李 蕾,徐慶玲,吳玉芹

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院兒科,云南昆明 650000;2.昆明同仁醫(yī)院兒科,云南昆明 650228;3.昆明市兒童醫(yī)院特需門診,云南昆明 650228

支氣管哮喘屬于是一種慢性氣道疾病,臨床以氣道慢性炎癥反應(yīng)為主要特征,臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、胸悶及氣急等[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明[3]:我國成人哮喘發(fā)病率為1.24%,好發(fā)于具有哮喘家族史、有合并癥、肥胖及吸煙人群中。既往研究表明[4]:支氣管哮喘的發(fā)生多與免疫因素、炎癥介質(zhì)等有關(guān),而輔助性T細(xì)胞1(Th1)/輔助性T細(xì)胞2(Th2)失衡與炎癥介質(zhì)密切相關(guān)。Th1能分泌干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2),促使巨噬細(xì)胞活化,能調(diào)節(jié)機體免疫與炎癥;而Th2細(xì)胞能分泌白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-13(IL-13),發(fā)揮促炎作用[5-6]。在正常人體中Th1/Th2處于動態(tài)平衡狀態(tài),但是當(dāng)二者失衡后則能引起氣道炎癥疾病,增加支氣管哮喘發(fā)生率。近年來,國外最新研究發(fā)現(xiàn),微小RNA-21-5p(miR-21-5p)基因可能參與了肺損害氣道高反應(yīng)的病變過程,而且與慢性阻塞性肺疾病(COPD)有關(guān)[7]。而COPD與哮喘從病因、臨床表現(xiàn)、治療方法等相似,加強miR-21-5p在哮喘中的作用及表達(dá),有助于指導(dǎo)臨床診療,能為支氣管哮喘治療提供免疫治療提供新的靶點[8]。因此,本研究以支氣管哮喘患兒為對象,探討支氣管哮喘患兒miR-21-5p的水平及臨床意義,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2019年6月至2021年6月就診的支氣管哮喘患兒155例納入研究作為觀察組,男89例,女66例;年齡6～12歲,平均(9.39±0.71)歲;體重6～51 kg,平均(28.57±3.41)kg;病程1～4年,平均(2.15±0.61)年;疾病嚴(yán)重程度:輕度76例,中度55例,重度24例;患兒均給予常規(guī)方法治療,常規(guī)治療3個月后,根據(jù)觀察組患兒病情,進(jìn)一步將患兒分為預(yù)后不良組(急性發(fā)作)和預(yù)后良好組。預(yù)后良好組的判斷標(biāo)準(zhǔn)為臨床緩解:日間幾乎無咳嗽喘息或最多每周不超過1次輕微癥狀;夜間幾乎無咳喘及憋醒或者最多每月不超過1次有輕度夜間癥狀;沒有任何由哮喘導(dǎo)致的活動受限(可進(jìn)行正常日?；顒踊蜻\動,而不會誘發(fā)咳喘);幾乎不用(或每周使用不超過1次)緩解癥狀的支氣管舒張劑。另外,選取同期體檢健康的兒童155例作為對照組,男86例,女69例;年齡6～13歲,平均(9.42±0.74)歲;體重7～50 kg,平均(29.41±3.43)kg。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];(2)年齡為6～13歲,而且均處于急性發(fā)作期;(3)均為初次入院病例,精神狀態(tài)良好,能積極配合完成有關(guān)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)精神異常、凝血功能異?；蛞蚍窝椎纫鸬拇?(2)伴有肺間質(zhì)性疾病、惡性腫瘤者;(3)近3個月內(nèi)存在激素用藥史、解痙平喘治療史。

1.3儀器與試劑 高速離心機,型號:TG-16W,購于山東博科集團(tuán);熒光PCR板,型號:4729692001;96孔板,購于羅氏公司;紫外分光光度計,型號:U-T6A,購于上海屹譜儀器制造有限公司;恒溫箱,型號:FLY-YS-430L,購于北京福意電器;引物購于上海生物工程設(shè)計院;酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購于羅氏公司;羅氏LightCycler480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR(qPCR)儀,購于Roche羅氏公司。

1.4方法

1.4.1miR-21-5p測定 觀察組于入院后次日采集空腹肘靜脈血3 mL,對照組于健康體檢當(dāng)天采集空腹肘靜脈血3 mL。對采集的標(biāo)本離心10 min,離心速度3 000 r/min,血清分離后置于低溫下,備用。采用qPCR技術(shù)測定miR-21-5p,具體方法如下:取上述處理后的血液標(biāo)本,采用Trizol法完成總RNA提取,紫外分光光度儀測定提取的RNA純度,并完成總RNA純度鑒定。待上述操作完畢后,完成逆轉(zhuǎn)錄:RNA模板14 μL、2 μL Enzymemix,4 μL 緩沖液,補充雙蒸水至20 μL,在PCR檢測儀上42 ℃下1 h、95 ℃下5 min,將合成的cDNA放置在-20 ℃冰箱中,保存。PCR反應(yīng)體系:cDNA模板8 μL、SYBRP Green min 10 μL、PCR Primer mix 2 μL。設(shè)定反應(yīng)條件:95 ℃下預(yù)變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,進(jìn)行45個循環(huán),每個血液標(biāo)本重復(fù)3次,取Ct值。以β-actin作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算miR-21-5p相對表達(dá)水平,引物設(shè)計見表1[10-11]。

表1 引物設(shè)計

1.4.2嗜酸性粒細(xì)胞及炎癥因子測定 取全血標(biāo)本,采用XE-2100自動血液細(xì)胞分析儀測定嗜酸性粒細(xì)胞水平;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定兩組IL-4、IFN-γ,上述所有操作嚴(yán)格遵循儀器與試劑盒說明書完成[12-13],計算IFN-γ/IL-4。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-21-5p水平及炎癥指標(biāo)比較 觀察組支氣管哮喘患兒miR-21-5p、IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒細(xì)胞水平高于對照組(P<0.05);IFN-γ/IL-4水平低于對照組(P<0.05),見表2。

表2 兩組miR-21-5p及生化指標(biāo)比較

2.2不同預(yù)后的支氣管哮喘患兒miR-21-5p及炎癥指標(biāo)比較 155例支氣管哮喘患兒經(jīng)治療后,預(yù)后良好131例,預(yù)后不良14例。預(yù)后良好組miR-21-5p、IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒細(xì)胞水平低于預(yù)后不良組(P<0.05);IFN-γ/IL-4高于預(yù)后不良組(P<0.05),見表3。

表3 兩組miR-21-5p及炎癥指標(biāo)比較

2.3支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平的單因素分析 單因素分析表明:支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平與性別及體重?zé)o關(guān)(P>0.05);與病程、年齡及哮喘嚴(yán)重有關(guān)(P<0.05),見表4。

表4 支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平的單因素分析

2.4支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平的多因素Logistic回歸分析 多因素回歸分析表明:病程(β=1.846,OR=7.982,95%CI:6.313～8.493)、年齡(β=1.423,OR=6.791,95%CI:6.312～7.326)及嚴(yán)重程度(β=1.141,OR=5.457,95%CI:4.698～7.132)是支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平的影響因素,見表5。

表5 支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平的多因素Logistic回歸分析

2.5支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平與炎癥因子相關(guān)性及效能 Pearson相關(guān)性分析表明:支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平與IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.673、0.716、0.636,P<0.05);與IFN-γ/IL-4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.563,P<0.05);ROC曲線顯示:miR-21-5p在支氣管哮喘患兒中AUC值為0.851,診斷靈敏度為85.26%,特異度為80.18%,見表6和圖1。

圖1 miR-21-5p在支氣管哮喘患兒中的效能ROC曲線

表6 支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平與炎癥因子水平的相關(guān)性分析

3 討 論

支氣管哮喘好發(fā)于兒童,由肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞因子共同參與的呼吸系統(tǒng)疾病,且多數(shù)患兒具有既往哮喘家族史[14]。既往研究表明[15]:支氣管哮喘患兒中CD4+ T細(xì)胞發(fā)揮了重要的作用,能分化為Th1和Th2細(xì)胞亞群,二者失衡是支氣管哮喘發(fā)生的重要原因。由此看出,支氣管哮喘患兒發(fā)病后,常伴有明顯的氣道病理改變,臨床多表現(xiàn)為支氣管腺體肥大、氣道平滑肌細(xì)胞增殖等,造成氣道高反應(yīng)[16]。本研究中,觀察組miR-21-5p、IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒細(xì)胞水平高于對照組(P<0.05);IFN-γ/IL-4低于對照組(P<0.05);預(yù)后良好組miR-21-5p、IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒細(xì)胞水平低于預(yù)后不良組(P<0.05);IFN-γ/IL-4高于預(yù)后不良組(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示,支氣管哮喘患兒常miR-21-5p水平異常,并伴有Th1和Th2細(xì)胞亞群失衡,其表達(dá)水平能預(yù)測患兒治療預(yù)后。與IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒細(xì)胞水平相比,miR-21-5p檢測具有以下優(yōu)點:(1)由于Th1/Th2細(xì)胞失衡是支氣管哮喘的發(fā)病機制之一,而miR-21-5p與免疫細(xì)胞的活化、增殖、分化及免疫應(yīng)答有關(guān),且miR-21-5p能通過多種途徑參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展,能更加準(zhǔn)確的反映患兒疾病嚴(yán)重程度;(2)miR-21-5p測定過程中表達(dá)水平受到的影響因素較小,能減輕檢測過程中存在的誤差,可指導(dǎo)臨床診療。

miR-21-5p屬于一種高度保守的miRNA,從既往動物研究證實,miR-21-5p能參與調(diào)控細(xì)胞免疫及炎癥狀態(tài),對于IL-4、IFN-γ等均具有調(diào)控作用[17]。由此看出,miR-21-5p能通過調(diào)控炎癥因子水平,參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。本研究中,單因素分析表明:支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平與病程、年齡及嚴(yán)重程度有關(guān)(P<0.05);Logistic多因素回歸分析表明:病程(β=1.846,OR=7.982,95%CI:6.313～8.493)、年齡(β=1.423,OR=6.791,95%CI:6.312～7.326)及嚴(yán)重程度(β=1.141,OR=5.457,95%CI:4.698～7.132)是支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平的影響因素。本研究結(jié)果顯示,支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平的影響因素較多,且不同因素間能相互作用及影響。(1)病程是影響支氣管哮喘miR-21-5p水平的獨立危險因素,對于病程相對較短的患兒,miR-21-5p水平相對較低,可能由于病程較短,能發(fā)揮機體免疫作用,發(fā)揮抗炎作用[18]。但是,隨著病程延長機體免疫水平受損,導(dǎo)致Th1和Th2細(xì)胞亞群失衡加劇,造成機體內(nèi)瀑布聯(lián)級反應(yīng)加重。(2)年齡也是影響支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平的獨立危險因素,對于年齡較小患兒,身體免疫尚未全部形成,發(fā)病后炎癥反應(yīng)較為明顯,能引起miR-21-5p水平持續(xù)升高[19]。(3)體重對于支氣管哮喘miR-21-5p水平的影響存在爭議,本研究中不同體重支氣管哮喘患兒存在差異,可能與患兒體重越大,年齡越大,機體免疫水平升高,能抑制miR-21-5p水平,但是需進(jìn)一步研究與探討[20]。為了進(jìn)一步分析支氣管哮喘患兒與炎癥因子的關(guān)系,本研究中對其進(jìn)行相關(guān)性結(jié)果表明:支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平與IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)正相關(guān)(r=0.673、0.716、0.636,P<0.05),與IFN-γ/IL-4水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.563,P<0.05)。ROC曲線分析表明:miR-21-5p用于支氣管哮喘患兒診斷的AUC為0.851,靈敏度為85.26%,特異度為80.18%。本研究結(jié)果顯示,miR-21-5p在支氣管哮喘患兒中具有較高的診斷效能,能為臨床診療提供參考依據(jù)。因此,支氣管哮喘患兒應(yīng)加強miR-21-5p水平測定,了解患兒疾病嚴(yán)重程度,指導(dǎo)患兒診療,以促進(jìn)患兒早期恢復(fù)。

綜上所述,支氣管哮喘患兒miR-21-5p水平呈高表達(dá),影響因素較多,而且與IL-4、IFN-γ及IFN-γ/IL-4水平存在相關(guān)性,能指導(dǎo)臨床診療。