牟晴蕊 白璐 趙洪慶 譚喜平 王宇紅 吳夢(mèng)瑤

〔摘要〕 目的 建立UPLC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中婦科斷紅飲膠囊主要有效成分在大鼠血漿中的濃度，并初步研究其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為。方法 雌性SD大鼠單次或重復(fù)灌胃給藥婦科斷紅飲膠囊內(nèi)容物后，收集72 h內(nèi)的血液樣本，通過UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定3種指標(biāo)性成分的濃度，由Phoenix WinNonlin 8.1計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 以苯海拉明為內(nèi)標(biāo)，芍藥苷、益母草堿、三七皂苷R1的檢測(cè)范圍分別為2～2000、0.1～300、0.1～800 ng·mL-1。準(zhǔn)確度分別在85%～115%之間，日內(nèi)精密度與日間精密度RSD≤15%。與單次給藥組比較，重復(fù)給藥組大鼠3種成分的藥時(shí)曲線下面積顯著增大，平均滯留時(shí)間MRT（0-∞）顯著延長(zhǎng)（P<0.01），消除半衰期t1/2無明顯變化。結(jié)論 該方法線性關(guān)系良好，線性范圍寬，定量限低，精密度、回收率等均符合生物樣品定量要求，提示該方法快速、靈敏、重復(fù)性好，可用于婦科斷紅飲膠囊3種有效成分在大鼠體內(nèi)的相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)研究。以其主要成分芍藥苷、益母草堿和三七皂苷R1為代表，婦科斷紅飲膠囊具有吸收快、分布廣的優(yōu)點(diǎn)。

〔關(guān)鍵詞〕 婦科斷紅飲;芍藥苷;益母草堿;三七皂苷R1;藥時(shí)曲線;藥代動(dòng)力學(xué);UPLC-MS/MS

〔中圖分類號(hào)〕R284? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.011

〔Abstract〕 Objective To establish an UPLC-MS/MS method to determine the concentration of the main active ingredients of Fuke Duanhongyin Capsule （FKDHYC） in rat plasma and to preliminarily study their pharmacokinetic behaviors in rats. Methods After single or repeated gavage administration of FKDHYC in female Sprague-Dawley （SD） rats， blood samples were collected within 72 h. The concentration of the three indicator ingredients were determined simultaneously by UPLC-MS/MS and pharmacokinetic parameters calculated by Phoenix WinNonlin 8.1. Results With diphenhydramine hydrochloride as the internal standard， the detection ranges of paeoniflorin， leonurine and notoginsenoside R1 were 2～2000， 0.1～300， 0.1～800 ng·mL-1 respectively. The accuracy was in the range of 85%～115%， and the intra-day and inter-day precisions were≤15%. Compared with the single administration group， the area under the concentration-time curve of the three ingredients in the repeated administration group was significantly increased and the mean retention time （MRT（0-∞）） was significantly extended （P<0.01）， while the elimination half-life （t1/2） showed no significant change. Conclusion The method of UPLC-MS/MS has good linearity， wide linear range， and low limit of quantification. The precision and recovery meet the requirements for the quantification of biological samples， suggesting that the method is rapid， sensitive and reproducible， and can be used for the pharmacokinetic study of the three active ingredients of FKDHYC in rats. Represented by paeoniflorin， leonurine， and notoginsenoside R1， FKDHYC has the advantages of fast absorption and wide distribution.

〔Keywords〕 Fuke Duanhongyin; paeoniflorin; leonurine; notoginsenoside R1; concentration-time curve; pharmacokinetics; UPLC-MS/MS

婦科斷紅飲膠囊由赤芍、益母草、三七、仙鶴草、地榆炭、蒲黃炭6味藥材組成，有涼血、止血、化瘀的功效，可用于子宮功能性出血（dysfunctional uterine bleeding， DUB）的治療。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，婦科斷紅飲膠囊治療DUB療效顯著，試驗(yàn)過程中沒有明顯不良反應(yīng)，提示該藥安全有效[1-3]。目前，該制劑藥效良好，組方藥物中益母草辛散苦泄，尤善治瘀血經(jīng)產(chǎn)諸病，為婦科調(diào)經(jīng)良藥;赤芍苦能泄散，既清肝火涼血，又活血化瘀;三七微苦泄散，止血與化瘀力均強(qiáng)，有止血而不留瘀、活血而不耗氣之優(yōu);仙鶴草苦澀收斂，止血力強(qiáng)，凡出血無論寒、熱、虛、實(shí)皆宜;地榆炭味苦降泄，有涼血止血、消腫止痛之功效，善治下焦血熱妄行諸證;蒲黃炭性平不偏，生行炒斂，炒炭后長(zhǎng)于收澀，略兼化瘀，為化瘀止血之要藥[4-8]。但由于復(fù)方成分的復(fù)雜性和多樣性，該制劑的體內(nèi)過程尚未明晰。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，婦科斷紅飲膠囊可能通過多種活性成分發(fā)揮止血化瘀作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，婦科斷紅飲膠囊亦可改善出血癥狀，調(diào)節(jié)多種蛋白表達(dá)[9-10]。前期文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，婦科斷紅飲膠囊治療DUB的3個(gè)潛在活性成分，分別為赤芍中的芍藥苷[11-12]、益母草中的益母草堿[13-16]與三七中的三七皂苷R1[17]。實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定婦科斷紅飲膠囊中3種有效成分的UPLC-MS/MS定量方法，用于該制劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 材料

1.1? 主要儀器與試劑

Waters ACQUITY型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）;AB Sciex QTRAP 5500型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）;Labconco CentriVap型冷凍臺(tái)式真空離心濃縮儀（美國(guó)Labconco公司）;SorvaLL ST8R型高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Option R7 utra AN型超純水系統(tǒng)（英國(guó)ELGA LabWaters公司）;XS205DU型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;LC-DCY-24GP型48孔干式氮吹儀（力辰科技有限公司）;KQ-800DE型中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）。甲醇（質(zhì)譜純，德國(guó)Merck KGaA公司，批號(hào)：204681）、乙腈（質(zhì)譜純，德國(guó)Merck KGaA公司，批號(hào)：204681）;甲酸（質(zhì)譜純，德國(guó)CNW公司，批號(hào)：84890090）。

1.2? 試藥

供試品：婦科斷紅飲膠囊由株洲千金藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20090713，批號(hào)：20200702，規(guī)格：0.4 g×18粒。

對(duì)照品：芍藥苷（批號(hào)：1110736-202044;純度>96.8%）、鹽酸益母草堿（批號(hào)：111823-201704;純度>94.3%）、三七皂苷R1（批號(hào)：110745-201921;純度>90.4%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3? 動(dòng)物

健康雌性SD大鼠，SPF級(jí)，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（質(zhì)量合格證編號(hào)：4307272011016

98124），體質(zhì)量（190±10） g;飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過（倫理審查號(hào)：LLBH-202012070002）。

2 方法與結(jié)果

2.1? 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC[○][R]HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫，0～2 min，95%～5% A;2～3 min，5% A;3～3.1 min，5%～95% A;3.1～5 min，95% A。體積流量0.3 mL/min。柱溫：40 ℃。樣品溫度：4 ℃。進(jìn)樣量：5 μL。

2.2? 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：噴霧離子源;正、負(fù)離子模式同時(shí)掃描;多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;源噴射電壓：5500、-4500 V;源溫度：550 ℃;霧化氣壓力：50 psi（1 psi≈6.895 kPa）;氣簾氣壓力：50 psi（1 psi≈6.895 kPa）;碰撞反應(yīng)氣：氮?dú)狻Ｉ炙庈?、益母草堿、三七皂苷R1以及內(nèi)標(biāo)物苯海拉明的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3? 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與質(zhì)控樣品配制

對(duì)照品溶液配制：精密稱取芍藥苷、益母草堿、三七皂苷R1各對(duì)照品適量，加50%甲醇定容到5 mL容量瓶中，制成濃度分別為1.08、1.10、1.02 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。臨用前，吸取一定量?jī)?chǔ)備液，置于容量瓶中，甲醇稀釋定容，用50%甲醇按梯度稀釋到所需要的濃度，即得混合系列對(duì)照品溶液，備用。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于10 mL容量瓶中，得到1 mg·mL-1的苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加50%甲醇逐漸稀釋成5 ng·mL-1的苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4? 血漿樣品處理[18]

取100 μL血漿，加入3倍量冰甲醇，渦旋2 min混勻后冰浴10 min。設(shè)置離心機(jī)溫度為4 ℃，以12 000 r·min-1離心5 min（離心半徑6 cm），取上清液置1.5 mL EP管中，用氮吹儀揮干溶劑，用50%甲醇（提前冰浴）復(fù)溶，在4 ℃下以12 000 r·min-1離心5 min（離心半徑6 cm），取上清液置于具內(nèi)置插管的進(jìn)樣瓶中。

2.5? 方法學(xué)考察[19-22]

2.5.1? 專屬性? 取濃度為25 ng·mL-1的混標(biāo)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行混合，加入到大鼠空白血漿中，另取內(nèi)標(biāo)溶液加入含藥血漿中，再取空白血漿，將上述3個(gè)樣品分別按“2.4”項(xiàng)下條件處理，檢測(cè)。3種有效成分及內(nèi)標(biāo)物在掃描模式下得到的質(zhì)譜色譜圖專屬性良好，待測(cè)物質(zhì)在特定保留時(shí)間下無雜質(zhì)及代謝產(chǎn)物響應(yīng)干擾。詳見圖1。

2.5.2? 線性、檢測(cè)限與定量限? 分別取不同濃度系列混標(biāo)溶液各100 μL，等體積1∶1與空白血漿混合后按“2.4”項(xiàng)下條件處理。LC-MS/MS測(cè)定，記錄峰面積，分別以血漿中各成分的濃度值為橫坐標(biāo)，以各成分和內(nèi)標(biāo)苯海拉明的峰面積比值為縱坐標(biāo)作圖，采用1/x2權(quán)重后得到各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度做定量限，另取定量限濃度樣品，平行樣品5個(gè)，操作同上，分別計(jì)算濃度，并得到平行樣品濃度之間的RSD。對(duì)血漿中各成分的線性關(guān)系和定量限進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，3個(gè)待測(cè)成分線性良好，范圍較寬，均符合生物樣品線性檢測(cè)要求。同時(shí)，該方法檢測(cè)限低，響應(yīng)好。定量限較低且均≥70 S/N，平行樣品濃度之間的RSD≤20%，符合《藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[22]要求。詳見表2。

2.5.3? 準(zhǔn)確度與精密度? 取配制好的低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按“2.4”項(xiàng)下條件處理，各平行5份，代入線性方程，計(jì)算測(cè)定值Cr，與加入的標(biāo)示量Cz比較，Cr/Cz得準(zhǔn)確度。同一日內(nèi)，不同濃度的同一血漿樣品平行進(jìn)樣5次，隨行標(biāo)曲計(jì)算日內(nèi)精密度;每日每個(gè)濃度制備一個(gè)，連續(xù)5批，每日繪制隨行標(biāo)曲，計(jì)算實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)與日間精密度均≤15%，準(zhǔn)確度為85%～115%，符合生物樣品要求。詳見表3。

2.5.4? 穩(wěn)定性? 按照“2.4”項(xiàng)下條件，配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度各3組，每組5份。第1組樣品室溫放置24 h，第2組于4 ℃放置5 d，第3組樣品于-80 ℃反復(fù)凍融3次，記錄峰面積，計(jì)算穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，3種成分的日內(nèi)穩(wěn)定性、日間穩(wěn)定性、血漿凍融穩(wěn)定性均為80%～120%，詳見表4。表明樣品在3種不同條件下處理后，均對(duì)待測(cè)樣品的測(cè)定無顯著性影響。

2.5.5? 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率? 分別取平行5份配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按“2.4”項(xiàng)下條件處理，測(cè)定峰面積值A(chǔ)r。另取低、中、高3個(gè)濃度的混標(biāo)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液混合，測(cè)定峰面積值A(chǔ)z。再取平行5份空白血漿按“2.4”項(xiàng)下條件處理后加入低、中、高濃度去除溶劑的混標(biāo)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，制備得標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品，測(cè)定峰面積值A(chǔ)s。As/Az得基質(zhì)效應(yīng)，Ar/As得提取回收率。結(jié)果表明，芍藥苷在低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度中的基質(zhì)效應(yīng)為90.46%～100.10%，提取回收率為109.60%～114.10%，益母草堿在低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度中的基質(zhì)效應(yīng)為89.90%～93.63%，提取回收率為88.00%～94.90%。提示基質(zhì)效應(yīng)很小，提取回收率較高，符合對(duì)生物樣品的測(cè)定要求。三七皂苷R1提取回收率較低，且有較為明顯的基質(zhì)增強(qiáng)作用，查閱文獻(xiàn)得知為三七皂苷R1入血后的普遍現(xiàn)象[19]，3種成分在不同質(zhì)量濃度樣品的基質(zhì)效應(yīng)、回收率測(cè)定值趨于穩(wěn)定。

2.6? 婦科斷紅飲膠囊藥代動(dòng)力學(xué)研究

雌性SD大鼠15只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中，保持室溫（22±2） ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，于實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，并于給藥后2 h自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧。大鼠隨機(jī)分成3組：?jiǎn)未谓o藥組（1.944 g/kg灌胃給藥1 d受試藥物，1次，6只）、重復(fù)給藥組（1.944 g/kg連續(xù)灌胃給藥5 d受試藥物，每日1次，6只）、空白組（3只）。分別于給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、8、12、24、48、72 h頸靜脈采血約0.3 mL，加入0.5%肝素鈉潤(rùn)洗干燥后的離心管中，設(shè)置離心機(jī)溫度為4 ℃，以4500 r·min-1離心5 min（離心半徑6 cm）后，取上層血漿，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理，再按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。采用UPLC-MS/MS法進(jìn)行藥物濃度分析測(cè)定，并用Phoenix WinNonlin 8.1藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。根據(jù)血藥濃度與時(shí)間的關(guān)系，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，血藥濃度為縱坐標(biāo)繪制藥時(shí)曲線。對(duì)藥時(shí)曲線進(jìn)行擬合，采用非房室摸型計(jì)算各成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2.6.1? 芍藥苷藥時(shí)曲線及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)? 灌胃給藥婦科斷紅飲膠囊內(nèi)容物，經(jīng)計(jì)算后得到芍藥苷的給藥劑量為85 145 782.066 ng/kg，藥時(shí)曲線見圖2，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表5。

2.6.2? 益母草堿藥時(shí)曲線及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)? 灌胃給藥婦科斷紅飲膠囊內(nèi)容物，經(jīng)計(jì)算后得到益母草堿的給藥劑量為11 326 994.772 ng/kg，藥時(shí)曲線見圖3，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表6。

2.6.3? 三七皂苷R1藥時(shí)曲線及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)? 灌胃給藥婦科斷紅飲膠囊內(nèi)容物，經(jīng)計(jì)算后得到三七皂苷R1的給藥劑量為386.618 ng/kg，藥時(shí)曲線見圖4，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表7。

3 討論

在探索預(yù)處理方法的過程中發(fā)現(xiàn)芍藥苷在血漿中存在室溫下降解的問題，通過查閱文獻(xiàn)得知芍藥苷的降解速率隨溫度的降低而降低，在4 ℃時(shí)基本穩(wěn)定[23]，故血漿樣品處理過程均嚴(yán)格控制在4 ℃下進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白沉淀法處理血漿樣本，在前期實(shí)驗(yàn)中分別用甲醇、乙腈兩種溶劑作為沉淀溶劑，通過計(jì)算回收率發(fā)現(xiàn)，使用甲醇沉淀更適用于婦科斷紅飲膠囊中3種有效成分。

本研究首次建立了同時(shí)測(cè)定婦科斷紅飲膠囊中多種有效成分在大鼠血漿中的定量分析方法，該方法線性關(guān)系良好，線性范圍寬，定量限低，方法穩(wěn)定、靈敏，精密度、回收率等均符合生物樣品定量要求。藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，重復(fù)給藥后芍藥苷的Cmax/AUC明顯升高，表明與單次給藥相比芍藥苷在體內(nèi)的吸收程度顯著下降，吸收速度加快。三七皂苷R1的CL下降、AUC（0-t）和AUC（0-∞）降低、MRT（0-t）顯著提高，表明與單次給藥相比，重復(fù)給藥后三七皂苷R1在體內(nèi)滯留時(shí)間延長(zhǎng)，推測(cè)其生物利用度有明顯提高。益母草堿的CL升高而其余參數(shù)無明顯差異。結(jié)合藥時(shí)曲線結(jié)果可知，大鼠單次給藥后，三七皂苷R1吸收快、消除快;益母草堿、芍藥苷吸收快，消除較慢。多次給藥后，大鼠體內(nèi)沒有芍藥苷和益母草堿蓄積，有少量三七皂苷R1積蓄。與單次給藥相比，多次給藥后主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生顯著改變，其科學(xué)內(nèi)涵仍待藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

中藥復(fù)方所含化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用具有多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)的特點(diǎn)，致使中藥復(fù)方研究往往遇到物質(zhì)基礎(chǔ)不清、作用機(jī)制不明、研究基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用脫節(jié)等問題[24]。而中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)就是連接中醫(yī)藥理論與臨床應(yīng)用的橋梁，是闡釋中藥如何發(fā)揮藥效的數(shù)據(jù)支撐[25]。本文以婦科斷紅飲膠囊為載體，考察其主要活性成分在大鼠體內(nèi)的時(shí)量關(guān)系，明確其體內(nèi)處置過程，為后續(xù)婦科斷紅飲膠囊臨床研究奠定基礎(chǔ)，并為中藥創(chuàng)制提供新思路。

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