李琬晴,蔡玲玲,郭麗媛,王 瑩,劉思含,計 廣,張豐川

黃褐斑是常見的難治性面部損容性皮膚病,對病人心理影響較大[1]。據(jù)調查顯示,患有色素代謝障礙的病人中同時患有抑郁癥的比例高達36%[2]。隨著醫(yī)療衛(wèi)生水平的提高,人們愈加關注損容性皮膚病,有關黃褐斑的實驗及臨床研究也越來越多,盡管如此,本病的機制及病因尚不明確,一般認為與紫外線照射、遺傳因素、局部炎癥反應、內分泌紊亂等密切相關[3]。1930年Stokes與Pillsbury提出“腸-腦-皮膚軸”的概念以來[4],越來越多的研究提示皮膚疾病與腸道菌群的變化密不可分。皮膚和腸道表現(xiàn)呈生物學二態(tài)性,在構成免疫屏障方面具有類似的功能[5]。目前多項研究發(fā)現(xiàn)皮膚病可引起腸道菌群的改變,而腸道菌群紊亂也可導致皮膚的變化[6],二者有相似的神經(jīng)支配通路機信號轉導系統(tǒng)[7]。腸道菌群影響人體的免疫防御能力以及各類營養(yǎng)物質的新陳代謝,腸道菌群紊亂會導致免疫系統(tǒng)和機體內分泌的失衡,從而誘發(fā)皮膚色素代謝異常[8],因此,研究黃褐斑與腸道菌群的內在聯(lián)系,也是探索本病病因與機制的新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2022年3-7月來北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院皮膚科門診就診的30例黃褐斑病人(研究組),以來本院體檢中心進行常規(guī)體檢的20名正常人作為對照組。所有研究對象近2周未用過微生物制劑(包括含乳酸菌的食品),近4周內未用過抗生素、糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物。排除合并胃腸道疾病或有消化系統(tǒng)疾病病史者;患有嚴重的內分泌疾病及代謝性疾病者;具有特定飲食習慣或飲食極不規(guī)律者。2組性別、年齡[(45.30±10.58)vs(44.61±9.72)]均具有可比性,并簽署知情同意書。

1.2 糞便樣品收集和DNA提取 收集2組人群的新鮮糞便樣品置于無菌凍存管中,-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用CTAB對樣本的基因組DNA進行提取,之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量的樣品于離心管中,使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1.3 16S rRNA測序 根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶Barcode的特異引物,和高保真DNA聚合酶對選定V3-V4(上下游引物序列分別為CCT AYG GGR BGC ASC AG和GGA CTA CNN GGG TAT CTA AT)可變區(qū)進行PCR擴增。根據(jù)PCR產物濃度進行等濃度混樣,充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產物,選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列,割膠回收目標條帶。使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測,合格后,使用NovaSeq 6000進行上機測序。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用獨立樣本t檢驗。利用物種豐度表,使用R語言繪制組間物種菌落組成柱狀圖。采用R語言執(zhí)行wilcoxon秩和檢驗來分析α多樣性,并使用Unifrac繪制PCA圖。此外,使用Spearman秩檢驗對差異菌群的豐度進行相關性分析,探究腸道菌群與臨床病情評分的潛在關聯(lián)性。

2 結果

2.1 樣本測序數(shù)據(jù)分析 研究組與對照組ASV韋恩圖分析:50份糞便樣品共得到2 923 699條序列,最終形成ASV 3 178個,研究組與對照組共有ASV 834個,研究組特有ASV 1 586個,對照組特有ASV 758個(見圖1)。

2.2 腸道微生物α多樣性分析 2組的稀釋曲線趨向平坦,表明所選定的測序深度可以滿足研究需要,繼續(xù)增加數(shù)據(jù)量只會導致很少數(shù)的新物種被檢測到(見圖2)。

α多樣性指標用于表征樣品內的微生物群落多樣性。反映群落豐富度的 observed_otus、pielou_e和chao指數(shù),以及反映群落多樣性的shannon和simpson 指數(shù),研究組均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。研究組比對照組的腸道菌群群落豐富度和多樣性均發(fā)生了一定變化(P<0.01)(見表1)。

表1 α多樣性參數(shù)的比較

2.3 腸道微生物β多樣性分析 通過PCA分析提取數(shù)據(jù)中最主要的信息,即最能反映樣品差異變化的信息,并繪制二維坐標圖,橫坐標PC1(6.42%)與縱坐標(5.78%)分別代表影響群落組成的2組因素,百分比代表對樣品差異的貢獻值,各組樣本分布有一定的集中趨勢又存在一定的離散趨勢(見圖3),說明不同組別之間是有差異的,存在自己獨有的和不同的組間相似的腸道菌群結構,同一組內分離可能是影響個體腸道群落組成的因素較多。

2.4t檢驗 在門水平上,擬桿菌門(Bacteroidota)在黃褐斑病人中相對豐度較低;厚壁菌門(Firmicutes)、放射菌門(Actinobacteriota)在黃褐斑病人中相對豐度較高(見圖4)。

在綱水平上,擬桿菌綱(Bacteroidia)、厚壁菌綱(Negativicutes)在黃褐斑病人中相對豐度較低;芽孢桿菌綱(Bacilli)、放線菌綱(Actinobacteria)在黃褐斑病人中相對豐度較高(見圖5)。

在目水平上,擬桿菌目(Bacteroidales)在黃褐斑病人中相對豐度較低;乳桿菌目(Lactobacillales)、雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)在黃褐斑病人中相對豐度較高(見圖6)。

在科水平上,普雷沃菌科(Prevotellaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)在黃褐斑病人中相對豐度較低;毛螺菌科(Lachnospiraceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)在黃褐斑病人中相對豐度較高(見圖7)。

在屬水平上,普雷沃氏菌(Prevotella)、擬桿菌屬(Bacteroides)在黃褐斑病人中相對豐度較低;布勞特氏菌(Blautia)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)在黃褐斑病人中相對豐度較高(見圖8)。

3 討論

本研究利用16S rRNA測序方法對30例成年黃褐斑與20名成年健康對照組的腸道細菌群16S rRNA基因V3 ～ V4區(qū)進行測序分析,研究組與對照組共擁有834個相同ASVs,物種組成多樣性分析結果顯示,對于腸道微生物α多樣性結果顯示,研究組均低于對照組(P<0.05),α多樣性指數(shù)顯示2組樣本腸道微生物群組成的多樣性存在顯著性差異;腸道微生物β多樣性主坐標分析PCA圖結果顯示,除個別樣本存在偏差,研究組和對照組基本呈現(xiàn)在不同區(qū)域,說明組間樣本群落組成差異性較大,組內樣本間群落組成更相似。

YATSUNENKO等[9]通過對531人的糞便樣本中的細菌種類以及其中110人的基因含量進行表征,研究了美國居民與其他兩個國家的居民在細菌組合和功能基因庫方面的差異性,結果顯示尤其在嬰兒早期和成年期細菌組合和功能基因庫方面存在明顯差異,不同國家的個體之間的微生物組存在顯著差異。本研究因來就診的黃褐斑病人中僅有極少部分為男性,且男性黃褐斑病人均未配合給予糞便樣本,故本研究納入的黃褐斑病人與健康對照組均為女性,年齡方面具有可比性。因嬰幼兒與成人微生物群組具有差異性,故本研究只納入成人樣本;并且在樣本采集中充分考慮了胃腸道疾病、消化道系統(tǒng)疾病病史、患有嚴重的內分泌疾病及代謝性疾病者、飲食習慣等因素,采取無菌凍存管收集樣本,符合研究人源腸道微生物菌群的標本采集原則。

本研究對2組樣本進行菌群差異分析發(fā)現(xiàn)在各分類水平下差異有統(tǒng)計學意義,在門、綱、目、科、屬、種分類水平下,均發(fā)現(xiàn)擬桿菌在黃褐斑病人中相對豐度較低,擬桿菌作為人類常駐菌群,是人腸道中一類豐度較高的腸道菌群,約占腸道微生物總數(shù)的25%[10],在人類腸道中有助于分解食物并產生身體所需的營養(yǎng)和能量,與人類具有共生關系,它們可以提供一定程度的保護,以免受侵入性病原體的侵害,而本研究顯示擬桿菌在黃褐斑病人中相對豐度較低,可能受到一定病原體的侵害。

1989年 Strachan 提出“衛(wèi)生假說”[11],即隨著衛(wèi)生水平的提高、人體對外界微生物暴露不足,導致多種過敏性疾病的發(fā)病率不斷增高。該研究認為生命早期微生物的暴露不足使得免疫平衡傾向于Th2反應,使Th2反應異常激活,免疫特應性風險增加。隨后“衛(wèi)生假說”得到了“飲食-微生物”和“免疫偏差假說”理論的完善[4]。這兩種理論認為近些年來人類飲食傾向于肉類,減少了粗糧、蔬菜等富含高纖維食物的攝入,造成腸道菌群改變、破壞人體免疫穩(wěn)態(tài),其穩(wěn)態(tài)是維持機體不受致病病原體感染的重要保護因素之一[12]。普雷沃菌屬主要產物是琥珀酸、乙酸等短鏈脂肪酸,其分解植物纖維的能力較強,而分解蛋白質及脂肪的能力較弱,膳食中的纖維可促進腸道中普雷沃菌豐度增加,高脂高蛋白飲食則降低腸道中普雷沃菌的豐度[13],因而飲食習慣偏向素食較多的人群的腸道中普雷沃菌屬豐度相對較高[14]。本研究發(fā)現(xiàn)普雷沃菌屬在黃褐斑病人中相對豐度較低,提示可能與黃褐斑的發(fā)病有關。

在目、科、屬分類水平下,乳桿菌在黃褐斑病人中相對豐度較高,有研究發(fā)現(xiàn),腸道中的乳桿菌對應激反應和抑郁癥有益[15-16],ADAMS等[17]報道孤獨癥譜系障礙病人常出現(xiàn)胃腸道并發(fā)癥,其胃腸道癥狀的嚴重程度與腸道內的雙歧桿菌和乳桿菌等密切相關,另外,乳桿菌在結腸炎病小鼠中具有較高的豐度[18-19],說明乳桿菌可能維持了免疫的平衡。

布勞特菌屬于厚壁菌門[20],毛螺菌科,是健康人體腸道微生物群的重要成員之一。LUU等[21]發(fā)現(xiàn),在乳腺癌病人中,高豐度的布勞特氏菌與不良預后具有相關性。本實驗結果也發(fā)現(xiàn)了黃褐斑病人腸道菌群中布勞特氏菌的豐度明顯增加,這可能為黃褐斑發(fā)病的潛在致病菌。

本文基于16S rRNA基因測序研究的黃褐斑病人腸道菌群差異存在一定的局限性,不足之處在于樣本量相對較少,且未能在其他菌種水平下進一步分析腸道菌群與黃褐斑的關系,未來需要更先進的研究手段來揭示腸道菌群在黃褐斑疾病中的作用機制,探索黃褐斑與腸道菌群的內在聯(lián)系。