李得萍 陳一鳴 何遠(yuǎn)秦 董洪雨 易元惠 劉艷軍

摘要：為優(yōu)化鐵皮石斛一步成苗培養(yǎng)條件，文章通過正交試驗(yàn)研究培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基用量、接種材料株高以及接種密度4個(gè)因素對鐵皮石斛組培苗生長的影響，篩選出最適宜鐵皮石斛組培苗一步成苗的培養(yǎng)組合；研究鐵皮石斛組培苗一步成苗過程中添加激素和活性炭對植株生長的影響，篩選確定鐵皮石斛組培苗一步成苗的最優(yōu)培養(yǎng)組合。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)容器是影響鐵皮石斛組培苗一步成苗生長的主要影響因素，培養(yǎng)基用量、接種材料株高以及接種密度3個(gè)因素分別對鐵皮石斛組培苗的不同生長指標(biāo)產(chǎn)生影響；基本培養(yǎng)基中添加激素對鐵皮石斛組培苗一步成苗的效果較好，優(yōu)于對照（CK）基本培養(yǎng)基；一步成苗培養(yǎng)基中添加活性炭的效果低于對照（CK）一步成苗培養(yǎng)基。試驗(yàn)確定鐵皮石斛組培苗一步成苗的最優(yōu)培養(yǎng)組合為：培養(yǎng)容器240 mL、培養(yǎng)基用量40 mL、接種材料株高

1.2 cm、接種密度4芽·瓶-1，培養(yǎng)120 d后鐵皮石斛組培苗的分蘗量為6.55個(gè)，符合出苗標(biāo)準(zhǔn)的合格率為93.67%。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；正交試驗(yàn)；接種密度；活性炭：一步成苗

中圖分類號：R284

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

鐵皮石斛為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是十大仙草之首，因其具有極高的藥用價(jià)值而被開發(fā)利用[1]。石斛屬種子細(xì)小入微，沒有胚乳，在自然條件下很難自然萌發(fā)增殖，主要繁殖方式為分株、扦插等[2]，繁殖速度較慢，培養(yǎng)周期長，產(chǎn)量不高。因此，為加快鐵皮石斛的繁殖速度以及保護(hù)瀕危物種，通常采用組織培養(yǎng)來解決這一難題[3-4]。近年來，關(guān)于鐵皮石斛的組培快繁研究較多，也建立了相應(yīng)的快繁體系[5-6]。由于人工成本越來越高，相應(yīng)的組培苗成本也逐漸提高，從而導(dǎo)致石斛生產(chǎn)成本上漲，種植效益降低，降低組培苗的生產(chǎn)成本成為發(fā)展石斛組培快繁的有效途徑。本試驗(yàn)采用鐵皮石斛的組培苗為試驗(yàn)材料，通過對影響鐵皮石斛一步成苗的培養(yǎng)組合進(jìn)行篩選優(yōu)化，建立鐵皮石斛一步成苗組培快繁體系，為工廠化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、低成本和遺傳穩(wěn)定的石斛蘭種苗、為石斛快繁技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1? ?試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

鐵皮石斛組培苗：由天津農(nóng)學(xué)院東校區(qū)組培室提供。

供試試劑：活性炭（AC）、生長素NAA（1-萘乙酸）、MS培養(yǎng)基、水解乳蛋白（LH）等試劑均由天津農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究培養(yǎng)容器類型、培養(yǎng)基用量、接種材料株高以及接種密度對鐵皮石斛組培苗一步成苗的影響，篩選出適宜鐵皮石斛一步成苗的培養(yǎng)組合。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合見表2。

上述培養(yǎng)基均為1/2MS+0.1 g·L-1 LH（水解乳蛋白）+0.2 mg·L-1 NAA+25 g·L-1蔗糖。將生長一致的鐵皮石斛組培苗接種到培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種15瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)120 d 后，調(diào)查鐵皮石斛株高、莖粗、生根數(shù)、葉片數(shù)等生長情況。

1.2 基本培養(yǎng)基添加激素對鐵皮石斛組培苗一步

成苗的影響

試驗(yàn)設(shè)2個(gè)培養(yǎng)基處理，即基本培養(yǎng)基添加激素（1/2MS+0.1 g·L-1LH +0.2 mg·L-1 NAA+25 g·L-1蔗糖）和基本培養(yǎng)基（1/2MS+0.1 g·L-1 LH+25 g·L-1蔗糖）。將生長一致、株高0.8 cm的鐵皮石斛組培苗分別接種到上述2個(gè)培養(yǎng)基中，120 d后調(diào)查鐵皮石斛株高、莖粗、葉片數(shù)、生根量、分蘗量等生長情況。

1.3 基本培養(yǎng)基添加活性炭對鐵皮石斛組培苗

一步成苗的影響

1.3.1 基本培養(yǎng)基添加不同數(shù)量活性炭對鐵皮石斛組培苗生長的影響 試驗(yàn)設(shè)6個(gè)培養(yǎng)基處理，即以1/2MS基本培養(yǎng)基為對照（CK），其他5個(gè)處理為在1/2MS基本培養(yǎng)基中分別添加0.1、0.25、0.5、0.75、1 g·L-1的活性炭。將生長一致、株高0.8 cm的鐵皮石斛組培苗分別接種到上述6個(gè)培養(yǎng)基中，45 d后調(diào)查鐵皮石斛株高、莖粗、生根量、分蘗量等生長情況。

1.3.2 一步成苗培養(yǎng)基添加活性炭對鐵皮石斛組培苗生長的影響 試驗(yàn)設(shè)2個(gè)培養(yǎng)基處理，即以一步成苗培養(yǎng)基（1/2MS+0.1 g·L-1 LH+0.1 mg·L-1 NAA）為對照（CK），另一處理為根據(jù)1.3.1的試驗(yàn)結(jié)果，將效果較好的活性炭（濃度為0.25 g·L-1）添加到一步成苗培養(yǎng)基中。將生長一致、株高0.8 cm的鐵皮石斛組培苗接種到上述2個(gè)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)120 d后調(diào)查鐵皮石斛莖粗、株高、生根量、分蘗量等生長情況。

1.4? ?鐵皮石斛組培苗一步成苗優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)，將結(jié)果較好的處理組合2（A1B2C2D3）、處理組合3（A1B3C3D2）和處理組合6（A2B3C1D3）以及最優(yōu)處理組合（A1B2C1D2）進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，培養(yǎng)120 d后調(diào)查符合鐵皮石斛出苗標(biāo)準(zhǔn)的合格率、植株分蘗量等生長情況。

根據(jù)浙江省發(fā)布的鐵皮石斛組培苗出苗標(biāo)準(zhǔn)，用于栽培的鐵皮石斛苗應(yīng)為非污染、無爛莖、無爛根、無黃葉；葉片4片以上，正常展開，葉色呈嫩綠或翠綠，根條數(shù)2～3條，株高≥2.5 cm，莖粗≥0.2 cm；合格苗應(yīng)在總量的80%以上。

1.5? ?培養(yǎng)條件

試驗(yàn)于2022年3—7月在天津農(nóng)學(xué)院組培室進(jìn)行，試驗(yàn)基本培養(yǎng)基為1/2MS，蔗糖含量25 g·L-1、瓊脂含量6.6 g·L-1，pH 5.8～6.0，培養(yǎng)溫度28 ℃～30 ℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，連續(xù)照明培養(yǎng)。

1.6? ?數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性比較、極差處理和方差分析。

分蘗量 = 總植株數(shù)

接種植株數(shù)

出苗合格率（%） = 符合出苗標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)量 ×100

總植株數(shù)

2? 結(jié)果與分析

2.1? ?正交試驗(yàn)對鐵皮石斛組培苗的影響

2.1.1 正交試驗(yàn)對鐵皮石斛一步成苗的影響 由表3和圖1可見，處理組合3（A1B3C3D2），即培養(yǎng)容器為240 mL培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基用量60 mL、接種材料株高1.2 cm、接種密度4個(gè)芽·瓶-1對鐵皮石斛組培苗的培養(yǎng)效果較好，植株平均莖粗2.95 mm、株高2.98 cm、生根量3.98條、葉片數(shù)5片，植株長勢良好，葉片大且顏色深綠，分蘗多。

處理組合6（A2B3C1D3），即培養(yǎng)容器為350 mL培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基用量60 mL、接種材料株高0.5 cm、接種密度6個(gè)芽·瓶-1，植株平均莖粗2.83 mm、株高2.91 cm、生根量4.13條、葉片數(shù)4.68片，植株長勢好，葉大莖粗，分蘗多。處理組合7（A3B1C3D3）培養(yǎng)效果較差，即培養(yǎng)容器為650 mL培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基用量20 mL、接種材料株高1.2 cm、接種密度6個(gè)芽·瓶-1的鐵皮石斛各項(xiàng)生長指標(biāo)較差，植株長勢老弱，分蘗少。

2.1.2 正交試驗(yàn)對鐵皮石斛組培苗植株形狀的影響 因素A即培養(yǎng)容器類型對鐵皮石斛組培苗莖粗、生根量、葉片數(shù)影響較大，R值均為最高；因素B即培養(yǎng)基用量對鐵皮石斛組培苗生根量和葉片數(shù)的影響較小，R值均最?。灰蛩谻即接種材料大小對鐵皮石斛組培苗株高的影響較大，R值最高；D因素即接種密度對鐵皮石斛組培苗莖粗和株高的影響較小，R值最?。ū?）。由此可見，影響鐵皮石斛組培苗莖粗和株高的因素排序?yàn)镃>A>B>D，影響鐵皮石斛組培苗生根量和葉片數(shù)的因素排序?yàn)锳>C>D>B。整體而言，A因素即培養(yǎng)基容器類型對鐵皮石斛組培苗莖粗、株高、生根量、葉片數(shù)的影響最大。

通過比較各因素的均值得知（表4），鐵皮石斛組培苗莖粗在A因素下以k1值最大，即A因素的優(yōu)水平為培養(yǎng)容器240 mL；同理，B因素的優(yōu)水平為培養(yǎng)基用量40 mL，C因素的優(yōu)水平為接種材料株高0.5 cm，D因素的優(yōu)水平為4個(gè)芽·瓶-1，即鐵皮石斛正交試驗(yàn)的最優(yōu)培養(yǎng)組合為A1B2C1D2。同理，可以推斷出鐵皮石斛組培苗株高的最優(yōu)培養(yǎng)組合為A1B3C2D2，生根量的最優(yōu)培養(yǎng)組合為A1B2C1D2，葉片數(shù)的最優(yōu)培養(yǎng)組合為A1B2C3D3。綜合考慮鐵皮石斛的植株性狀，應(yīng)以處理組合A1B2C1D2效果最好，但由于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種均一性設(shè)計(jì)，不可能覆蓋所有的處理組合，因此最優(yōu)組合A1B2C1D2在試驗(yàn)中沒有顯現(xiàn)出來。

2.1.3 正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果 由表5可知，A（容器類型）、B（培養(yǎng)基用量）、D（接種密度）對鐵皮石斛組培苗莖粗、株高、生根量、葉片數(shù)的影響較大，均達(dá)到極顯著水平；C（接種材料株高）對鐵皮石斛組培苗莖粗、生根量、葉片數(shù)的作用也達(dá)到極顯著水平，但對鐵皮石斛組培苗的株高影響較小，差異不顯著。通過各項(xiàng)指標(biāo)的F值比較得出，在株高、莖粗、葉片數(shù)、生根量這4個(gè)鐵皮石斛植株形狀指標(biāo)中，A因素作用最大，其次為C因素，主要影響鐵皮石斛的莖粗和葉片數(shù)，D因素主要影響鐵皮石斛的株高和生根量，B因素對鐵皮石斛植株各項(xiàng)生長指標(biāo)影響較小。

綜上所述，鐵皮石斛一步成苗最優(yōu)的培養(yǎng)組合為A1B2C1D2，即培養(yǎng)容器240 mL+培養(yǎng)基用量40 mL+接種材料株高0.5 cm+接種密度4個(gè)芽·瓶-1為鐵皮石斛一步成苗的最優(yōu)培養(yǎng)組合。

2.2? ?基本培養(yǎng)基添加激素對鐵皮石斛組培苗一步

成苗的影響

基本培養(yǎng)基是否添加激素NAA對鐵皮石斛的株高、葉片數(shù)、生根量無顯著影響，但對鐵皮石斛的莖粗影響極顯著，對鐵皮石斛的分蘗量影響達(dá)顯著水平（圖2和圖3、表6）。圖2中對照

（CK）為一步成苗基本培養(yǎng)基，V為一步成苗基本培養(yǎng)基添加激素NAA?；九囵B(yǎng)基添加NAA處理的鐵皮石斛植株各項(xiàng)生長指標(biāo)均高于對照（CK），培養(yǎng)120 d后植株株高達(dá)到2.38 cm、莖粗2.5 mm、生根量4.34條、分蘗量5.12個(gè)，植株長勢好，葉片寬大，根較長。

2.3? ?基本培養(yǎng)基添加活性炭對鐵皮石斛組培苗一

步成苗的影響

2.3.1 添加不同數(shù)量活性炭對鐵皮石斛組培苗的影響 由圖4可見，當(dāng)基本培養(yǎng)基添加活性炭濃度為0.25 g·L-1時(shí)，鐵皮石斛的平均株高和莖粗與添加0.5 g·L-1活性炭時(shí)差異不顯著，但均顯著高于其他活性炭濃度處理和對照（CK）處理。鐵皮石斛組培苗的生根量在基本培養(yǎng)基添加0.25 g·L-1活性炭時(shí)，顯著高于其他處理的生根量，但植株的分蘗量在此濃度下與對照（CK）差異不顯著，其他活性炭濃度處理的鐵皮石斛組培苗的分蘗量均與對照（CK）差異不顯著。鐵皮石斛組培苗的生根量在添加0.25 g·L-1活性炭時(shí)，顯著高于對照（CK）及其他濃度活性炭處理，且當(dāng)添加的活性炭濃度超過0.5 mg·L-1時(shí)，鐵皮石斛組培苗基本沒有生根量，因此可以得出，添加過高的活性炭濃度可能對鐵皮石斛組培苗的生根起到抑制作用。綜上所述，基本培養(yǎng)基中添加0.25 g·L-1活性炭對鐵皮石斛組培苗的生長具有促進(jìn)作用，培養(yǎng)45 d后鐵皮石斛組培苗平均株高1.29 cm、莖粗2.62 mm、分蘗量2.5個(gè)、生根量2.75條，植株長勢好，葉片大且顏色深綠。

2.3.2 一步成苗培養(yǎng)基添加活性炭對鐵皮石斛組培苗的影響 一步成苗培養(yǎng)基對照（CK）和一步成苗培養(yǎng)基添加0.25 g·L-1活性炭（V）對鐵皮石斛組培苗的株高、莖粗沒有顯著影響，但植株的生根量和分蘗量對照（CK）處理明顯優(yōu)于添加活性炭的處理（圖5和表7）。在一步成苗培養(yǎng)基中添加活性炭，培養(yǎng)120 d后鐵皮石斛組培苗平均株高2.4 cm、莖粗2.48 mm、生根量1.96條、分蘗量3.21個(gè)，長勢很弱，基部葉片腐爛，葉片淡綠，葉尖變白。表明一步成苗培養(yǎng)基添加活性炭不利于鐵皮石斛組培苗生長，抑制植株生根和分蘗。

從植株長勢看，一步成苗培養(yǎng)基中添加活性炭后鐵皮石斛組培苗的長勢極弱（圖6），表明一步成苗培養(yǎng)基添加活性炭對鐵皮石斛組培苗生根和分蘗產(chǎn)生了抑制作用。

2.4? ?鐵皮石斛組培苗一步成苗優(yōu)化試驗(yàn)

由表8可見，處理組合3（A1B3C3D2）與處理組合A1B2C1D2的鐵皮石斛組培苗分蘗量以及符合出苗標(biāo)準(zhǔn)的合格率均無顯著差異，分蘗量顯著高于處理組合6（A2B3C1D3），出苗合格率顯著高于處理組合2（A1B2C2D3）。4個(gè)處理組合中，處理組合2（A1B2C2D3）顯著低于其他處理，植株長勢雖然較好，但基部有大量的叢生芽，符合出苗標(biāo)準(zhǔn)的合格率僅為56.16%；處理組合6（A2B3C1D3）植株長勢較好，葉片較大，莖粗較粗，但植株的分蘗量顯著小于處理組合3（A1B2C3D2）和最優(yōu)處理組合A1B2C1D2。

試驗(yàn)表明，處理組合3（A1B2C3D2）和最優(yōu)處理組合A1B2C1D2均適合鐵皮石斛一步成苗的培養(yǎng)條件，但處理組合3（A1B3C3D2）效果更突出，即培養(yǎng)容器為240 mL培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基用量60 mL、接種材料株高1.2 cm、接種密度4個(gè)芽·瓶-1，更適合鐵皮石斛一步成苗生長，培養(yǎng)120 d后植株分蘗量為6.55個(gè)，達(dá)到出苗標(biāo)準(zhǔn)的合格率為93.67%（表8）。

3? 結(jié)論與討論

關(guān)于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)一步成苗的研究頗多，但大多數(shù)研究都與培養(yǎng)基的研究以及外植體的選擇有關(guān)[7-8]。本試驗(yàn)選用鐵皮石斛種子萌發(fā)出的微型芽（組培苗）為試驗(yàn)材料，通過培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基用量、接種材料株高以及接種密度4個(gè)因素3個(gè)水平的正交試驗(yàn)，篩選出最佳鐵皮石斛組培苗的培養(yǎng)組合，結(jié)果顯示培養(yǎng)容器是影響鐵皮石斛組培苗生長的主要因素，這一結(jié)論符合植物生長規(guī)律。培養(yǎng)容器空間大，植物呼吸釋放的CO2較多；培養(yǎng)容器較小，吸入外界O2少，氣體交換量少，而植株吸收CO2過多將導(dǎo)致植株生長不良，因此選用的培養(yǎng)容器為240 mL培養(yǎng)瓶效果較好。培養(yǎng)基用量影響鐵皮石斛組培苗的生長，培養(yǎng)基用量不足會(huì)導(dǎo)致鐵皮石斛組培苗營養(yǎng)不良，培養(yǎng)基用量過多將導(dǎo)致培養(yǎng)濕度過大，不利于鐵皮石斛的生長，也造成資源浪費(fèi)。培養(yǎng)基用量與培養(yǎng)容器大小有關(guān)，本試驗(yàn)顯示培養(yǎng)容器240 mL適合培養(yǎng)基用量40 mL，培養(yǎng)容器

350 mL適合培養(yǎng)基用量60 mL。試驗(yàn)顯示，接種材料大小對鐵皮石斛組培苗的生長沒有顯著影響，這可能由于鐵皮石斛自身生長能力較強(qiáng)，一步成苗培養(yǎng)時(shí)間較長，后期植株停滯生長。接種密度影響鐵皮石斛組培苗的分蘗能力以及生長性能，密度過高，植株吸收的營養(yǎng)和O2較少，長勢較弱。因鐵皮石斛植株為叢生形態(tài)，密度過低不利于植株生長。試驗(yàn)表明，培養(yǎng)容器240 mL適宜的接種密度為4個(gè)芽·瓶-1，培養(yǎng)容器350 mL

適宜的接種密度為6個(gè)芽·瓶-1。

試驗(yàn)表明，鐵皮石斛一步成苗過程中添加激素的生長效果優(yōu)于對照（CK）；基本培養(yǎng)基中添加0.25 g·L-1活性炭對鐵皮石斛組培苗的生長有明顯的促進(jìn)作用，但將同樣濃度的活性炭添加到一步成苗培養(yǎng)基（1/2MS+0.1 g·L-1 LH+0.2 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖）中培養(yǎng)120 d后，鐵皮石斛組培苗長勢較弱，葉片變白，極少生根，表明一步成苗培養(yǎng)基添加活性炭對鐵皮石斛組培苗產(chǎn)生抑制，這一結(jié)論與許多學(xué)者研究不一致[9-10]，這可能是由于所選鐵皮石斛組培苗外植體的狀態(tài)不同。本試驗(yàn)所選的鐵皮石斛微型芽體內(nèi)所含的內(nèi)生菌較少，添加活性炭后吸收過多的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分，導(dǎo)致植株吸收營養(yǎng)不足而長勢較弱。

本試驗(yàn)得出，鐵皮石斛組培苗一步成苗的優(yōu)化培養(yǎng)條件為培養(yǎng)容器240 mL、培養(yǎng)基用量40 mL、接種材料株高1.2 cm、接種密度4個(gè)芽·瓶-1，需添加激素，不添加活性炭。培養(yǎng)120 d后，鐵皮石斛組培苗分蘗量為6.55個(gè)，符合出苗標(biāo)準(zhǔn)的合格率為93.67%。

參考文獻(xiàn)

[1]王治丹，代云飛，羅尚娟，等．鐵皮石斛化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J]．華西藥學(xué)雜志，2022，37（4）：472-476.

[2]蔡時(shí)可，鄭希龍，劉曉津，等．鐵皮石斛生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)[J]．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（S1）：115-117.

[3]朱慶豎，陳勇，余花，等．鐵皮石斛組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)研究[J]．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（31）：19-24.

[4]成丹，聶天驕，李成慧．鐵皮石斛一次成苗技術(shù)初探[J]．現(xiàn)代園藝，2018（9）：16-17.

[5]鄧瑞云，羅煥明，劉曉津，等．鐵皮石斛組培快繁技術(shù)研究[J]．廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29（6）：608-611.

[6]鄭寬瑜，鄧君浪，趙輝．鐵皮石斛組培快繁技術(shù)體系研究[J]．云南農(nóng)業(yè)科技，2009（S2）：57-59.

[7]梁暉輝，張成才，高真，等．響應(yīng)面法探究鐵皮石斛種子一步成苗[J]．中藥材，2019，42（11）：2473-2479.

[8]陳爾，王華新，陳寶玲，等．正交試驗(yàn)優(yōu)選鐵皮石斛生根培養(yǎng)基[J]．廣西林業(yè)科學(xué)，2019，48（3）：357-360.

[9]才真，劉海學(xué)，王緒．基于正交設(shè)計(jì)的鐵皮石斛組織培養(yǎng)和耐鹽性研究[J]．種子，2018，37（7）：64-67.

[10]李忠玥，徐元江，何焱，等．西藏野生金釵石斛幼苗培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]．高原農(nóng)業(yè)，2019，3（2）：203-209.