一、研究背景

肌體皮膚常受到機(jī)械創(chuàng)傷，其感覺由外周感覺神經(jīng)元編碼，這些神經(jīng)元可分為感受非傷害性觸覺刺激的低閾值機(jī)械感受器和感受傷害性刺激的痛覺感受器。DRG 小直徑神經(jīng)元是痛覺神經(jīng)元，而中和大直徑神經(jīng)元優(yōu)先感受低閾值機(jī)械刺激。皮膚損傷通過激活傷害性感受器、損傷部位常駐或浸潤的非神經(jīng)細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞）導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放。組織巨噬細(xì)胞可分為神經(jīng)相關(guān)亞群和血管相關(guān)亞群。皮膚巨噬細(xì)胞亞群與外周神經(jīng)密切相關(guān)，并在受損時(shí)促進(jìn)后者再生。在神經(jīng)病理性疼痛時(shí)，巨噬細(xì)胞通過組織血管緊張素2 或補(bǔ)體5a 促進(jìn)痛覺。

神經(jīng)生長因子NGF 是一種分泌型小蛋白，參與多種急、慢性疼痛。NGF 在包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞中表達(dá)，通過多種機(jī)制作用于感覺神經(jīng)元促進(jìn)痛覺的傳遞。NGF 可增強(qiáng)感受傷害性離子通道的活性、基因表達(dá)和膜定位，而增高感覺神經(jīng)元的興奮性。人NGF突變導(dǎo)致遺傳性感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)V 型病變(HSAN-V)，其主要臨床表現(xiàn)是痛感缺失。HSAN-V 小鼠模型也表現(xiàn)出感覺神經(jīng)所支配區(qū)域的痛敏降低，但其機(jī)制是否通過NGF 調(diào)控仍有待明確。

該研究的作者偶然發(fā)現(xiàn)了一個(gè)缺乏痛敏的轉(zhuǎn)基因鼠品系，通過正向遺傳分析確認(rèn)Snx25是一個(gè)痛覺調(diào)節(jié)基因。SNX 蛋白有參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞器運(yùn)動等功能。該研究表明，真皮巨噬細(xì)胞 (dMacs) 中SNX25 通過抑制泛素化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 的降解、進(jìn)而促進(jìn)NGF 生成。dMacs 中的SNX25 通過NGF/TrkA 通路調(diào)控正常和病理狀態(tài)下的急性疼痛。因此，皮膚巨噬細(xì)胞-神經(jīng)元軸是在正常、神經(jīng)病理性或炎癥等條件下，皮膚感受疼痛的重要一環(huán)。

二、研究結(jié)果

1.Snx25+/-鼠對痛不敏感

先天性白質(zhì)腦病相關(guān)基因Mlc1轉(zhuǎn)基因鼠(Mlc1Tg) 與WT 鼠（C57BL/6J 背景）比較，表現(xiàn)出對機(jī)械痛敏降低。由于Mlc1Tg鼠具有129S6、CBA 和C57BL/6J 混合遺傳背景，所以Mlc1Tg鼠與C57BL/6J 鼠被回交七代后，再與C57BL/6J 背景的WT 鼠進(jìn)行比較研究。正常狀態(tài)下Mlc1Tg鼠表現(xiàn)出對vonFrey 纖毛檢測的機(jī)械刺激閾值（VF 閾值）增高、對皮內(nèi)注射5%福爾馬林引起的急性炎性疼反應(yīng)（福爾馬林反應(yīng)，如舔爪子、甩腳等反應(yīng)）顯著降低；在L4脊髓背角中也少見c-Fos+神經(jīng)元。Mlc1Tg鼠是細(xì)菌人工染色體 (BAC) 轉(zhuǎn)基因鼠，由于BAC 插入導(dǎo)致Snx25、Slc25a4和Cap97三個(gè)基因缺失。為研究Snx25對疼痛的調(diào)控功能，構(gòu)建了Snx25全敲鼠。Snx25+/-雄鼠的VF 閾值比WT 高，與Mlc1Tg鼠相似；Snx25+/-鼠對福爾馬林反應(yīng)也比WT 低。盡管2月齡的Snx25+/-鼠的熱傷害感受正常，但6～8 月齡的Snx25+/-鼠對熱刺激的反應(yīng)潛伏期比WT 長。

Snx25+/-鼠在SNI 模型時(shí)的機(jī)械痛敏比WT 明顯減弱。3 周齡和成年Snx25+/-鼠的DRG 中大、小直接感覺神經(jīng)元的數(shù)量、分布與同齡的WT 相近，表明痛覺異常不是因?yàn)樯窠?jīng)元亞群丟失所造成的；2 月齡Snx25+/-鼠后足皮膚中PGP9.5+纖維面積與2月齡WT 相當(dāng)，表明SNX25 缺失不影響外周感覺纖維的出芽/分枝等發(fā)育過程。

檢測疼痛相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，TRPV1 和TrkA 在Snx25+/-鼠DRG、坐骨神經(jīng)和脊髓中的表達(dá)比WT 鼠顯著降低。原代培養(yǎng)的Snx25+/-鼠DRG 神經(jīng)元，辣椒素誘導(dǎo)的Ca2+水平比WT 幅度??；Snx25+/-鼠DRG 中TRPV1、Scn9a（編碼NaV1.7）和Scn10a（編碼NaV1.8）的mRNA 表達(dá)比WT 低。表明Snx25+/-鼠的疼痛不敏感表型與其外周感覺神經(jīng)元中疼痛相關(guān)因子的表達(dá)減少有關(guān)。

2.特異性敲除DRG 神經(jīng)元內(nèi)Snx25 對疼痛仍敏感

Snx25fl/fl鼠與Advilin(Avil)CreERT2鼠雜交，并口服0.05%他莫昔芬 (TAM) 2 周以誘導(dǎo)基因重組，條件性敲除DRG 神經(jīng)元中的Snx25（Snx25Avil-cKO鼠）。在給予TAM 后第3 周，Snx25Avil-cKO鼠DRG 中SNX25 的表達(dá)顯著比Snx25fl/fl鼠低；但Snx25Avil-cKO鼠的VF 閾值和福爾馬林反應(yīng)正常，TRPV1、Scn9a和Scn10a的mRNA 表達(dá)也正常。表明DRG 神經(jīng)元中SNX25 不參與疼痛相關(guān)因子的表達(dá)和痛覺的調(diào)控。

3.骨髓源性巨噬細(xì)胞 (BMDMs) 的SNX25 調(diào)控痛覺

免疫組化研究顯示，Snx25+/-鼠后足皮膚中MHC-II+CD206+F4/80+巨噬細(xì)胞的數(shù)量以及CD206的表達(dá)與WT 相似。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Snx25+/-鼠BMDMs 的總體形態(tài)與WT 鼠比較沒有顯著差異。為了進(jìn)一步明確dMacs 對痛覺的貢獻(xiàn)，用WT 或Snx25+/-鼠的巨噬細(xì)胞相互移植制作巨噬細(xì)胞嵌合體鼠，在移植后28 天，發(fā)現(xiàn)接受Snx25+/-骨髓移植的WT 鼠的VF 閾值增高，而接受WT 骨髓巨噬細(xì)胞的Snx25+/?鼠的VF 閾值降低。

免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，Snx25+/-鼠在注射福爾馬林后3 天，Iba1+CD206+標(biāo)記的dMacs 比WT 鼠更少、趨化因子表達(dá)更低；在SNX25+/-鼠后足皮膚中的TGF-β 受體1 (TGF-βR1) 表達(dá)上調(diào)，該受體有抑制免疫反應(yīng)的作用，并可被SNX25 所降解；在注射后7 天，Snx25+/-鼠后足皮膚和DRG 中CCR2+免疫細(xì)胞浸潤程度低于WT，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上研究表明，SNX25 在BMDMs 的dMacs 中缺失，影響了正常和炎癥條件下的痛覺感受。

4.巨噬細(xì)胞特異性Snx 25cKO 鼠對痛覺不敏感

Snx25fl/fl鼠與Cx3cr1CreERT2/WT鼠雜交，培育出條件性敲除單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中SNX25鼠(Snx25Cx3cr1-cKO)。與Snx25fl/fl鼠比較，Snx25Cx3cr1-cKO鼠VF 閾值升高、福爾馬林反應(yīng)減少；DRG 中Scn9a和Scn10a表達(dá)也減少，而DRG 神經(jīng)元的大小與分布都正常；后足皮膚中Cxcl5、Cxcl2、Il1b和Cxcl3的mRNA 表達(dá)降低；皮 膚CD45+CD11b+F4/80+細(xì) 胞 中Ccl2、Ccl3、Ccl4和Cxcl2的mRNA 表達(dá)也降低，而CD11b+F4/80+細(xì)胞的比例沒有變化。表明dMacs 的SNX25 對化學(xué)刺激后的炎性痛以及正常狀態(tài)下的痛覺有貢獻(xiàn)。

為確定SNX25+dMacs 與外周神經(jīng)之間的關(guān)系，該研究將Snx25Cx3cr1-cKO鼠與Ai39Tg/+鼠雜交培育Snx25CX3cr1-Cko/Ai39Tg/+鼠，TAM 誘導(dǎo)黃色熒光蛋白(YFP) 在CX3CR1+MHC-II+標(biāo)記的dMacs 表達(dá)，而在CD117+肥大細(xì)胞中不表達(dá)。Snx25Cx3cr1-Cko/Ai39Tg/+鼠的真皮中，YFP+CX3CR1+標(biāo)記的dMacs 與PGP9.5+纖維相靠近，表明SNX25+dMacs 與外周感覺纖維密切相關(guān)；而免疫組化研究發(fā)現(xiàn)WT 鼠皮膚中的F4/80+細(xì)胞和CD206+細(xì)胞與PGP9.5+神經(jīng)末梢明顯共定位。

將Snx25Cx30cr1-cKO鼠骨髓移植到Snx25fl/fl鼠，制備骨髓巨噬細(xì)胞嵌合體，TAM 口服2 周進(jìn)行誘導(dǎo)，測試Snx25Cx3cr1-cKO鼠小膠質(zhì)細(xì)胞對疼痛不敏感是否有貢獻(xiàn)。TAM 誘導(dǎo)BMT 組的VF 閾值比BMT 前以及未誘前顯著升高；SNI 模型中，誘導(dǎo)組機(jī)械性痛敏較未誘導(dǎo)組減弱。表明在正常和神經(jīng)病理狀態(tài)下，調(diào)控痛敏的是dMacs 中的SNX25，而非小膠質(zhì)細(xì)胞中的SNX25。

5.SNX25 通過NGF 信號調(diào)控痛敏

Snx25+/?鼠在正常狀態(tài)和福爾馬林注射30 min后，后足皮膚中表達(dá)NGF 比WT 低；NGF 在WT 鼠MHC-II+F4/80+Iba1+標(biāo)記的dMacs 中原位表達(dá)，在Snx25+/-BMDMs 中的表達(dá)減少。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，Snx25+/-鼠的TrkA 在坐骨神經(jīng)結(jié)扎8 h 后的神經(jīng)結(jié)扎遠(yuǎn)端的積聚比WT 顯著減少，表明Snx25+/?DRG 中NGF/TrkA 復(fù)合物的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)減少。Snx25Cx3cr1-cKO鼠與Ai32Tg/+鼠雜交培育Snx25Cx30cr1-cKO/Ai32Tg/+鼠，通過YFP 來追蹤Snx25-KO 巨噬細(xì)胞，以檢測SNX25對調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞來源NGF 表達(dá)的作用。通過觀察誘導(dǎo)Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠的BMDMs 表達(dá)YFP，發(fā)現(xiàn)YFP+BMDMs 中Ngf的mRNA 表達(dá)比YFP?BMDMs中的明顯減少，表明SNX25調(diào)控Ngf的mRNA表達(dá)。接受Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠骨髓移植的WT 鼠，經(jīng)誘導(dǎo)后有44% MHC-II+dMacs 檢測到有Ai32Tg/+來源的YFP 表達(dá)。免疫印跡研究顯示，Snx25Cx3cr1-cKO鼠后足皮膚中NGF 表達(dá)比Snx25fl/fl鼠更低。

為研究dMacs 中Ngf的mRNA 表達(dá)，在WT鼠后背皮膚分選Lin?CD11b+CD64+Ly6C?MHC-II+標(biāo)記 的dMacs、Lin?CD11b+CD64?Ly6C+MHC-IIlo標(biāo) 記的真皮單核細(xì)胞 (dMonos) 和Lin?CD11b+CD64?Ly6C?MHC-II+標(biāo)記的真皮樹突細(xì)胞 (dDCs)。RT-qPCR 研究顯示，WT 鼠Snx25的mRNA 表達(dá)在dDCs 中低于dMacs 和dMonos，但dMacs 和dMonos 之間無 顯著性 差 異。Snx25+/?或Snx25Cx3cr1-cKO鼠dMacs中Ngf的mRNA 表達(dá)比WT 的dMacs 低；通過移植整個(gè)Snx-25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠的骨髓巨噬細(xì)胞到WT 鼠制備骨髓巨噬細(xì)胞嵌合體，在誘導(dǎo)后從受體鼠皮膚中分選MHC-II+YFP?標(biāo)記的dMacs 中的Ngf 的mRNA 表達(dá)，比供體來源的MHC-II+YFP+標(biāo)記的dMacs 要低；Snx25+/-鼠在皮內(nèi)注射NGF 24 h 后，檢測到VF 閾值恢復(fù)正常，而注射PBS 則沒有恢復(fù)。以上研究表明，dMacs中的SNX25通過調(diào)節(jié)NGF表達(dá)進(jìn)而調(diào)控痛敏。

6.SNX25 通過Nrf2 調(diào)節(jié)Ngf 的mRNA 表達(dá)

特異性siRNA 敲減BMDMs 中的Nrf2后可顯著降低Ngf的mRNA 表達(dá)。細(xì)胞Nrf2 的表達(dá)受泛素化和蛋白酶體降解的調(diào)控，該調(diào)控可被Keap1 蛋白阻斷。293T 細(xì)胞在蛋白酶體抑制劑MG132 處理后，多聚泛素化的Nrf2 蛋白增加，并在siRNA 敲減Snx25后進(jìn)一步升高；相反，與僅過表達(dá)Nrf2相比，293T 細(xì)胞在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)SNX25 和Nrf2 后，多聚泛素化的Nrf2 則降低。293T 細(xì)胞過表達(dá)鼠源的Snx25和Nrf2后，SNX25 與Nrf2 可免疫共沉淀；體外泛素化檢測發(fā)現(xiàn)，敲減Snx25的BMDMs 中泛素化Nrf2蛋白的表達(dá)比對照有所增加。Snx25+/-鼠后足皮膚中受Nrf2 調(diào)控的血紅素加氧酶1 比WT 有所減少，通過siRNA 敲減加速Nrf2 降解的Keap1，可以恢復(fù)Snx25+/?BMDMs中的Ngf表達(dá)。以上研究表明，SNX25 通過調(diào)控Nrf2 泛素化進(jìn)而調(diào)控Ngf的mRNA 表達(dá)。

7.SNX25 是dMacs 的關(guān)鍵痛覺調(diào)控因子

該研究在小鼠后足皮內(nèi)連續(xù)2 次注射Clodronate liposome 消除小鼠體內(nèi)的dMacs，用免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，在第2 次注射后3 天，Clodronate liposome處理鼠皮內(nèi)CD206+或MHC-II+巨噬細(xì)胞比脂質(zhì)體對照顯著減少，但VF 閾值增高；免疫印跡分析顯示，Clodronate liposome 處理鼠皮內(nèi)NGF、SNX25和CD206 的表達(dá)低于脂質(zhì)體對照組。表明在正常狀態(tài)下dMacs 是痛覺所必需的。

DRG 中的巨噬細(xì)胞可參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控。免疫組化共標(biāo)顯示，WT 和Snx25+/-鼠DRG 的MHC-II+巨噬細(xì)胞與PGP9.5+神經(jīng)相接近，CD206+或F4/80+巨噬細(xì)胞低中度表達(dá)Snx25。GFP+鼠的全骨髓巨噬細(xì)胞靜脈移植到WT 鼠后5 周檢測發(fā)現(xiàn)，約60%的MHC-II+DRG 巨噬細(xì)胞表達(dá)GFP，而坐骨神經(jīng)中的GFP+MHC-II+巨噬細(xì)胞很少，表明DRG 中發(fā)生了巨噬細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換。為檢測DRG 巨噬細(xì)胞對疼痛過敏的影響，研究者手術(shù)暴露Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+、Snx25fl/fl和Ai32Tg/+鼠的L4～5DRGs，注射4-OHT誘發(fā)條件性敲除DRG 內(nèi)的Snx25；在注射后第5 天用免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠DRG中檢測到Ai32Tg/+來源的YFP+巨噬細(xì)胞，Snx25fl/fl/Ai32Tg/+鼠則沒有；Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠DRG 中91% YFP+細(xì)胞是SNX25?，表明局部給予4-OHT誘導(dǎo)基因重組并成功條件性敲除SNX25。SNX25免疫熒光定量分析顯示，在注射4-OHT 后5 天，Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠DRG 內(nèi)CD206+巨 噬 細(xì) 胞僅14%是SNX25+（與Snx25fl/fl/Ai32Tg/+鼠比較），證實(shí)4-OHT 處理基本消除了DRG 巨噬細(xì)胞中的SNX25。注射4-OHT 后5 天，Snx25Cx3cr1-Cko/Ai32Tg/+鼠同側(cè)后足VF 閾值與對側(cè)接近、同側(cè)后足VF 閾值與注射前接近、且與Snx25fl/fl/Ai32Tg/+鼠VF 閾值接近，表明DRG 巨噬細(xì)胞中的SNX25 在正常條件下不參與痛覺調(diào)控。在正常狀態(tài)下，F(xiàn)4/80+DRG巨噬細(xì)胞表達(dá)NGF 較低，表明DRG 巨噬細(xì)胞對NGF 表達(dá)及疼痛傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制不同于dMacs，即dMacs 的SNX25 而非DRG 巨噬細(xì)胞內(nèi)的SNX25在正常狀態(tài)下調(diào)節(jié)急性疼痛。

三、討論

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)Snx25+/-鼠和Snx25Cx3cr1-cKO鼠在正常和誘導(dǎo)疼痛條件下都可以降低痛反應(yīng)。SNX25 通過抑制Nrf2 的泛素化和蛋白酶降解，以調(diào)節(jié)Ngf的mRNA 轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)一步維持dMacs 中Ngf 的生成。SNX25 的缺失加速了Nrf2 的降解而降低NGF 表達(dá)，從而導(dǎo)致對疼痛不敏感。

已證實(shí)HSAN-V病人的主要臨床表現(xiàn)是痛覺喪失，是由NGF 基因突變導(dǎo)致的。該研究在Snx25Cx3cr1-cKO鼠中減少NGF 表達(dá)在一定程度上模擬了HSAN-V 的病理，但該研究沒有繼續(xù)觀察NGF 缺失的長期效應(yīng)如神經(jīng)末梢退化和收縮等形態(tài)學(xué)改變。NGF 的中和單克隆抗體已在研發(fā)過程中，可能作為緩解頑固性疼痛的治療手段。盡管關(guān)節(jié)痛和骨壞死等意想不到的不良反應(yīng)阻礙了這些單克隆抗體進(jìn)入臨床，但NGF 仍然是研發(fā)鎮(zhèn)痛藥物的良好靶標(biāo)。dMacs 中SNX25/Nrf2 軸可能將HSAN-V 的無痛表型橋聯(lián)到痛敏狀態(tài)，可能成為代替抗NGF 單克隆抗體的非常有前景的藥物靶標(biāo)。但NGF 也可以由如角質(zhì)細(xì)胞等非炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，因此需要進(jìn)一步來研究調(diào)控外周NGF 的細(xì)胞和分子機(jī)制。