馬熒雪,繆陶林,莊強(qiáng)爾

無(wú)錫市兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科,江蘇無(wú)錫 214000

過(guò)敏性鼻炎(AR)是易感機(jī)體接觸過(guò)敏原后受到免疫球蛋白IgE介導(dǎo)并造成Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的表現(xiàn)之一,該過(guò)程由多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與[1-2]。AR患兒主要的臨床表現(xiàn)包括鼻通氣性差、有明顯癢感、出現(xiàn)大量清水樣涕及陣發(fā)性噴嚏,多數(shù)患兒病程較長(zhǎng)且呈季節(jié)性發(fā)病,一定程度上會(huì)影響患兒的生活質(zhì)量[3-4]。有學(xué)者圍繞AR的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)嗜酸細(xì)胞(EOS)的水平異常增加是其主要病理表現(xiàn)[5]。微小RNA-487b(miR-487b)被認(rèn)定可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)而影響機(jī)體的炎癥反應(yīng),并對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用,提示miR-487b可能參與AR的發(fā)生過(guò)程[6]。另外,研究發(fā)現(xiàn)患兒出現(xiàn)明顯過(guò)敏反應(yīng)的主要機(jī)制為IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),針對(duì)該指標(biāo)的臨床檢測(cè)也成為目前常用的診斷方式,檢測(cè)血清特異性IgE水平并觀察患兒陽(yáng)性反應(yīng)變化情況,可明確患兒過(guò)敏源并開展針對(duì)性地治療,對(duì)改善患兒臨床癥狀、提高生活質(zhì)量具有積極作用[7]。因此本研究對(duì)AR患兒IgE、miR-487b和EOS水平進(jìn)行分析,探討其與患兒疼痛程度的相關(guān)性,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年1月至2022年6月在本院門診確診為AR的共98例患兒納入研究作為AR患兒組。另外,選取同期在本院接受體檢的健康兒童66例作為對(duì)照組。AR患兒組中,男56例,女42例;年齡4～12歲,平均(8.16±2.14)歲;病程3個(gè)月至3年,平均(6.25±1.01)個(gè)月。健康對(duì)照組中,男39例,女27例;年齡3～12歲,平均(7.81±2.22)歲。兩組基線資料包括性別、年齡等數(shù)據(jù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。AR患兒組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患兒臨床癥狀表現(xiàn)及診斷結(jié)果均符合AR診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)臨床資料完整;(3)患兒及家屬臨床依從性好,可配合完成本研究相關(guān)調(diào)查工作直至研究結(jié)束。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并鼻息肉/鼻腔內(nèi)腫瘤患兒;(2)患兒在本院就診前6個(gè)月內(nèi)接受過(guò)免疫治療、抗過(guò)敏藥物治療、激素治療等;(3)合并其他過(guò)敏癥狀;(4)具有鼻腔相關(guān)手術(shù)史;(5)合并肝、腎等嚴(yán)重器質(zhì)性功能障礙病變。

1.2方法

1.2.1IgE檢測(cè) 取所有研究對(duì)象空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血5 mL并收集于促凝管中,30 min后行離心機(jī)離心操作,參數(shù)設(shè)定為3 500 r/min,離心半徑10 cm,持續(xù)離心15 min后取上清液(血漿)作為待測(cè)標(biāo)本。應(yīng)用UniCAP 100E全自動(dòng)體外免疫診斷儀(瑞典Phadia AB公司)及配套試劑盒檢測(cè)特異性IgE水平。

1.2.2以PCR法檢測(cè)血漿miR-487b的表達(dá) 取1.2.1中分離的血漿標(biāo)本置于-20 ℃低溫冰箱保存待測(cè)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)測(cè)定研究對(duì)象血漿中miR-487b的表達(dá)水平。按照試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格完成操作,首先提取研究對(duì)象血樣中血漿總RNA,經(jīng)異丙醇沉淀濃縮后應(yīng)用75%乙醇完成洗滌并干燥,之后加入100 μL DEPC水,對(duì)所得RNA純度及完整度進(jìn)行檢測(cè)并明確;按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書完成cDNA逆轉(zhuǎn)錄,之后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。qPCR反應(yīng)(反應(yīng)體系20 μL):上下游引物各1 μL,雙蒸水6 μL,每一樣本設(shè)定3個(gè)平行檢測(cè)孔。上下游引物、內(nèi)參基因引物由上海恒斐生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成,miR-487b的檢測(cè)以U6為內(nèi)參。引物序見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95 ℃ 8 min;在90 ℃環(huán)境下持續(xù)變性20 s,之后60 ℃環(huán)境下完成退火并持續(xù)40 s,在72 ℃環(huán)境下延伸25 s,共持續(xù)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血漿中miR-487b相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qPCR引物序列

1.2.3以全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)EOS水平 采用空腹?fàn)顟B(tài)下取得的抗凝靜脈血標(biāo)本進(jìn)行EOS檢測(cè),使用的檢測(cè)儀器為邁瑞B(yǎng)C5150全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀。

1.2.4以視覺(jué)模擬量表(VAS)評(píng)分評(píng)估患兒疼痛程度 AR患兒均根據(jù)自身臨床癥狀填寫VAS評(píng)分(其得分可采用cm作為計(jì)量單位,使用0～10 cm來(lái)表示):以VAS評(píng)分<5.3 cm為輕度,≥5.3 cm為中重度[9]。

1.3觀察指標(biāo) (1)對(duì)比兩組各指標(biāo)水平;(2)對(duì)比不同嚴(yán)重程度AR患兒各指標(biāo)水平;(3)分析各指標(biāo)單一檢測(cè)及三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)模式對(duì)AR的診斷效能;(4)分析各指標(biāo)與AR患兒VAS評(píng)分的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1比較兩組IgE、miR-487b和EOS水平 AR患兒組IgE、EOS水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05);AR患兒組miR-487b表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 兩組IgE、miR-487b和EOS表達(dá)情況對(duì)比

2.2比較不同嚴(yán)重程度AR患兒IgE、miR-487b和EOS水平 根據(jù)AR患兒病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估并建立亞組,分別為輕度AR組(51例)和中重度AR組(47例),對(duì)比兩組各指標(biāo)水平,結(jié)果顯示,隨著AR患兒病情嚴(yán)重程度的增加,其IgE、EOS水平呈升高的趨勢(shì),其miR-487b表達(dá)呈下降趨勢(shì)(均P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 不同嚴(yán)重程度AR患兒IgE、miR-487b和EOS表達(dá)情況對(duì)比

2.3分析IgE、miR-487b和EOS單一檢測(cè)及三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)模式對(duì)AR的診斷效能 ROC曲線分析顯示,IgE、miR-487b和EOS單一檢測(cè)的曲線下面積均較低,三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積明顯高于單一指標(biāo)檢測(cè)(AUC=0.908,P<0.05),見(jiàn)表4、圖1。

圖1 IgE、miR-487b、EOS單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AR的診斷價(jià)值分析

表4 IgE、miR-487b、EOS單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AR的診斷價(jià)值分析

2.4IgE、miR-487b和EOS與AR患兒VAS評(píng)分的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示,IgE、EOS與VAS評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.581、0.594,P<0.05),miR-487b水平與VAS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.587,P<0.05),見(jiàn)圖2～4。

圖2 IgE與VAS評(píng)分的相關(guān)性

圖3 miR-487b與VAS評(píng)分的相關(guān)性

圖4 EOS表達(dá)與VAS評(píng)分的相關(guān)性

3 討 論

AR是臨床耳鼻喉科常見(jiàn)的一類病癥,隨著人們居住環(huán)境污染程度的加劇,AR發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年遞增態(tài)勢(shì)[10]。AR患兒發(fā)病若不給予科學(xué)合理的干預(yù)治療方案,隨著病情進(jìn)展很可能會(huì)引發(fā)哮喘、分泌性中耳炎等病癥。現(xiàn)階段臨床針對(duì)AR發(fā)病因素進(jìn)行了探討,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是抗原進(jìn)入易過(guò)敏個(gè)體內(nèi)引起相關(guān)炎癥介質(zhì)的大量釋放加劇了炎癥反應(yīng)[11]。

本研究針對(duì)AR患兒及健康受試者進(jìn)行對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)AR患兒IgE水平較健康兒童明顯增高,而且隨著病情程度的增加,該指標(biāo)水平呈升高趨勢(shì),原因可能是與AR發(fā)病機(jī)制有關(guān)。既往研究已證實(shí)AR發(fā)病主要是機(jī)體內(nèi)IgE介導(dǎo)的、以EOS浸潤(rùn)為主的慢性炎癥。受AR患兒自身過(guò)敏體質(zhì)影響,當(dāng)機(jī)體吸入變應(yīng)原后所產(chǎn)生的特異性IgE與自身鼻黏膜肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞處聚集的IgE受體進(jìn)行結(jié)合,當(dāng)患兒再次吸入變應(yīng)原時(shí),與靶細(xì)胞表面的IgE結(jié)合后釋放大量炎癥介質(zhì)介質(zhì)進(jìn)而引發(fā)AR[12]。

本研究結(jié)果顯示,AR患兒EOS水平較健康兒童明顯升高,而且隨著病情程度的加劇,患兒EOS水平更高,分析原因可能是EOS在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)制有關(guān)。EOS屬于一類具有免疫監(jiān)視的效應(yīng)細(xì)胞,EOS的活化會(huì)到導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放并加劇各類炎癥反應(yīng)。EOS可導(dǎo)致鼻黏膜受損,增加鼻黏膜的敏感性。相關(guān)研究顯示[13],EOS活化不僅會(huì)造成機(jī)體發(fā)生過(guò)敏性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加,一定程度上也會(huì)影響患者的病情發(fā)展程度。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果基本一致,分析原因可能是AR發(fā)作過(guò)程中上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等所釋放的炎癥因子促使EOS分化并趨化遷移至鼻黏膜。同時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞可以分泌多種炎癥因子,使鼻黏膜組織中EOS呈現(xiàn)高表達(dá)。EOS活化后的產(chǎn)物可合成大量毒性物質(zhì),進(jìn)而引發(fā)呼吸道黏膜上皮損傷,加重局部的炎癥反應(yīng)[14]。既往關(guān)于一項(xiàng)AR發(fā)病機(jī)制的研究指出,EOS的異常表達(dá)可導(dǎo)致小血管壁損傷并加劇局部通透性,進(jìn)而造成組織水腫及血漿外滲,加重鼻部癥狀,與本研究結(jié)果基本一致[15]。

既往有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-487b可抑制炎癥介質(zhì)進(jìn)而減輕心力衰竭患兒機(jī)體炎癥反應(yīng)程度[16]。而一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),AR模型小鼠miR上調(diào)可以抑制炎癥介質(zhì)表達(dá),進(jìn)而起到抑制AR的效用,提示miR-487b是治療AR的潛在治療靶點(diǎn)[17]。本研究結(jié)果顯示,miR-487b在AR患兒人群呈現(xiàn)低表達(dá),而且隨著患兒病情程度的加劇呈現(xiàn)下降趨勢(shì),提示miR-487b對(duì)AR病情的發(fā)生發(fā)展具有一定參與作用,而出現(xiàn)這一差異的原因可能是miR-487b在患兒機(jī)體中起到抑制炎癥反應(yīng)的效用。miR-487b是14q32miRNA簇成員之一,臨床研究顯示該miRNA在機(jī)體炎癥狀態(tài)下可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的有效抑制,進(jìn)而對(duì)炎癥相關(guān)因子起到抑制作用;miR-487b在人體內(nèi)可靶向控制IL-33,miR-487b表達(dá)上調(diào)可實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥因子的抑制效用,并提示miR-487b可能是AR的相關(guān)有效檢測(cè)指標(biāo)。

另外,本研究建立ROC曲線進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),IgE、miR-487b、EOS三項(xiàng)指標(biāo)對(duì)診斷AR病情程度均有一定效用,但三者聯(lián)合檢測(cè)診斷效能更高,提示后續(xù)臨床可通過(guò)上述三項(xiàng)指標(biāo)明確患兒病情發(fā)展程度并針對(duì)性給予有效治療。AR的過(guò)敏原主要以吸入性過(guò)敏原(以戶塵螨和粉塵螨為主)為主。VAS評(píng)分能較好地反映AR患兒的疾病嚴(yán)重程度。采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn),IgE、EOS水平與VAS評(píng)分呈正相關(guān),miR-487b表達(dá)與VAS評(píng)分呈負(fù)相關(guān),也進(jìn)一步提示上述三項(xiàng)指標(biāo)可有效反映出患兒臨床癥狀嚴(yán)重程度。

綜上所述,IgE、miR-487b和EOS對(duì)AR患兒的診斷效能較高,而且三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的效能更高。IgE、miR-487b和EOS水平與AR患兒疼痛程度密切相關(guān),提示臨床可密切觀察AR患兒IgE、miR-487b和EOS水平并完善相應(yīng)診療方案,減輕患兒臨床不良癥狀,促進(jìn)患兒快速康復(fù)。但本研究也存在一定不足,如樣品量較少且整個(gè)研究時(shí)間較短,可能會(huì)使研究結(jié)果出現(xiàn)偏倚性,后續(xù)研究中會(huì)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量及樣本范圍,深入分析相關(guān)機(jī)制來(lái)提高研究的科學(xué)性和結(jié)論的準(zhǔn)確性。