劉源，惠以寧，姜冰，鄭艮子，王瑤

1.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院預防保健科，四川 瀘州（646000）；2.西南醫(yī)科大學口腔醫(yī)學研究所，四川 瀘州（646000）；3.口頜面修復重建和再生瀘州市重點實驗室，四川 瀘州（646000）；4.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州（646000）

人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）是來源于人恒牙/乳牙牙髓的外胚層間充質(zhì)干細胞，適當誘導下具有良好的多向分化能力，為組織再生提供細胞來源［1］。研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可影響hDPSCs增殖，低濃度LPS 促進hDPSCs 合成期細胞增多，促進其增殖、遷移；高濃度LPS 可使hDPSCs DNA 總量減少、蛋白合成降低、增殖能力降低、抑制堿性磷酸酶能力活性，減弱成骨向分化能力，嚴重可引起細胞死亡［2-3］。因此，積極探索有利于LPS 所致炎性環(huán)境下hDPSCs 分化的細胞干預條件，有助于為骨再生和牙齒再生提供新的治療思路。

發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）紅光亮度高、方向性強、相干性好，可對研究對象施加照射后產(chǎn)生光化學效應，不會造成局部溫度明顯提高，并且不會對組織或細胞造成不可逆損傷［4］。有實驗研究表明，LED 紅光影響牙髓干細胞生長速率、克隆潛能以及成骨和軟骨細胞分化［5］。由此可見LED 紅光可對牙髓干細胞的分化產(chǎn)生影響，但LED 紅光對LPS 所致炎性環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化的影響鮮有報道。

細胞的分化受到信號通路和細胞因子的調(diào)控，有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路介導細胞外信號誘導的核反應，有4 個亞族：細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶5（extracellular regulated protein kinases 5，ERK5），在調(diào)節(jié)細胞因子、黏附分子、趨化因子，調(diào)節(jié)系統(tǒng)性炎癥反應中起著重要作用［6］。本實驗擬通過LPS 構建體外炎性環(huán)境，探究LED 紅光調(diào)控hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化及作用機制，為牙和頜骨缺損修復機制提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

本實驗已通過西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院倫理審批（批號：20211119003）。

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM（BI，以色列）；優(yōu)級胎牛血清（四季青生物，中國）；0.25%胰酶細胞消化液（碧云天生物，中國）；LPS（索萊寶，中國）；BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天生物，中國）；0.2%茜素紅染液（索萊寶，中國）；一抗（鼠抗人）：CD34-APC、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE 抗 體（Ebioscience，美國）；二抗（羊抗鼠）：HRP-Goat anti Mouse（ASPEN，中國）；一抗（兔抗人）：GAPDH（ab181602, Abacam，英國）、JNK、p-JNK（#9252，#4668，CST，美國）、p38、p-p38（AF6456，#4511，Affbiotech，美 國）、ERK1/2、p - ERK1/2（ab184699，ab201015，Abacam，英國）、ERK5、p-ERK5（#3552，#3371，CST，美國）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）（ab133602，Abacam，英國）、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）（DF7731，Affbiotech，美國）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）（PA5-120492，Thermofisher，美國）、牙本質(zhì)涎 磷 蛋 白（dentin sialo phospho protein，DSPP）（DF14398，Affbiotech，美國）；二抗（羊抗兔）：HRPGoat anti Rabbit（AS1107，ASPEN，中 國）；U0126（MCE，美國）；SB203580（MCE，美國）；SP600125（MCE，美國）；BIX02189（MCE，美國）；CCK-8 試劑盒（APExBIO，美國）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（碧云天生物，中國）；堿性磷酸酶檢測試劑盒（碧云天生物，中國）；SYBR Green PCR 試劑盒（ELK，中國）；ELISA 試劑盒（凡科維，中國上海）；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（碧云天生物，中國）。LED 紅光燈（T6，芮森，中國）；酶聯(lián)免疫檢測儀（MultiskanTMFC，Thermo，美國）；倒置相差熒光顯微鏡（DMi8，Leica，德國）；熒光定量PCR 儀（QuantStudio6 Flex System，Life Technologies，美國）；SDSPAGE 電泳儀（165-8000，Bio rad，美國）。

1.2 hDPSCs 的分離、培養(yǎng)、鑒定

取西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院頜面外科拔除的新鮮健康的第三磨牙或因正畸治療需要拔除的前磨牙，用含20%（v/v）青霉素-鏈霉素的PBS 清洗至無明顯血污，無菌條件下沿牙髓長軸劈開，拔髓針取出牙髓組織，PBS 沖洗后眼科剪剪碎組織，Ⅰ型膠原酶消化、終止、離心重懸后得到單細胞懸液。加入含15%（v/v）青霉素-鏈霉素FBS、1%（v/v）青霉素-鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2細胞孵箱中培養(yǎng)，隔3 d 半換液。細胞長出后記為原代，當生長密度達80% ～85%時，用胰酶消化傳代，取生長狀態(tài)好的P3 代細胞進行后續(xù)實驗。

取第3 代細胞，適量PBS 重懸細胞，各加入CD34-APC、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE 抗體，避光條件下孵育30 min，流式細胞儀檢測表面抗原標志物。取第3 代細胞以2×104個/mL 密度接種于6 孔板中，待細胞長至80%密度后開始成骨誘導和成脂誘導。誘導7 d 行ALP 染色，21 d 行茜素紅染色和油紅O 染色，并分別采集鏡下圖。

1.3 LPS 濃度篩選

hDPSCs 經(jīng)0.25%胰酶消化，離心，終止后以2×103個/孔、200 μL/孔均勻接種細胞至96 孔板中，接種完畢后在接種有細胞的孔周圍封閉一圈PBS。37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)過夜后，次日更換為含不同濃度LPS（0、1、5、10 μg/mL）的普通培養(yǎng)基，每組設置3 個復孔，隔2 d 換液。分別于培養(yǎng)第1、3、5、7 天同一時間使用CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖活力，使用酶標儀測定在450 nm 波長處OD 值。

1.4 LED 紅光能量測定

根據(jù)課題組前期實驗測量［7］，當LED 紅光發(fā)射燈距離高精度光功率計2 cm 時，根據(jù)公式：光功率密度（W/cm2）=光總功率（W）/單位面積（cm2），測定光功率密度為66.7 mW/cm2，通過公式輻照曝光量（J/cm2）=光功率密度（W/cm2）×時間（s），計算得出輻照曝光量分別為2、4、6、8、10 J/cm2時，所需輻照時間為30、60、90、120、150 s。輻照第一天記為1 d，隔48 h 輻照一次。

1.5 LED 紅光對炎癥環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化的影響

根據(jù)實驗1.3 結(jié)果，10 μg/mL 為后續(xù)LPS 刺激濃度。設置CG（礦化誘導）組、LPS+CG 組及LPS+CG+不同能量（2、4、6、8、10 J/cm2）光照組；礦化誘導培養(yǎng)基為10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 μg/mL 維生素C+10 mol/L 地塞米松+10%（v/v）FBS+1%（v/v）青霉素-鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基。hDPSCs 經(jīng)0.25%胰酶消化、終止、離心后，加入完全培養(yǎng)基以2×104個/mL 密度接種至培養(yǎng)皿中，細胞融合至70%后按分組加入相應誘導液并進行光照。

1.5.1 ALP 染色及活性測定 細胞處理第7 天根據(jù)BCIP/NBT 顯色試劑盒說明書，細胞清洗、固定后進行堿性磷酸酶避光染色15 min，倒置顯微鏡下采集各組圖像。處理第7 天，細胞漂洗后每皿加入細胞裂解液，12 000 rpm 離心5 min，收集總蛋白溶液。根據(jù)BCA 試劑盒說明書，酶標儀測定波長為562 nm 的各孔OD 值，繪制蛋白標準曲線并計算各處理組蛋白濃度。根據(jù)堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書，96 孔板設置空白孔，標準品孔以及樣品孔并加入相應工作液，每孔設置2 個副孔。輕吹混勻后37 ℃孵育10 min，酶標儀測定波長為450 nm 的各孔OD 值。根據(jù)公式計算各處理組ALP 活性。

1.5.2 qRT-PCR 檢測hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化相關基因 細胞處理第7 天，Trizol 法提取細胞總RNA，將已提取的總RNA 65 ℃變性5 min，立即轉(zhuǎn)入冰上操作。依次加入2 μL 的5*RT Master Mix、RNA template，Nuclease-free Water 補 足 至10 μL。溶解混勻后，以37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min；4 ℃程序進行反應反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBR Green PCR 試劑盒說明書進行PCR 擴增，反應 程 序 為：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；56 ℃，10 s，72 ℃，25 s，循環(huán)40 次；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。引物序列見表1。根據(jù)公式2-ΔΔCT計算ALP、OSX、DMP-1、DSPP 基因相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.5.3 茜素紅染色及鈣結(jié)節(jié)定量測定 細胞處理第21 天根據(jù)茜素紅染色說明書，細胞清洗、固定后使用茜素紅S 染液染色5 min，倒置顯微鏡下采集各組圖像。每組培養(yǎng)皿中加入1 mL 氯化十六烷吡啶溶液，充分溶解，根據(jù)分組向96 孔板中加入200 μL 溶解液，每實驗組設置2 個復孔，調(diào)零孔加入200 μL 氯化十六烷吡啶溶液。使用酶標儀測定在562 nm 波長處OD 值。根據(jù)公式計算各處理組鈣結(jié)節(jié)。

1.6 ELISA 法測定炎癥細胞因子表達

根 據(jù) 實 驗1.5 結(jié) 果，4 J/cm2是LED 紅 光 調(diào) 節(jié)10 μg/mL LPS 所致炎性環(huán)境下成骨/成牙本質(zhì)分化的最佳能量，后續(xù)選擇4 J/cm2對細胞進行輻照。設置分組：LPS+CG 組，LPS+CG+LED 組。

取hDPSCs 以2×104個/mL、2 mL/皿接種于培養(yǎng)皿中，細胞融合至70%后按分組加入相應誘導液并進行LED 紅光輻照，記為實驗第1 天，每3 d 更換培養(yǎng)基。分別于實驗第1、3、5、7 天無菌管收集培養(yǎng)基液體（包括已換液培養(yǎng)基），3 500 rpm × 20 min離心，仔細收集上清液，吹打混勻后分別收集1 mL上清液。根據(jù)ELISA 試劑盒說明書，96 孔酶標包被板進行加樣與加酶，每孔設置2 個副孔。封板后37 ℃溫育60 min，重復洗滌5 次并拍干，加入顯色劑后37 ℃避光顯色15 min，終止反應后酶標儀上測定波長為450 nm OD 值。根據(jù)公式計算各處理組在1、3、5、7 天細胞分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）濃度。

1.7 Western blot測定MAPK信號通路相關蛋白表達

細胞處理第7 天，提取各處理組細胞總蛋白。SDS-PAGE 電 泳 將20 μg 蛋 白 轉(zhuǎn) 移 到PVDF 膜 上。5%脫脂牛奶封閉1h，去除封閉劑后，4 ℃加入一抗（p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK5、ERK5、GAPDH）過夜。TBST 洗滌3 次，加入稀釋的二抗，室溫孵育30 min。TBST 洗滌4 次后，配制ECL 溶液進行化學發(fā)光，并通過Alpha-EaseFC 軟件分析目標帶的OD 值。GAPDH 作為參考蛋白，計算LPS+CG組與LPS+CG+LED組ERK1/2、p38、JNK、ERK5 及磷酸化蛋白相對表達量。

設置LPS+CG 組、LPS+CG+LED 組、LPS+CG+LED+U0126（抑 制ERK1/2）組、LPS+CG+LED+SB203580（抑制p38）組、LPS+CG+LED+SP600125（抑制JNK）組、LPS+CG+LED+BIX02189（抑制ERK5）組。細胞處理第7 天，Western blot 法檢測各處理組ALP、OSX、DMP-1、DSPP 蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

SPSS 27.0 進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差進行描述，兩組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。使用GraphPad Prism 6繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs 的培養(yǎng)與鑒定

牙髓組織培養(yǎng)第7 天鏡下可見組織塊周圍有細胞貼壁長出，從中央向四周放射狀生長，細胞形態(tài)為梭形，類似成纖維細胞樣。傳代后可見細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)均勻一致（圖1a& 1b）。

Figure 1 Culture and identification of hDPSCs圖1 hDPSCs 的培養(yǎng)與鑒定

第三代hDPSCs 表面抗原檢測結(jié)果為：間充質(zhì)干細胞表面抗原標志物呈陽性表達：CD44、CD73、CD90 的表達率依次為99.93%、93.75%、99.81%：造血系統(tǒng)來源細胞表面抗原標志物陰性表達：CD34、CD45 的表達率依次為0.68%、0.09%（圖1c）。成骨誘導7 d 后，ALP 染色鏡下細胞呈藍紫色（圖1d）。成骨誘導21 d 后，茜素紅染色鏡下見大小不一的紅染鈣結(jié)節(jié)分布于細胞之間（圖1e）。成脂誘導21 d后，油紅O 染色示鏡下細胞復層排列，橘紅色脂滴出現(xiàn)在部分細胞胞漿內(nèi)（圖1f）。

2.2 不同濃度LPS 溶液對hDPSCs 增殖的影響

CCK-8 示第1、3、5、7 天，0 μg/mL LPS 組與1 μg/mL LPS 組增殖無顯著差異（P= 0.894，P=0.998，P= 0.965，P= 0.870）。5 μg/mL LPS 組在第5 天增殖低于0 μg/mL LPS 組、1 μg/mL LPS 組（P＜0.001，P＜0.001）。10μg/mL LPS 組在第5、7 天增殖低于0 μg/mL LPS 組、1 μg/mL LPS、5 μg/mL LPS組（第5 天：P＜0.001，P＜0.001，P= 0.009，第7 天：P＜0.001，P＜0.001，P= 0.002）（圖2）。由此可見，LPS 濃度為5、10 μg/mL 時，均可降低hDPSCs增殖能力，但10 μg/mL LPS增殖抑制作用強于5 μg/mL，因此本實驗選擇10 μg/mL 作為后續(xù)實驗誘導炎癥微環(huán)境的刺激濃度。

Figure 2 Effect of different concentrations of lipopolysaccharides on the proliferation of human dental pulp stem cells圖2 不同濃度脂多糖溶液對人牙髓干細胞增殖的影響

2.3 LED 紅光對炎癥環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化的影響

LED 紅光輻照hDPSCs 7 d 后，ALP 染色結(jié)果顯示LPS+CG 組較CG 組稍淺，光照組藍染程度均高于LPS+CG 組（圖3a）。ALP 定量結(jié)果顯示LPS+CG組ALP 活力低于成骨組（P= 0.007），光照組ALP 活力均高于CG 組與LPS+CG 組（均P＜0.001），LPS+CG+4 J/cm2組ALP 活力高于其他光照組（均P＜0.001）（圖3b）。

第7天qRT-PCR檢測礦化基因ALP、OSX、DMP-1、DSPP 表達結(jié)果顯示，CG 組與LPS+CG 組無顯著差異（P= 0.968，P= 0.267，P= 0.902，P= 0.449）。LPS+CG+2 J/cm2、4 J/cm2、6 J/cm2、8 J/cm2組均高于CG 組與LPS+CG 組（P＜0.05）。LPS+CG+4 J/cm2組高于LPS+CG+2 J/cm2、6 J/cm2、8 J/cm2、10 J/cm2組（vs.LPS+CG+6 J/cm2，ALP：P= 0.017；OSX：P=0.001；DMP-1：P= 0.007；DSPP：P= 0.013，其余均P＜0.001）。且LPS+CG+8 J/cm2組OSX、DMP-1、DSPP 表達低于LPS + CG + 6 J/cm2組（P= 0.016，P= 0.013，P＜0.001），LPS+CG+10 J/cm2組ALP 表達低于LPS+CG+8 J/cm2組（P= 0.004）（圖4）。

Figure 4 Effect of LED red light on the expression of mineralization related genes in human dental pulp stem cells in inflammatory environment圖4 LED 紅光對炎癥環(huán)境下人牙髓干細胞礦化相關基因表達的影響

LED 紅光輻照21 d 后，茜素紅染色結(jié)果顯示CG 組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目多于LPS+CG 組，LPS+CG+4 J/cm2鈣結(jié)節(jié)染色數(shù)目多且較大，較其他LPS+CG+光照組鈣結(jié)節(jié)染色深（圖5a）。鈣結(jié)節(jié)定量結(jié)果顯示LPS+CG 組鈣結(jié)節(jié)定量少于CG 組（P＜0.001），LPS+CG+光照組鈣結(jié)節(jié)定量均多于LPS+CG 組與CG 組（均P＜0.001），LPS+CG+4 J/cm2組鈣結(jié)節(jié)定量多于其他LPS+CG+光照組（均P＜0.001）（圖5b）。

Figure 5 Effect of LED red light on the formation of calcium nodules in osteogenic/odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells in inflammatory environments圖5 LED 紅光對炎性環(huán)境下人牙髓干細胞成骨/成牙本質(zhì)分化鈣結(jié)節(jié)形成的影響

2.4 LED 紅光影響炎性環(huán)境下hDPSCs 礦化時炎癥因子的表達

ELISA 結(jié)果顯示，細胞分泌TNF-α 與IL-1β 的趨勢均為先升后降。第1 天，TNF-α 與IL-1β 的分泌無明顯差異（P= 0.887，P= 0.066）。第3 天，LPS+CG 組的TNF-α 與IL-1β 的分泌表達量均高于第1 天（P＜0.001，P= 0.034），LPS+CG+LED 組的TNF-α 與IL-1β 分 泌 量 高 于 第1、5、7 天（P＜0.001），且LPS+CG 組的分泌量低于LPS+CG+LED組（P＜0.001）。第5 天，LPS+CG 組的TNF-α 與IL-1β 的 分 泌 表 達 量 高 于 第1、3、7 天（均P＜0.001），LPS+CG 組的分泌量高于LPS+CG+LED 組（P＜0.001）。第7 天，LPS+CG 組與LPS+CG+LED組的TNF-α 與IL-1β 的分泌表達量低于第5 天（P＜0.001），且LPS+CG+LED 組的分泌表達量低于LPS+CG 組（P= 0.002，P= 0.011）（圖6）。

Figure 6 Effect of LED red light on the expression of inflammatory factors during mineralization of human dental pulp stem cells in inflammatory environment圖6 LED 紅光對炎性環(huán)境下人牙髓干細胞礦化時炎癥因子表達的影響

2.5 LED 紅光介導MAPK 信號通路調(diào)控炎癥環(huán)境下牙髓干細胞成骨/成牙本質(zhì)分化

MAPK 信號通路蛋白表達如圖7，第7 天，LPS+CG+LED 組的p-ERK1/2、p-p38、p-JNK 的相對表達量高 于LPS+CG 組（P＜0.001），LPS+CG+LED 組的p-ERK5 相對表達量高于LPS+CG 組（P=0.003）。

Figure 7 Effect of LED red light on the expression of MAPK signaling pathway during mineralization of human dental pulp stem cells in inflammatory environment圖7 LED 紅光對炎性環(huán)境下人牙髓干細胞MAPK 信號通路表達的影響

未加MAPK 通路阻滯劑時，LPS+CG 組ALP、OSX、DMP-1、DSPP 蛋白表達量均低于LPS+CG+LED 組（P＜0.001）;加 入MAPK 通 路 阻 滯 劑 后，LPS+CG+LED+U0126（抑 制ERK1/2)、LPS+CG+LED+SP600125（抑制JNK)、LPS+CG+LED+BIX02189（抑制ERK5)組ALP、OSX、DMP-1、DSPP 蛋白表達量均低于LPS+CG+LED 組（ALP：LPS+CG+LEDvs.LPS+CG+LED+SP600125（抑制JNK），P= 0.004，其余均P＜0.001）；LPS+CG+LED+SB203580（抑制p38）組的ALP、OSX、DMP-1 蛋白表達量與LPS+CG+LED 組相比較無顯著差異（P= 0.065，P=0.193，P= 0.099），DSPP 蛋白表達量低于LPS+CG+LED 組（P＜0.001）（圖8）。

Figure 8 Effects of LED red light on the osteogenic/odontoblastic differentiation proteins of human dental pulp stem cells in inflammatory environment through MAPK signaling pathway圖8 LED 紅光調(diào)控MAPK 信號通路對炎性環(huán)境下人牙髓干細胞成骨/成牙本質(zhì)分化蛋白的影響

3 討 論

hDPSCs 來源于人牙髓組織，免疫原性低，具有高增殖能力，提供合適的外部誘導，在誘導因素胞外基質(zhì)、細胞因子和物理因子等作用下，可以被定向誘導分化，是再生醫(yī)學中具有前景的間充質(zhì)干細胞［8］。有研究報道，LED 紅光影響牙髓干細胞的細胞周期、線粒體膜電位和衰老［9］；5 J/cm2的LED紅光促進高糖環(huán)境下牙周膜干細胞增殖和成骨分化，減 輕 氧 化 損 傷［10］；2 J/cm2、4 J/cm2LED 紅 光（850 nm，80 mW/cm2）顯著提升乳牙牙髓干細胞活力、總蛋白產(chǎn)量、ALP 活力以及ALP、Col-I 基因表達［11］。不同能量密度LED 紅光對間充質(zhì)干細胞的增殖、分化有影響。低或不足的能量密度，未達到生物刺激閾值，不會發(fā)生細胞反應；較高則可能破壞光感受器，導致生物調(diào)節(jié)效應降低［12］，合適的LED 紅光輻射劑量才能對間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生積極的生物學效應。

成骨/成牙本質(zhì)分化是牙齒形成的基礎，也是骨生成的關鍵步驟。在hDPSCs 生長分化的炎性環(huán)境中，由于0、1μg/mL LPS 的增殖速率無明顯差異，5、10 μg/mL 的增殖速率依次降低，與劉影等［13］研究結(jié)果一致，因此選擇10 μg/mL LPS 誘導炎癥微環(huán)境。本實驗中hDPSCs 在10 μg/mL LPS 刺激下的礦化誘導比單純礦化誘導7 d ALP 染色稍淺及活力測定稍低，說明10 μg/mL LPS 對hDPSCs 的成骨/成牙本質(zhì)分化效應為抑制，與Sattari 等［2］報道的LPS 對DPSCs 的分化效應一致。LED 紅光輻照LPS致炎環(huán)境下的hDPSCs，比LPS 礦化誘導下和單純礦化誘導下ALP 染色、茜素紅染色更深，ALP 活力和鈣結(jié)節(jié)定量測定值更高，RT-PCR 檢測的成骨特異性基因ALP、OSX 與成牙本質(zhì)特異性基因DMP-1、DSPP 相對表達量更高，說明LED 紅光正向調(diào)控炎性環(huán)境下的hDPSCs 的成骨/成牙本質(zhì)分化。其中，4 J/cm2能量密度LED 紅光輻照hDPSCs，ALP 染色、ALP 活力測定、RT-PCR、茜素紅染色及鈣結(jié)節(jié)定量測定結(jié)果最佳，說明4 J/cm2能量密度是LED 紅光上調(diào)10 μg/mL LPS 致炎環(huán)境下促成骨/成牙本質(zhì)分化的最佳輻照能量。

有研究報道4 J/cm2LED 紅光上調(diào)牙周膜干細胞ALP、Runt 相關轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等基因和蛋白表達，促進干細胞成骨和成血管分化［7，14］。還可以上調(diào)牙乳頭干細胞的DMP-1、DSPP、BSP、ALP 和Runx2 基因和蛋白的表達，促進干細胞成牙本質(zhì)和成骨分化［15-16］。本實驗也發(fā)現(xiàn)4 J/cm2LED 紅光促成骨/成牙本質(zhì)分化能力最強，隨能量密度的增加，其成骨向分化能力呈依賴式下降，符合物理治療中Arndt-Schulze 法則：弱刺激引起生命活動，中等刺激促進生命活動直到達峰值，強烈刺激抑制生命活動直到產(chǎn)生負反應，最強刺激使生命活動停止［17］。

研究報道LPS 可以通過TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路誘導牙髓干細胞分泌TNF-α、IL-8、IL-12，引起牙髓損傷［18］；Zhai 等［19］研究發(fā)現(xiàn)LPS 刺激hDPSCs 后，炎癥介質(zhì)IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α 基因和蛋白表達升高。本實驗中LPS 作為炎癥刺激源，處理hDPSCs 后釋放TNF-α 和IL-1β 等炎性介質(zhì)，培養(yǎng)液中炎性介質(zhì)濃度升高則會引起hDPSCs 增殖與分化的緩慢抑制，與前面報道一致。本研究示10 μg/mL LPS 成骨/成牙本質(zhì)誘導培養(yǎng)下，非光照組TNF-α 和IL-1β 分泌量在第5 天達到高峰，第7 天炎癥反應得到緩解；4 J/cm2LED 紅光組炎性介質(zhì)分泌在第3 天達到高峰且高于非光照組，第5 天炎癥反應得到緩解，可能是由于4 J/cm2LED 紅光加速了炎癥反應的進程。第5、7 天時，4 J/cm2LED 紅光組TNF-α 和IL-1β 分泌量低于非光照組。說明4 J/cm2LED 紅光在促進炎性環(huán)境下成骨的同時，減少了炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的釋放，從而達到抗炎的目的，該結(jié)果與其他研究［20］報道的LED 紅光光療下調(diào)炎性因子與趨化因子的表達一致。

間充質(zhì)干細胞成骨/成牙本質(zhì)分化是一個由多種礦化基因調(diào)控、多種信號通路共同參與的一個復雜分化過程。MAPK 信號通路有4 個亞族：ERK1/2、JNK、p38 與ERK5。其中ERK 信號通路主要調(diào)控細胞生長和分化，p38 與JNK 信號通路的主要生理效應主要與炎癥、細胞凋亡、應激反應有關［21］。因此，物理刺激因素可能激活部分或全部MAPK 亞族通路。本研究中LED 紅光促進MAPK信號通路蛋白p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、p-ERK5 表達增高，提示ERK1/2、JNK、p38、ERK5 可能參與了LED 紅光促進炎癥環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化的過程。LED 紅光分別聯(lián)合信號通路ERK1/2特異性阻滯劑U0126、JNK 特異性阻滯劑SP600125以及ERK5 特異性阻滯劑BIX02189 干預hDPSCs時，ALP、OSX、DMP-1、DSPP 礦化蛋白相對表達量低于LPS+CG+LED 組，說明LED 紅光激活了ERK1/2、JNK、ERK5 亞通路，也有可能MAPK 阻滯劑加入后誘導干細胞凋亡，成骨/成牙本質(zhì)分化向分化細胞數(shù)目減少，導致礦化蛋白部分表達下調(diào)有關［22］。然而LED 紅光聯(lián)合信號通路p38 特異性阻滯劑SB203580 干預hDPSCs 時，LPS+CG+LED+SB203580 組與LPS+CG+LED 組礦化蛋白表達量無明顯差異，可能是由于LED 紅光未激活p38 信號通路，或者是因為SB203580 有效抑制炎癥因子（如IL-1β、TNF-α）誘導的部分信號轉(zhuǎn)導［23］，逆轉(zhuǎn)了炎性因子所導致的成骨抑制。因此LED 紅光可能通過激活MAPK 信號通路中的ERK1/2、JNK、ERK5 亞通路，來促進炎癥環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化。這些MAPK 亞通路的激活與Yamauchi 等［24］研究LED 紅光所激活的通路一致。

綜上，本研究探討了能量密度為2 ～10 J/cm2的LED 紅光調(diào)控10 μg/mL LPS 致炎環(huán)境下hDPSCs成骨/成牙本質(zhì)分化，其中4 J/cm2的LED 紅光促成骨/成牙本質(zhì)分化效應最佳，且減少炎癥因子分泌，同時ERK1/2、JNK、ERK5 通路參與LED 紅光調(diào)控炎性微環(huán)境下hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)分化。不同的參數(shù)指標（光源、波長、能量密度、輸出功率、照射頻率、細胞與光源發(fā)射器之間的距離等）對干細胞具有不同的生物學效應，探索治療的最佳參數(shù)有利于為牙髓干細胞的體外處理技術提供實驗數(shù)據(jù)支持。

【Author contributions】Liu Y designed the study, performed the experiments and wrote the article.Hui YN, Jiang B, Zheng GZ designcd the study, performed the experiments and analyzed the data.Wang Y designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.