黃超文 劉艷娟 王璐 包晴 蔣宇 楊磊

〔摘要〕 目的 探討何首烏（Polygonum Multiflorum， PM）炮制后降低肝毒性的作用機制。方法 通過使用生何首烏（raw Polygonum Multiflorum， RPM）與制何首烏（processed Polygonum Multiflorum， PPM）處理L02肝細胞，采用CCK-8與EdU試劑檢測L02肝細胞的細胞活力與增殖能力;運用轉錄組學技術分析正常組、RPM、PPM組之間的差異基因，并對差異基因進行富集分析，在此基礎上采用Western blot和免疫熒光驗證相關通路上關鍵蛋白的表達水平。結果 CCK-8和EdU實驗中發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，RPM組能夠顯著抑制肝細胞的細胞活力與增殖能力（P<0.01），與RPM組相比，PPM組的肝細胞活力與增殖能力明顯升高（P<0.01）。RNA測序結果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，RPM組有3449個上調基因、3793個下調基因。與RPM組相比，PPM組有3788個基因上調、3515個基因下調。將正常組與RPM組的差異基因和RPM組與PPM組的差異基因進一步取交集，得到6854個共同差異基因;GO分析類結果顯示主要參與細胞殺傷、細胞聚集、新陳代謝、生長等生物過程;KEGG富集分析結果顯示，這些差異基因主要富集在內吞作用、溶酶體、自噬作用等細胞過程。Western blot與免疫熒光結果顯示，與正常組相比，RPM組中自噬相關基因LC3蛋白水平顯著上調（P<0.01），P62蛋白水平顯著降低（P<0.01）;與RPM組相比，PPM組中LC3蛋白水平顯著降低（P<0.01），P62蛋白水平顯著升高（P<0.01）。結論 何首烏炮制后能夠降低肝細胞毒性，其機制可能與減少細胞自噬有關，為降低何首烏毒性提供了新的干預措施。

〔關鍵詞〕 何首烏;炮制;自噬;肝毒性;轉錄組學

〔中圖分類號〕R283? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.010

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of action of the processed Heshouwu （Polygoni Multiflori） （PM） in reducing hepatocytotoxicity. Methods By treating L02 hepatocytes with raw Heshouwu （Polygonum Multiflora） （RPM） and processed Heshouwu （Polygoni Multiflori） （PPM）， cell viability and proliferative capacity of L02 hepatocytes were detected using CCK-8 with EdU reagent; the gene differences among the normal， RPM and PPM groups were analyzed and the gene set enrichment analysis was performed by transcriptomics. Finally， Western blot and immunofluorescence were used to verify the expression levels of key proteins on the relevant pathways. Results CCK-8 and EdU experiments showed that RPM significantly inhibited cell viability and proliferative capacity of hepatocyte compared to the normal group （P<0.01）， hepatocyte viability and proliferative capacity in the PPM group were significantly highercompared to the RPM group（P<0.01）. The RNA sequencing revealed： 3449 up-regulated and 3793 down-regulated genes in RPM group compared with normal group; 3788 up-regulated and 3515 down-regulated genes in PPM group compared with RPM group. GO classification showed that the genes were mainly involved in cell killing， cell aggregation， metabolism， growth and other biological processes; KEGG classification suggested that these genes were mainly enriched in endocytosis， lysosome， autophagy and other cellular processes. The Western blot and immunofluorescence analyses showed the significantly higher protein level of LC3 （P<0.01） and lower protein level of P62 （P<0.01） in RPM group than in normal group; PPM group had the significantly lower protein level of LC3 （P<0.01） and higher level of P62 （P<0.01） than RPM group. Conclusion PPM is able to alleviate hepatocytotoxicity， whose mechanism may be reducing autophagy. The study may provide a new intervention to alleviate the toxicity of PM.

〔Keywords〕 Heshouwu （Polygonum Multiflorum）; processing; autophagy; hepatotoxicity; transcriptomics

何首烏作為臨床常用中藥，具有抗衰老、增強免疫、抗高血脂等多種生物學效應[1]。根據(jù)其是否炮制，分為生品與炮制品。近年來國內外關于何首烏肝毒性的報道屢見不鮮[1-2]。臨床資料顯示患者使用何首烏后易出現(xiàn)肝炎、肝功能異常、藥物性肝損傷等損害性疾病[3-4]。何首烏藥用安全問題極大地限制了其在臨床上的使用，為了使何首烏在臨床上發(fā)揮其功效的同時避免其可能造成的肝損害，尋找特異性干預手段降低其肝毒性已成為當前科研工作者研究的熱點。研究顯示，與生何首烏相比，制何首烏肝毒性顯著降低[5-6]。劉夢嬌等[7]用L02肝細胞評估何首烏炮制前后肝毒性，結果發(fā)現(xiàn)，制首烏組的肝細胞抑制率低于生首烏組。盡管已有部分學者對何首烏的肝毒性進行深入研究，但其具體分子機制仍不清楚。因此，進一步闡明何首烏炮制后降低肝毒性的作用機制，有望為尋找降低何首烏肝毒性提供特異性干預靶點。

自噬是細胞降解有害成分并通過將其降解后的產(chǎn)物回收以實現(xiàn)細胞代謝和某些細胞器更新的生理過程[8-9]。在對乙酰氨基酚誘導的小鼠肝損傷中，人參皂苷Rk3通過激活自噬產(chǎn)生肝臟保護作用[10]。此外，自噬也可能促進肝細胞死亡而誘導肝損傷[11-12]。研究顯示，馬兜鈴酸通過促進P53蛋白表達，誘導自噬，從而導致大鼠肝臟細胞損傷[13]。刀豆蛋白A通過增強自噬誘導樹突狀細胞活化，從而加劇自身免疫性肝炎[14]。綜上所述，自噬在肝臟中起著雙重作用：一方面，激活自噬可以保護肝臟免受損傷;另一方面，過度自噬又會導致肝臟功能受損。

本文通過實驗評價生何首烏和制何首烏的肝毒性作用，采用何首烏提取物處理L02細胞，觀察其對L02肝細胞活力、增殖的影響;利用轉錄組學技術分析生何首烏與制何首烏處理的L02肝細胞的表達譜差異，探討其可能的分子機制，并進一步采用Western blot、免疫熒光分子實驗技術對篩選的差異基因及通路進行驗證，以期從分子水平為生何首烏與制何首烏肝毒性差異提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1? 藥物與試劑

何首烏購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院張志國教授鑒定為正品。生何首烏：何首烏未經(jīng)加工處理。制何首烏：將黑豆汁浸泡的何首烏蒸制4 h，曬制4 h，蒸曬9次，即得;CCK-8試劑盒（C0037），購自中國碧云天公司;EdU增殖試劑（CX002），購自中國雅酶生物醫(yī)藥科技公司;LC3抗體（ab128025）、P62抗體（ab91526），均購自英國Abcam公司。

1.2? 儀器

高速離心機（型號：Sorvall ST 8）、酶標儀（型號：Multiskan FC）均購自美國Thermo Fisher公司;恒溫水浴鍋（北京長風儀器儀表公司）;熒光顯微鏡（日本Olympus公司，型號：X51）;化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Beckman公司，型號：UniCel DxI 800）。

2 方法

2.1? 何首烏供試液制備

取適量的生何首烏和制何首烏，粉碎后用70%乙醇提取。第1次加10倍量70%乙醇加熱回流提取2 h，第2次加8倍量70%乙醇加熱回流提取1.5 h，共提取2次，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，得到相應的生藥濃度。

2.2? 細胞培養(yǎng)

L02人肝細胞株，在含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗的1640完全培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進行常規(guī)培養(yǎng)，所有實驗均在細胞對數(shù)生長期進行。

2.3? 細胞活力檢測

采用CCK-8試劑測定生何首烏、制何首烏對L02肝細胞的細胞毒性。將細胞接種（5×103個/孔）在96孔板中，并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至對數(shù)生長期。分為正常組、生何首烏（raw Polygonum Multiflorum， RPM）組、制何首烏（processed Polygonum Multiflorum， PPM）組。正常組不作任何處理，RPM組和PPM組分別加入不同濃度的生何首烏、制何首烏（0、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL）處理L02肝細胞，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，孵育1.5 h，通過酶標儀測量450 nm處OD值。

細胞活力=（給藥組OD值-空白對照組OD值）/（正常組OD值-空白對照組OD值）×100%。

2.4? EdU增殖實驗

將L02肝細胞接種在12孔板中，分為正常組、RPM組、PPM組，其中RPM組和PPM組分別用5 mg/mL的生何首烏、制何首烏處理24 h，并根據(jù)制造商的說明用EdU-488細胞增殖檢測試劑盒染色。首先將細胞用EdU標記，然后進行EdU檢測及細胞核染色，最后通過熒光顯微鏡在40倍鏡下拍攝圖像并保存，計算細胞增殖率。細胞增殖率=EdU細胞數(shù)/DAPI細胞數(shù)×100%。

2.5? 轉錄組測序

6孔板中接種5×105個/孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h分為正常組、RPM組、PPM組，各組細胞處理方式同“2.4”項，除去所有培養(yǎng)基，并用冷的PBS洗滌細胞2次。TRIzol用于分離總RNA，檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性，以保障使用合格的樣品進行轉錄組測序。樣品檢測合格后，進行文庫構建，最后用Illumina平臺進行測序。使用DESeq2軟件分析正常組、生何首烏組、制何首烏組三者之間的差異表達基因。將FC≥2且FDR<0.01的基因認為是差異表達基因（differential expressed genes， DEGs）。對DEGs進行GO和KEGG分析。

2.6? 免疫熒光檢測L02肝細胞中LC3和P62的熒光信號

將細胞爬片分為正常組、RPM組、PPM組。各組細胞漂洗一次，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%Triton-X100室溫下破膜15 min，PBS洗2次，10% FBS室溫封閉30 min，加入一抗（LC3和P62抗體1∶100），4 ℃孵育過夜;TBST洗3次，加入二抗室溫孵育1 h;室溫避光孵育核染色15 min，熒光顯微鏡下觀察。

2.7? Western blot檢測L02肝細胞中LC3和P62的蛋白表達

用RIPA裂解液處理樣品獲得蛋白提取物，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品并轉移到聚偏二氟乙烯膜，在室溫下用5%的脫脂牛奶封閉1.5 h，然后將膜與一抗LC3、P62在4 ℃孵育過夜，然后與二抗抗兔IgG 37 ℃孵育1 h。使用ImageJ通過熒光讀數(shù)進行檢測，并通過ImageJ進行定量。

2.8? 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)顯示為“x±s”，采用GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較采用t檢驗。使用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異（LSD）檢驗進行多組之間的比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 何首烏炮制前后對L02肝細胞活力的影響

與正常組相比，RPM組各個濃度組的細胞活力顯著降低（P<0.01），PPM組中除1.25 mg/mL濃度組外，其余各個濃度組細胞活力顯著降低（P<0.01）;與RPM組相比，PPM組各個濃度（除1.25 mg/mL）組的細胞活力明顯升高（P<0.01）。詳見圖1。

3.2? 何首烏炮制前后對L02肝細胞增殖能力的影響

與正常組相比，RPM組及PPM組的肝細胞增殖能力顯著降低（P<0.01）;與RPM組相比，PPM組中肝細胞增殖能力顯著升高（P<0.01）。詳見圖2。

3.3? 何首烏炮制前后對L02肝細胞轉錄組基因的影響

與正常組相比，RPM組有3449個上調基因、3793個下調基因。與RPM相比，PPM組有3788個基因上調、3515個基因下調。將正常組、RPM組的差異基因與RPM組、PPM組的差異基因進一步取交集，得到6854個共同差異基因（圖3）。對6854個差異基因中表達量大于1的4216個基因進行GO分析和KEGG分析。GO分析結果顯示主要參與細胞殺傷、細胞聚集、新陳代謝、生長等生物過程;KEGG分析結果顯示，這些差異基因主要富集在內吞作用、溶酶體、自噬作用等細胞過程。詳見圖4。

3.4? 何首烏炮制前后對L02肝細胞中LC3、P62熒光信號的影響

與正常組相比，RPM組中的LC3熒光信號增強（P<0.01），P62熒光信號減弱（P<0.01）;與RPM組相比，PPM組中LC3熒光信號減弱（P<0.01），P62熒光信號增強（P<0.01）。詳見圖5。

3.5? 何首烏炮制前后對L02肝細胞中LC3、P62蛋白表達的影響

與正常組相比，RPM組中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平上調，P62蛋白水平下調（P<0.01）;與RPM組相比，PPM組中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平下調，P62蛋白水平上升（P<0.01）。詳見圖6。

4 討論

何首烏是一種我國常用的傳統(tǒng)中藥，在臨床中廣泛使用，但隨著其臨床肝毒性報道的增加，人們對何首烏的肝毒性研究也越來越多[2，15-16]。本研究采用CCK-8與EdU評估了何首烏炮制前后對肝細胞活力和增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)何首烏炮制后能夠降低對肝細胞的毒性。然而，在大多數(shù)情況下何首烏致肝損傷的作用機制仍然不太明確。因此，闡明何首烏肝毒性的相關分子機制、尋找特異性干預靶點、降低其毒副作用是推廣其臨床應用的關鍵手段。

自噬在維持肝臟穩(wěn)態(tài)和消除細胞內有害物質中起主要作用[17-18]。然而在某些情況下，肝細胞中的過度自噬也是導致肝損傷的重要因素。LC3、P62為自噬過程中的關鍵蛋白。LC3具有2種形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，在各種細胞中翻譯后產(chǎn)生。且LC3-Ⅱ的量與自噬水平相關[19]。P62是一種選擇性自噬受體，可通過自噬溶酶體途徑招募和遞送細胞內底物以進行大量清除，當自噬被激活時，聚泛素結合蛋白P62通過自噬降解[20]。楊李旺等[21]研究顯示，黃連解毒湯通過上調Beclin1及LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達，從而誘導膿毒癥小鼠發(fā)生自噬，降低肝損傷。吳欣妍等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)，同型半胱氨酸通過促進PSMD10表達增加，誘導肝細胞過度自噬從而導致肝損傷。LIU等[23]發(fā)現(xiàn)高濃度的斑蝥素激活自噬，上調LC3，增加肝細胞毒性。有研究[24]發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能夠誘導自噬，促進ABBC2蛋白降解，從而導致小鼠肝損傷。然而，何首烏肝毒性與自噬之間是否存在聯(lián)系尚不清楚。本實驗通過轉錄組技術對4216個共同差異表達基因進行GO分析和KEGG分析，提示內吞作用、溶酶體、自噬作用與何首烏引起的肝損傷機制有關。研究結果顯示，生何首烏能夠上調LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，下調P62表達;何首烏炮制后能夠降低對肝細胞中LC3、P62蛋白表達的影響。

綜上所述，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)何首烏炮制后能夠降低肝細胞毒性，且何首烏能夠通過影響LC3、P62蛋白的表達來增加肝細胞自噬，從而導致肝損傷。盡管我們發(fā)現(xiàn)何首烏通過自噬誘導肝損傷，但其具體影響機制尚不明確，特別是自噬與其他因素相互作用導致何首烏肝損傷有待更多深入探討，為尋找和發(fā)現(xiàn)調節(jié)自噬干預何首烏肝損傷提供新的思路。

參考文獻

[1] LIU Y， WANG Q， YANG J B， et al. Polygonum multiflorum Thunb.： A review on chemical analysis， processing mechanism， quality evaluation， and hepatotoxicity[J]. Frontiers in Pharmacology， 2018， 9： 364.

[2] DONG H H， SLAIN D， CHENG J C， et al. Eighteen cases of liver injury following ingestion of Polygonum multiflorum[J]. Complementary Therapies in Medicine， 2014， 22（1）： 70-74.

[3] LIN L F， NI B R， LIN H M， et al. Traditional usages， botany， phytochemistry， pharmacology and toxicology of Polygonum multiflorum Thunb.： A review[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2015， 159： 158-183.

[4] JIANG L L， ZHAO D S， FAN Y X， et al. Transcriptome analysis to assess the cholestatic hepatotoxicity induced by Polygoni Multiflori Radix： Up-regulation of key enzymes of cholesterol and bile acid biosynthesis[J]. Journal of Proteomics， 2018， 177： 40-47.

[5] LEI X， CHEN J， REN J T， et al. Liver damage associated with Polygonum multiflorum Thunb.： A systematic review of case reports and case series[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine： ECAM， 2015， 2015： 459749.

[6] XUE X Y， QUAN Y Y， GONG L H， et al. A review of the processed Polygonum multiflorum （Thunb.） for hepatoprotection： Clinical use， pharmacology and toxicology[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2020， 261： 113121.

[7] 劉夢嬌， 蒲俊安， 戴? 冰， 等. 何首烏“九蒸九曬”炮制工藝優(yōu)選及對L02肝細胞生長的影響[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志， 2020， 27（4）： 70-73.

[8] FAN Z H， LI Y X， CHEN S S， et al. Magnesium isoglycyrrhizinate ameliorates concanavalin A-induced liver injury by inhibiting autophagy[J]. Frontiers in Pharmacology， 2021， 12： 794319.

[9] LI W， HE P C， HUANG Y G， et al. Selective autophagy of intracellular organelles： Recent research advances[J]. Theranostics， 2021， 11（1）： 222-256.

[10] QU L L， FU R Z， MA X X， et al. Hepatoprotective effects of ginsenoside Rk3 in acetaminophen-induced liver injury in mice by activation of autophagy[J]. Food & Function， 2021， 12（19）： 9128-9140.

[11] QIAN H， CHAO X J， WILLIAMS J， et al. Autophagy in liver diseases： A review[J]. Molecular Aspects of Medicine， 2021， 82： 100973.

[12] ALLAIRE M， RAUTOU P E， CODOGNO P， et al. Autophagy in liver diseases： Time for translation？[J]. Journal of Hepatology， 2019， 70（5）： 985-998.

[13] 陳佳靚， 徐嘉若， 周月華， 等. 馬兜鈴酸致大鼠肝臟損傷及對自噬因素的影響[J]. 上海中醫(yī)藥大學學報， 2021， 35（5）： 44-51.

[14] FAN X L， MEN R T， HUANG C， et al. Critical roles of conventional dendritic cells in autoimmune hepatitis via autophagy regulation[J]. Cell Death & Disease， 2020， 11（1）： 23.

[15] LIU Y， WANG W P， SUN M Y， et al. Polygonum multiflorum-induced liver injury： Clinical characteristics， risk factors， material basis， action mechanism and current challenges[J]. Frontiers in Pharmacology， 2019， 10： 1467.

[16] ZHANG Y， DING T， DIAO T T， et al. Effects of Polygonum multiflorum on the activity of cytochrome P450 isoforms in rats[J]. Die Pharmazie， 2015， 70（1）： 47-54.

[17] UENO T， KOMATSU M. Autophagy in the liver： Functions in health and disease[J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology， 2017， 14（3）： 170-184.

[18] KE P Y. Diverse functions of autophagy in liver physiology and liver diseases[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（2）： 300.

[19] KABEYA Y， MIZUSHIMA N， UENO T， et al. LC3， a mammalian homologue of yeast Apg8p， is localized in autophagosome membranes after processing[J]. The EMBO Journal， 2000， 19（21）： 5720-5728.

[20] PANKIV S， CLAUSEN T H， LAMARK T， et al. P62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2007， 282（33）： 24131-24145.

[21] 楊李旺， 楊? 蓉， 趙煥新， 等. 黃連解毒湯通過誘導自噬減輕膿毒癥小鼠肝損傷[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2022， 28（5）： 71-76.

[22] 吳欣妍， 焦? 運， 王青青， 等. PSMD10在同型半胱氨酸激活肝細胞自噬促進肝臟損傷中的作用機制研究[J]. 中國藥理學通報， 2021， 37（4）： 535-541.

[23] LIU F， DUAN C C， ZHANG J Y， et al. Cantharidin-induced LO2 cell autophagy and apoptosis via endoplasmic reticulum stress pathway in vitro[J]. Journal of Applied Toxicology， 2020， 40（12）： 1622-1635.

[24] LIU D M， YANG D， ZHOU C Y， et al. Aloe-emodin induces hepatotoxicity by the inhibition of multidrug resistance protein 2[J]. Phytomedicine： International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology， 2020， 68： 153148.