胡忠利,楊艷麗,胡忠亭

腎母細胞瘤腫瘤基因(Wilms′ tumor gene,WT1)最早被認為是腫瘤抑制基因[1],其表達水平與腫瘤密切相關(guān)。它位于11號染色體短臂的第3個帶[2]中,其編碼的mRNA通過兩個可變剪接形成4個異構(gòu)體[3],發(fā)生剪接的對應(yīng)位置分別位于外顯子9和10之間以及外顯子5上。骨髓增殖性疾病(myeloproliferative neoplasm,MPN)是一種伴有異?？寺⌒栽錾难翰4],發(fā)生于造血干細胞或祖細胞,以一種或多種外周血細胞增多為主要臨床特征,常伴有肝脾腫大、血栓形成、出血傾向及髓外造血[5]。MPN主要包括慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)、真性紅細胞增多癥(polycythemia vera,PV)、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia,ET)、骨髓纖維化(myelo fibrosis,MF)等。其中CML發(fā)生在早期祖細胞上,主要涉及髓系,外周血不成熟粒細胞顯著增多,95%病人骨髓中可以發(fā)現(xiàn)Ph染色體,即特征性t(9;22)(p34;q11)染色體移位,和/或bcr/abl融合基因陽性[6]。本研究采用RQ-PCR檢測56例MPN病人骨髓細胞WT1基因的表達,研究WT1基因在亞型不同的MPN中的相對表達量的差異及其差異的特征性總結(jié)與臨床的相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有MPN病人均選自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科,住院時間為2020-2021年;其中男36例,女20例;中位年齡45歲。其中CML 25例,其余MPN 31例中PV 15例,ET 12例,MF 4例。56例MPN病人白細胞數(shù)值為(1.5～200.27)× 109/L ,血小板數(shù)值為(3～558)×109/L。對病人常見體征、血常規(guī)和骨髓行詳細檢查和診斷。病人符合目前國內(nèi)白血病的分型標(biāo)準(zhǔn)[7]。MPN基因的定性檢測及P210基因與WT1基因的定量檢測,均采用 EDTA 抗凝備用。

1.2 檢驗方法

1.2.1 骨髓細胞學(xué)檢查 于骼后上棘抽取骨髓液,制作骨髓涂片,加入瑞氏染色+緩沖液1∶2染色,借助顯微鏡對于細胞的數(shù)量及外形進行觀察和記錄。鏡下數(shù)500個有核細胞,依據(jù)FAB形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)進行分型。CML病人可見骨髓增生極度活躍,嗜酸細胞嗜堿細胞比例顯著升高。MPN可見骨髓增生活躍,粒系增生活躍,血小板散在及中大簇多見,顯示增多(見圖1～2)。

1.2.2 基因檢測WT1的檢測:通過TRIzol提取物完成細胞的總RNA提取,在-80 ℃的溫度下儲存以用作備用。解凍上述 TRIzol溶解后得到的白細胞,解凍完成后,需要用三氯甲烷、異丙醇、DEPC-H2O+75%乙醇處理,并在DEPC-H2O中溶解至適當(dāng)濃度。制備RNA樣品并在MX3000型PCR儀器上擴增。同時做內(nèi)參基因ABL絕對拷貝數(shù)定量檢測,WT1表達量=WT1絕對拷貝數(shù)/ABL絕對拷貝數(shù)×104。

MPN基因檢測:通過DNA提取試劑盒進行DNA提取以制備DNA樣品,其在MX3000型PCR儀器上擴增。檢測突變體非受體酪氨酸激酶基因的突變(JAK2V167F)、血小板生成素受體(MPL)突變、鈣網(wǎng)蛋白(CARL)突變(L367fsX46、K385fsX47),同時室內(nèi)對照野生型作為內(nèi)參。

P210基因檢測:同WT1基因步驟相同制備RNA樣品,并在MX3000型PCR儀上擴增。同時做內(nèi)參基因ABL絕對拷貝數(shù)定量檢測,P210表達量=P210絕對拷貝數(shù)/ABL絕對拷貝數(shù)。

1.2.3 染色體核型檢測 采用骨髓細胞短期培養(yǎng)法制片,熱變性姬姆薩R顯帶,平均分析中期細胞數(shù)15～20個,染色體核型分析根據(jù)《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN1995》的規(guī)定進行。檢查結(jié)果見圖3、4。

1.2.4 根據(jù)CML病情進展分組 根據(jù)血液病診療標(biāo)準(zhǔn),CML慢性期(CML-CR):骨髓與外周血原始細胞比例<10%;CML加速期(CML-AP ):外周血或骨髓中原始細胞10%～<20%,或外周血嗜堿細胞值≥20%;CML急變期(CML-BP):骨髓或外周血原始細胞≥20%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用χ2檢驗、方差分析及獨立樣本t檢驗和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各類型MPN病人WT1的表達特征 各類型MPN病人中WT1基因的陽性率存在差異,MPN病人中共有PV 15例,ET 12例,MF 4例,CML 25例。由于各非CML的MPN組WT1的表達率較低,故合并為一組(非CML組)進行比較。結(jié)果顯示,CML組WT1陽性率與非CML組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),CML組的WT1陽性病例中WT1數(shù)值與非CML組WT1陽性病例比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

表1 不同亞型MPN病人WT1的表達比較

2.2 不同基因類型的MPN病人WT1的表達差異 本研究中MPN病人共有6種基因型表達,其中JAK2V167F+基因型26例,L367fsX46+基因型3例,MPL+基因型1例,K385fsX47+基因型1例,P210+基因型24例,P230+基因型1例。由于非P210+MPN的基因型中WT1陽性表達率較低,故合并為一組(非P210+組)進行比較。結(jié)果顯示,P210+組的WT1陽性率高于非P210+組(P<0.01),P210+組WT1陽性病例的WT1數(shù)值與非P210+組WT1陽性病例比較亦差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。

表2 不同基因類型的MPN病人中的WT1表達

2.3 CML病人WT1及P210的表達量與病程進展的關(guān)系WT1和P210基因在CML疾病進程的不同階段表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表3),WT1的數(shù)值隨著CML進入加速期而明顯升高,部分緩解時WT1的數(shù)值則明顯下降。

表3 WT1表達與CML病程發(fā)展之間的關(guān)系

3 討論

MPN是由于細胞的惡性發(fā)展而誘發(fā)疾病[8],是一類克隆性異常增生的血液腫瘤[9]。美國SEER數(shù)據(jù)庫中,PV、ET、MF的發(fā)病率分別為10.9/100 萬、9.6/100萬和 3.1/100 萬,中位發(fā)病年齡分別為65、68和70歲[10],中位生存時間分別為15、18和4.4年[11]。JAK2、MPL 和 CALR作為 MPN 的驅(qū)動基因,通過激活 JAKSTAT 信號通路,導(dǎo)致骨髓細胞異常增殖[12]。

既往研究[13]顯示,100例MPN病人中,大約有30例可發(fā)展為急性髓系白血病(AML),這些病人往往預(yù)后不良,有些病人甚至可能進展為難治性AML。MPN的確切發(fā)病機制已在世界范圍內(nèi)被探索,一些學(xué)者認為該疾病可能是由DNA甲基化引起的,導(dǎo)致腫瘤抑制基因沉默,并且認為JAK2V167F基因的突變和MPN的發(fā)生有一定的有關(guān)性[14]。另外,在25%～35%的ET和MF病人中檢測到CARL基因的體細胞突變[15],而MPL突變也存在與少數(shù)ET和MF的病人中。這些突變的發(fā)現(xiàn)極大地方便了對MPN的診斷。上述3種基因的突變導(dǎo)致JAK/STAT信號的異?；罨头只毎淖灾鞒砷L,因此它們被認為是“DRIVER”基因突變。

JAK是一類非受體型酪氨酸激酶[16],作用于細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中。JAK2基因V16F突變是近年來MPN發(fā)病機制研究中的重要發(fā)現(xiàn),其從根本上揭示了BCR-ABL陰性MPN的致病機制[17]。目前,JAK2V16F基因突變已成為MPN的診斷性標(biāo)志,除難治性貧血伴環(huán)狀鐵粒幼細胞和ET中發(fā)現(xiàn)高比率JAK2AV16F突變,其他惡性血液病很少發(fā)現(xiàn)此突變[18]。JAK2結(jié)合促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子和促血小板生成素等細胞因子受體使JAK相關(guān)的激酶激活[19],導(dǎo)致下游JAK-STAT激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異?；罨?其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(RAS/MAPK、PI3K/AKT)也被異常激活,共同參與調(diào)節(jié)造血細胞的增殖和分化[20]。MPL是JAK2的一個同源受體,MPLW515突變導(dǎo)致MPL跨膜近膜結(jié)合部位的色氨酸被亮氨酸/賴氨酸替換。MPL突變可存在于少數(shù)的ET和MF病人中[21],MPL突變的細胞可呈現(xiàn)與JAK2突變類似的效應(yīng)。CARL基因突變定位在染色體19p13.2,包含9個外顯子,編碼鈣網(wǎng)織蛋白,且發(fā)現(xiàn)突變位點均發(fā)生在第九號外顯子上[22]。 CML是MPN的一種常見類型,病人多慢性起病,病程進展緩慢,而CML的分期與外周血或骨髓原始細胞百分比有關(guān)[23],隨著病程的進展原始細胞的比例已相應(yīng)增加,這對判斷疾病的進展及預(yù)后有一定價值。

隨著血液病診斷技術(shù)的發(fā)展,血液病的診斷早已不再局限于骨髓細胞學(xué),基因檢測已成為新的參考。新診斷病人的診斷不僅限于白血病的分類,而是更多地關(guān)注預(yù)后和藥物治療相關(guān)的指標(biāo)[24]。以WT1基因作為代表,該基因可以抑制造血細胞的增殖,阻礙基因的分化轉(zhuǎn)錄,同階段調(diào)整細胞凋亡水平[25]。WT1基因與造血細胞的增殖、分化及凋亡有關(guān),WT1基因可以促進造血干細胞增殖和阻礙其分化,其檢測分析是評估血液系統(tǒng)惡性疾病重要的風(fēng)險指標(biāo)之一[26]。在對WT1基因相對表達量的分析中發(fā)現(xiàn),隨著疾病的進展WT1的表達量也增加,表現(xiàn)出明顯的階段性,因此我們推測,WT1陽性率與CML病人的原始細胞成正相關(guān),且隨著原始細胞比例的增加WT1的陽性表達率及相對表達量已增加,而在正常成熟血細胞中幾乎不表達。說明WT1基因在調(diào)節(jié)造血干細胞的增殖、分化中發(fā)揮重要作用[27]。WT1基因有可能是JAK2信號途徑的下游基因之一。WT1蛋白梭基末端為指蛋白結(jié)構(gòu)域,具有較強的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,可以增強或抑制特異靶基因的表達,其靶基因主要與細胞生長、代謝、分化及凋亡等有關(guān)。在血液系統(tǒng)腫瘤尤其是急性白血病中,WT1基因呈高表達,WT1基因表達水平的高低與白血病的預(yù)后呈負相關(guān),可能主要發(fā)揮癌基因的作用[28]。國外研究[29]表明,JAK2V617F 純合突變的細胞株HEL和UKE-1,WT1呈陽性表達;在HEL和UKE-1細胞株培養(yǎng)過程中加入JAK2抑制劑后,WT1表達水平明顯下降[30];表明WT1表達水平的高低與 JAK2的活性相關(guān)。以往的報道[31]亦證實,WT1基因在MPN中表達較正常對照組陽性率升高(41.7)。本研究發(fā)現(xiàn),CML組WT1陽性率與非CML組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且P210+組的WT1陽性率高于非P210+組,P210+組WT1陽性病例的WT1數(shù)值與非P210+組WT1陽性病例比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義。

此外在本研究中發(fā)現(xiàn)在CML的不同疾病進展階段WT1均有不同程度的表達,加速期及急變期的WT1表達水平明顯高于部分緩解期。WT1表達量與病人的P210的表達量成正相關(guān),且隨著病程的進展而發(fā)生變化,表現(xiàn)出明顯的階段性,這表明WT1基因的表達隨 CML 的臨床進展而表達逐漸增加。進展期病人WT1的表達量相對較高,這對病人的診治及預(yù)后評估有一定臨床意義。

綜上,WT1基因在CML中的表達有一定的特異性,隨著病情的進展而變化,并與P210基因的表達水平相關(guān)。未來在臨床中WT1基因可與P210基因一起作為CML病人診斷的有效指標(biāo),用于臨床上CML的判斷及了解預(yù)后。