菌株進(jìn)行基因分型，110株供試菌株均顯示獨(dú)特的基因型。汪國慶等[13]使用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)50株熱帶假絲酵母菌（Candida tropicalis）進(jìn)行鑒定，經(jīng)重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)（Repetitive Extragenic Palindromic Polymerase Chain Reaction，REP-PCR）分型共得到7種REP-PCR型。

5.2 微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)

微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有高重復(fù)性、多等位性、共顯性遺傳、廣泛的基因組覆蓋率、染色體特異性和PCR自動(dòng)檢測等特點(diǎn)，微衛(wèi)星工具具有便攜性，可以比較不同實(shí)驗(yàn)室的基因分型。微衛(wèi)星具有高變異性，易于PCR擴(kuò)增和解釋，常用于區(qū)分分離株的標(biāo)記物；其拷貝數(shù)在個(gè)體間呈現(xiàn)高度變異，已成為基因組遺傳圖譜和物理圖譜的理想界標(biāo)，廣泛應(yīng)用于分析遺傳多樣性、確定品種間親緣關(guān)系、個(gè)體識(shí)別等。

微衛(wèi)星技術(shù)也有一定的不足：SSR位點(diǎn)的突變率高，對(duì)環(huán)境敏感；SSR能夠進(jìn)行標(biāo)記的位點(diǎn)有限，無法做到對(duì)功能基因全部標(biāo)記，無法建立起成體系的遺傳關(guān)系圖譜；操作復(fù)雜，過程煩瑣；SSR引物成本高，需進(jìn)行大量開發(fā)和合成才能滿足相關(guān)實(shí)驗(yàn)需要；在進(jìn)行測序凝膠時(shí)，會(huì)自動(dòng)確定長度，因此會(huì)與真正的測序長度有差異，對(duì)堿基序列造成缺失等相關(guān)誤差。

6 展望

隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展和新型儀器設(shè)備的應(yīng)用，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在不斷發(fā)展和更新。相對(duì)于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒別和現(xiàn)代生理生化分析技術(shù)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)因其多樣性和準(zhǔn)確性被越來越多地應(yīng)用于非釀酒酵母菌的鑒定。

鑒于幾種DNA分子標(biāo)記技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)，其廣泛適用性相對(duì)較差，不能以某一種技術(shù)區(qū)分所有的非釀酒酵母。因此，除部分非釀酒酵母可以被單一技術(shù)鑒別外，大部分非釀酒酵母的鑒別都需要使用不同的技術(shù)進(jìn)行嘗試，或結(jié)合兩種及兩種以上的方法，需要不同的序列分析等多個(gè)指標(biāo)綜合分析，才能獲得正確結(jié)論。因此，對(duì)于非釀酒酵母的DNA鑒定方法，過程簡單化、流程自動(dòng)化、發(fā)展商業(yè)化是未來DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展核心。雖然國內(nèi)在非釀酒酵母遺傳多樣性方面的研究還相對(duì)較少，但可以預(yù)見，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在葡萄酒非釀酒酵母菌種的分類鑒定有著非常廣闊的研究前景，在酵母菌株區(qū)分、菌種的鑒定、遺傳多樣性研究方面將發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)

[1]LOPANDIC K，PRILLINGER H，MOLN?R O，et al.

Molecular characterization and genotypic identification of Metschnikowia species[J].Systematic and Applied Microbiology，

1996，19（3）：339-402.

[2]李冬梅，王端禮，李世蔭，等.致病酵母菌基因組多態(tài)性及親緣關(guān)系的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，1997（2）：135-141.

[3]徐勇，張博，勇強(qiáng)，等.利用RAPD分子標(biāo)記研究酵母菌的親緣關(guān)系[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2005（1）：1-4.

[4]GRANGETEAU C，GERHARDS D，TERRAT S，

et al.FT-IR spectroscopy： a powerful tool for studying the inter-and intraspecific biodiversity of cultivable non-Saccharomyces yeasts isolated from grape must[J].Journal of Microbiological Methods，2016，121：50-58.

[5]宋雅迪，袁亞宏，岳田利，等.基于紅外光譜技術(shù)的高滲酵母快速鑒別方法[J].中國食品學(xué)報(bào)，2016，16（11）：212-220.

[6]BARQUET M，MART?N V，MEDINA K，et al.Tandem repeat-tRNA （TRtRNA） PCR method for the molecular typing of non-Saccharomyces subspecies[J].Applied Microbiology and

Biotechnology，2011，93（2）：807-814.

[7]田進(jìn)，吳成，楊金仙，等.葡萄酒有孢漢遜酵母屬分子指紋圖譜分析[J].菌物學(xué)報(bào)，2020，39（4）：755-765.

[8]王春曉，何宇淋，唐佳代，等.貴州傳統(tǒng)小曲酵母菌分子指紋圖譜分析[J].食品科學(xué)，2023，44（2）：

165-172.

[9]ESTEVE-ZARZOSO B，HIERRO N，MAS A，et al.A new simplified AFLP method for wine yeast strain typing[J].LWT-Food Science and Technology，2010，43（10）：1480-1484.

[10]ALBERTIN W，CHASSERIAUD L，COMTE G，

et al.Winemaking and bioprocesses strongly shaped the genetic diversity of the ubiquitous yeast Torulaspora delbrueckii[J].PloS One，2014，9（4）：e94246.

[11]ALBERTIN W，PANFILI A，MIOT-SERTIER C，

et al.Development of microsatellite markers for the rapid and reliable genotyping of Brettanomyces bruxellensis at strain level[J].Food Microbiology，2014，42：188-195.

[12]ALBERTIN W，SETATI M E，MIOT-SERTIER C，

et al.Hanseniaspora uvarum from winemaking environments show spatial and temporal genetic clustering[J].Frontiers in Microbiology，2016，6：1569.

[13]汪國慶，李貞，彭奕冰.微衛(wèi)星多態(tài)性和重復(fù)序列PCR分析技術(shù)在熱帶假絲酵母菌基因分型中的應(yīng)用[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2019，18（1）：77-81.