吳雅婷， 汪笑宇， 湯青平， 武尊， 高浩峰， 何學(xué)欣，楊張磊， 賈旭穎， 邵蓬*

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevisGunther）, 國(guó)內(nèi)俗稱“牛舌頭”“鰨目”, 主要分布在我國(guó)的黃海和渤海海域, 體型大、生長(zhǎng)快、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，已成為我國(guó)北方沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[1]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，各種疾病也隨之發(fā)生，其中皮膚潰瘍病給天津地區(qū)半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。半滑舌鰨的體表潰瘍癥大多與弧菌病有關(guān)，包括哈維氏弧菌(Vibrio harveyi) 、鰻弧菌(V.anguillarum)、需鈉弧菌(V.natriegens)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、燦爛弧菌(V.splendidus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、輪蟲(chóng)弧菌(V.rotiferianus)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、殺鮭弧菌(V.salmonicida)、海利斯頓氏菌(V.pelagius)、美人魚(yú)弧菌(V.damsela)、奧氏弧菌(V.ordalii)、費(fèi)氏弧菌(V.fischeri)以及最小弧菌(V.mimicus)等[3-4]。其中，哈維氏弧菌導(dǎo)致的水產(chǎn)動(dòng)物死亡已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。陳政強(qiáng)等[2]從體表潰瘍的半滑舌鰨體內(nèi)分離出輪蟲(chóng)弧菌和哈維氏弧菌；許悅等[5]從體表潰瘍的石斑魚(yú)體內(nèi)分離出9株菌，經(jīng)鑒定全部為哈維氏弧菌。

哈維氏弧菌（ATCC 14126T）最早從死片腳類動(dòng)物中分離出來(lái)，并于1935年命名為Achromobacter harveyi[6]，分類到發(fā)光桿菌屬，之后又被分到貝內(nèi)克氏菌屬。貝內(nèi)克氏菌屬被廢除后最終被分到弧菌屬[7]。哈維氏弧菌是最常見(jiàn)的1種海洋弧菌，可能與海洋動(dòng)物的腸道菌群有關(guān)[8]，可以感染很多海洋魚(yú)類或無(wú)脊椎動(dòng)物[9]。該病具有死亡率高、流行性強(qiáng)且分布廣的特點(diǎn)[10]，對(duì)海水魚(yú)類的危害極大。病魚(yú)的癥狀主要表現(xiàn)為腹水，腸道外翻，腎臟及脾臟充血，體表鱗片脫落、潰瘍，嚴(yán)重時(shí)潰瘍處不斷擴(kuò)大形成潰爛，病魚(yú)停止攝食，最終死亡[1]。

本研究對(duì)某養(yǎng)殖場(chǎng)患病半滑舌鰨進(jìn)行了臨床診斷、病原菌分離、人工感染、藥敏分析以及病理組織切片分析，以期為科學(xué)防治由該菌導(dǎo)致的半滑舌鰨疾病提供參考依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 患病魚(yú)的臨床檢查

患病魚(yú)體取自天津某半滑舌鰨養(yǎng)殖場(chǎng)，體表觀察后取患病魚(yú)的鰓絲及體表黏液制成水浸片于顯微鏡(DM750，Leica)下觀察有無(wú)寄生蟲(chóng)和真菌感染，將病魚(yú)解剖進(jìn)一步觀察魚(yú)體腸道、肝臟及脾臟等內(nèi)部器官的癥狀。

1.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下分別從病魚(yú)的肝臟、腎臟、脾臟等處取樣并接種于2216E和TCBS培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，28 ℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌落形態(tài)分為不同種菌株，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化后的菌株轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中加20%甘油，放于冰箱-80 ℃保存。

1.3 人工感染試驗(yàn)及LD50測(cè)定

健康半滑舌鰨取自天津市濱海新區(qū)某半滑舌鰨養(yǎng)殖公司，體長(zhǎng)為18～24 cm，體質(zhì)量35～45 g。根據(jù)養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖條件（水溫26 ℃，鹽度20）于循環(huán)水中暫養(yǎng)1周，早晚各投喂1次并進(jìn)行池底吸污，1周后開(kāi)始攻毒試驗(yàn)。試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理組，4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組10尾魚(yú)。試驗(yàn)前將-80 ℃甘油保存的菌株放室溫下復(fù)蘇，經(jīng)2216E平板活化、純化，選擇生長(zhǎng)良好的單菌落接種到BHI液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，待菌體生長(zhǎng)是指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，12 000 r·min-1離心5 min收集菌體，采用麥?zhǔn)媳葷岱╗11]將菌懸液稀釋為4個(gè)水平，依次為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU·mL-1。，每尾魚(yú)采用腹腔注射法進(jìn)行感染，注射量均為0.2 mL，對(duì)照組注射等量生理鹽水，觀察7 d內(nèi)魚(yú)的死亡情況并記錄，用Bliss法測(cè)定試驗(yàn)魚(yú)7 d的半數(shù)致死劑量[12]。

1.4 革蘭氏染色及生理生化鑒定

在2216E培養(yǎng)基上取單個(gè)菌落置于載玻片上進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)并拍攝記錄。依據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用API 20NE試劑盒（法國(guó)梅里埃生物中國(guó)有限公司）對(duì)生理生化鑒定, 依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》[13]選取標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行比對(duì)。

1.5 16S rRNA擴(kuò)增

用滅菌接種環(huán)挑取單菌落懸浮于100 μL無(wú)菌去離子水中,100 ℃水浴10 min, 12 000 r· min-1離心10 min, 取2 μL上清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：TaqDNA聚合酶25 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各1.5 μL（表1）、滅菌雙蒸水20 μL、DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)程序∶95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃溫育5 min。用1%瓊脂凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將特異性條帶切膠回收后送至三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

16S rRNA及gyrB、ftsZ、gapA序列通過(guò)NCBI的Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進(jìn)行檢索，用 MEGA 7.0 軟件建樹(shù)后進(jìn)行序列同源性分析。

1.6 病理組織切片

取病魚(yú)的皮膚、腸道、腎臟及脾臟等病變明顯的組織用4%多聚甲醛固定的組織器官進(jìn)行修剪、脫水、透明、石蠟包埋、修蠟、切片等操作，切好的蠟片進(jìn)行貼片并干燥后，進(jìn)行HE染色，使用二甲苯封片[14]。對(duì)病理切片進(jìn)行鏡檢分析。

1.7 藥敏試驗(yàn)

采用瓊脂紙片擴(kuò)散法（K-B）對(duì)病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[12]。用瓊脂培養(yǎng)基對(duì)病菌進(jìn)行復(fù)蘇后制成菌懸液，用無(wú)菌棉簽蘸取菌液涂布于BHI固體培養(yǎng)基，然后貼上藥敏紙片(購(gòu)自溫州市康泰生物科技有限公司)，每個(gè)平板貼6片。24 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑，根據(jù)說(shuō)明書(shū)對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果敏感性進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病魚(yú)臨床癥狀表現(xiàn)

患病魚(yú)出現(xiàn)游動(dòng)緩慢、離群、停止攝食、魚(yú)體消瘦、體色暗沉等現(xiàn)象；病魚(yú)身體四周出現(xiàn)輕微充血現(xiàn)象，病魚(yú)腹部輕微腫脹潰瘍，并伴隨鱗片脫落（圖1A、B），部分病魚(yú)腸道脫出肛門(mén)并伴隨大量腸道腹水（圖1C）；解剖后可見(jiàn)腸道空乏無(wú)食物并伴有大量腹水、腎臟、脾臟出現(xiàn)腫大充血現(xiàn)象（圖1D、E）；部分病魚(yú)出現(xiàn)肝臟暗紅出血癥狀（圖1F）。

圖1 患病半滑舌鰨臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of ill half smooth tongue sole

2.2 病原菌分離及人工感染結(jié)果分析

從病魚(yú)的脾臟和腎臟分離出2株優(yōu)勢(shì)菌株，分別命名為8-0634、8-0635。細(xì)菌的培養(yǎng)結(jié)果顯示，這2株菌均在2216E培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，為白色不透明菌落；菌株8-0635在TCBS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為黃色、不透明且邊緣完整的圓形菌落（圖2）；菌株8-0634在TCBS培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。

圖2 菌株8-0635在TCBS上生長(zhǎng)Fig.2 Growth of strain 8-0635 on TCBS media

對(duì)2株優(yōu)勢(shì)菌分別進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有菌株8-0635感染魚(yú)后能引起魚(yú)類死亡，感染8-0635的半滑舌鰨1周內(nèi)的死亡情況如表2所示，其半數(shù)致死劑量LD50為3.7×105CFU·mL-1。這與之前的患病魚(yú)癥狀相似，因此對(duì)這株優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行鑒定。

表2 半滑舌鰨人工回歸感染結(jié)果Table 2 Results of artificial regression infection of Cynoglossus semilaevis

2.3 革蘭氏染色及生理生化鑒定結(jié)果

菌株8-0635在2216E上生長(zhǎng)表現(xiàn)為白色不透明的圓形菌落，邊緣光滑。經(jīng)革蘭氏染色后在鏡下觀察為短桿狀細(xì)菌，兩端鈍圓，菌體大小為1～4 μm（圖3）。

圖3 菌株8-0635革蘭氏染色Fig.3 Gram staining of strain 8-0635

對(duì)菌株8-0635分別進(jìn)行了8.5‰和20.0‰NaCl下的生理生化試驗(yàn)，結(jié)果（表3）顯示與哈維氏弧菌最為接近，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》[13]選取了3株哈維氏弧菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株與優(yōu)勢(shì)菌株8-0635進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示菌株8-0635雖然與標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化結(jié)果近似，但仍有差異。

表3 菌株8-0635的主要生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 3 Test results of main physiological and biochemical indexes of strain 8-0635

2.4 分子鑒定結(jié)果分析

對(duì)菌株8-0635進(jìn)行了分子鑒定，測(cè)序結(jié)果與其他9株菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)菌株8-0635與8種菌株的序列同源性均較低（圖4），無(wú)法區(qū)分該菌株。在此基礎(chǔ)之上，將16S rRNA和3個(gè)保守基因（gyrB、ftsZ、gapA）的片段與原菌株基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株8-0635與V.harveyi的同源性較高（圖5），故判斷菌株8-0635為哈維氏弧菌。

圖4 菌株8-0635的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 16S rRNA phylogenetic tree of strain 8-0635

圖5 菌株8-0635的多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Multi-site phylogenetic tree of strain 8-0635

2.5 病理組織切片分析

依次取發(fā)病的半滑舌鰨的腎臟、脾臟、性腺及腸道切片觀察。腎臟組織的結(jié)構(gòu)模糊,其細(xì)胞排列不整齊,與哈維氏弧菌感染癥狀一致[15]。腎小管上皮受損嚴(yán)重，表現(xiàn)為上皮脫落，細(xì)胞裂解死亡（圖6A）；脾臟出血嚴(yán)重，血管破裂，血細(xì)胞滲出（圖6B）；病魚(yú)的前中后腸均有嚴(yán)重病變，表現(xiàn)為腸黏膜受損脫落，充血嚴(yán)重，伴有血管破損，血液滲出（圖6C）。肌肉受損，表現(xiàn)為肌纖維斷裂（圖6D）。各組織中均有明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。

圖6 病理組織切片觀察Fig.6 Observation of pathological sections

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)42種抗菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，菌株8-0635對(duì)頭孢哌酮、氟苯尼考、氯霉素、氨芐西林等16種藥物高度敏感；對(duì)紅霉素、克拉霉素、替卡西林、恩諾沙星、卡那霉素等9種藥物中度敏感；對(duì)土霉素、四環(huán)素、萘啶酸、萬(wàn)古霉素、鏈霉素等17種藥物不敏感。

表4 菌株8-0635的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Drug sensitivity test results of strain 8-0635

3 討論

本研究生理生化鑒定結(jié)果與Schleifer[7]方法略有不同，很難確定病原菌種類。結(jié)合16S rRNA及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)菌株8-0635進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)菌株8-0635與NCBI上所選取的標(biāo)準(zhǔn)菌株同源性較低。由此可見(jiàn)，隨著弧菌的進(jìn)化和發(fā)展，單純的16S rRNA與生理生化鑒定方法已經(jīng)無(wú)法滿足弧菌的準(zhǔn)確鑒定，本研究引入了管家基因[16]進(jìn)行多位點(diǎn)測(cè)序（multilocus sequence analysis）。Wan等[17]通過(guò)16S rRNA和3種管家基因gyrB、ftsZ、gapA準(zhǔn)確地鑒定出了哈維氏弧菌，因此通過(guò)保守的蛋白質(zhì)編碼基因（16S rRNA、gyrB、ftsZ、gapA）能可靠地檢測(cè)和鑒定這些物種。經(jīng)多位點(diǎn)測(cè)序的方法重新建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，菌株8-0635與哈維氏弧菌的同源性較高，故可鑒定菌株8-0635為哈維氏弧菌。

皮膚潰瘍病也被稱為皮膚潰爛病，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的常見(jiàn)病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[18]。崔婧等[4]研究表明，哈維氏弧菌易感染紅鰭笛鯛、珍珠龍膽等，不僅可引起感染對(duì)象鱗片脫落、皮膚壞死、肌肉潰爛等嚴(yán)重病灶，而且還會(huì)引起病魚(yú)的肝臟、脾臟、頭腎等多種內(nèi)臟器官充血、產(chǎn)生白斑等病變；張鳳萍等[19]研究表明，鮸魚(yú)感染哈維氏弧菌會(huì)表現(xiàn)出厭食、游動(dòng)遲緩、尾柄和胸鰭基部呈出血性潰瘍。Liu等[20]研究表明，感染哈維氏弧菌的軍曹魚(yú)會(huì)出現(xiàn)腸胃炎等癥狀。與上述研究一致，本文患病魚(yú)體表現(xiàn)為體表皮膚潰爛出血、腹水、眼球突出，食欲不振等癥狀，最終停止攝食導(dǎo)致死亡，經(jīng)鑒定從半滑舌鰨腎臟中分離出的哈維氏弧菌是主要的致病菌，人工感染試驗(yàn)得出半數(shù)致死量LD50為3.7×105CFU·mL-1，與徐曉麗等[1]從半滑舌鰨所分離菌的半數(shù)致死量（LD50）為7.15×105CFU·mL-1相比較高，可能是不同菌株的毒力不同導(dǎo)致。對(duì)感染哈維氏弧菌的半滑舌鰨的肌肉、脾臟、腎臟和腸道的組織切片進(jìn)行觀察，可見(jiàn)各組織間均有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肌肉表現(xiàn)為肌纖維斷裂，脾臟有血細(xì)胞滲出現(xiàn)象，腎臟病變嚴(yán)重表現(xiàn)為腎小管空腔消失，腎小管上皮受損，細(xì)胞裂解死亡；腸道表現(xiàn)為腸黏膜受損脫落，血管破裂，血細(xì)胞流入間質(zhì)。

感染哈維氏弧菌的魚(yú)類疾病多爆發(fā)于每年的5—10月，易發(fā)生在養(yǎng)殖密度較高、水溫較高的魚(yú)類之間，多種不同生長(zhǎng)時(shí)期的魚(yú)類都可發(fā)病[4]。研究表明，弧菌病多是通過(guò)肌肉受損感染[21]，但由于哈維氏弧菌的致病機(jī)制尚不清楚，還沒(méi)有有效的方法來(lái)控制其傳播[22]。目前哈維弧菌的防治方法主要有抗生素、中草藥、生物防治和免疫防治等[10]。此外，也可以利用微生物制劑、群感效應(yīng)等手段對(duì)其進(jìn)行防治[23]。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，弧菌病在水體中擴(kuò)散加上我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)給藥合理性的欠缺，抗生素的濫用導(dǎo)致了不同地區(qū)來(lái)源的哈維氏弧菌具有豐富的耐藥譜[24]。本研究中半滑舌鰨感染哈維氏弧菌的藥敏試驗(yàn)顯示，其對(duì)頭孢噻吩、頭孢唑酮、阿莫西林、慶大霉素、氟苯尼考等藥物敏感，為該地區(qū)哈維氏弧菌的防治提供了參考。