王浩，金焰，吳楠

0 引言

腫瘤的無限增殖能力，使其對營養(yǎng)物質和氧氣的需求加強，當現(xiàn)有的血管無法滿足腫瘤生長時，就需要形成新的血管以獲取所需。目前研究大多數(shù)將腫瘤分為無血管與有血管兩個階段：在無血管期（直徑＜3 mm），腫瘤從其鄰近組織獲取營養(yǎng)物質，并在鄰近組織簡單擴散；而當進入有血管期（直徑≥3 mm）后，腫瘤進展加快，體積迅速增大，轉移及侵襲能力迅速增強。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移與血管生成密切相關。因此，研究腫瘤血管生成的原因、現(xiàn)象及機制對于腫瘤防治十分重要，其中血管生成研究方法作為血管生成相關研究的方法學支撐，占據(jù)重要地位[1]。

1 腫瘤血管生成的研究方法

在進行腫瘤血管生成研究時，細胞功能學方面可評估血管內皮細胞的增殖、遷移能力；形態(tài)學方面可評估形成的血管長度、面積、微血管密度、分支點數(shù)量、萌芽數(shù)量等表型的改變；血管整體功能方面可評估血管滲透、灌注、缺氧、黏附連接、成熟度來進行定量分析，多方面綜合評估血管生成能力[2]。目前，眾多血管生成實驗并不僅僅只對單一評價指標進行測量，在選擇實驗時可根據(jù)實驗目的及實驗條件參考表1進行適當?shù)慕M合選擇。

表1 血管生成實驗適用指標Table 1 Applicable index of angiogenesis experiment

1.1 內皮細胞功能實驗

細胞遷移實驗包括博伊登小室實驗與劃痕實驗，是實驗室常用測定細胞遷移能動性的主力軍。經(jīng)過長期的發(fā)展，兩種實驗已具備十分成熟、標準化的實驗流程及設備，使實驗顯得更加簡單、精確，并在可重復性與高通量作業(yè)上得到了顯著的提升[3]。在此基礎上，隨著具有孵育模塊的延時錄像顯微鏡[4]及計算機圖像算法[5-6]的發(fā)展，出現(xiàn)了隨機遷移實驗，不再拘泥于分析終點數(shù)據(jù)或圖像，而是可以在細胞遷移過程中進行實時動態(tài)分析，并可從中獲取單個細胞的軌跡以及其遷移的關鍵參數(shù)，如速度、方向、方向持續(xù)性等。經(jīng)Visweshwaran對實驗技術的優(yōu)化，該實驗已可在三維層面進行[7]，所得結果較二維平面可能會具有更高的預測價值。

目前已有大量細胞增殖實驗方式，可根據(jù)不同評估標準或實驗目的對實驗方式進行擇優(yōu)選擇。其中，細胞計數(shù)是測量細胞增殖最直接的方法之一，也被認為是衡量增殖的金標準。另外也可通過檢測細胞代謝活性、細胞內ATP含量或利用細胞增殖標志物、DNA labeling等來間接反應細胞的增殖能力，常用方法包括CCK-8[8]、MTT法[9]、流式細胞術[10]或Fucci技術[11]等。但其實驗方式大多對細胞具有一定的損傷，在實驗選用時需注意每種實驗的特性。此外，目前已經(jīng)開發(fā)完成不同原理的具有無標記、自動化、實時、無損的細胞監(jiān)測平臺，如Agelent公司的xCELLigence RTCA和Nikon公司出品的Eclipse Ti2-E等。

1.2 血管形態(tài)實驗

小管形成實驗是一種經(jīng)典模擬人體內血管生成過程的實驗，操作性強、簡單快捷、利于大規(guī)模實驗，是目前被各實驗室廣泛用以研究血管生成的基礎實驗方法。原理是將原代人臍靜脈內皮細胞靜態(tài)培養(yǎng)在基質膠上，利用內皮細胞的成管能力形成管腔型結構，后經(jīng)電子顯微鏡或免疫熒光成像后結合圖像分析軟件對血管生成的長度、數(shù)量、分支點數(shù)量及面積等進行分析。在進行實驗時值得注意的是，內皮細胞并不是唯一具有成管能力的細胞，在與其他細胞共培養(yǎng)時要注意區(qū)分[3,12]。

膠原管腔實驗是在小管形成實驗基礎上優(yōu)化改進后，更進一步還原體內三維組織狀態(tài)的血管生成實驗[12]。其最初是利用膠原夾心法將內皮細胞種植于兩膠原中，但由于其實驗方式，管腔無法隨機在三維環(huán)境中形成，不能充分模擬三維環(huán)境。隨后經(jīng)過改進，將單個內皮細胞隨機包埋在基質膠中，并加入所必須的生長因子，如血管內皮細胞生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF-2）等[13]。所得結果正如前文所提，較于二維平面實驗更加具有預測價值，并且所形成的管腔更加完整、邊界更加清晰，有利于隨后的分析。纖維蛋白珠實驗是一種可以形成三維血管樣結構的實驗方法。其原理是將內皮細胞鋪在一種纖維蛋白凝膠珠上，再將其嵌入基質膠中，以促進內皮細胞在三維空間中成管。隨后利用顯微鏡結合圖像分析軟件對單個珠子的血管生成進行評估，量化萌芽數(shù)量、長度、吻合支數(shù)量等。相較于傳統(tǒng)的小管形成實驗中所形成的二維網(wǎng)狀血管結構而言，其模擬的三維結構更接近于體內天然血管網(wǎng)絡，且因內皮細胞種植于珠子表面，在一定程度上也模擬了血管單層內皮細胞的結構[14]。

視網(wǎng)膜外植體培養(yǎng)實驗是一種完整、快速提取新生小鼠視網(wǎng)膜用以評估和量化發(fā)育中的血管對藥物、抑制劑或某種物質反應的技術。該實驗允許在體外生理環(huán)境中急性刺激或抑制內皮細胞的細胞功能，是一種易于管理和高度靈活的實驗方式，不僅可用以量化評估血管生成數(shù)量、長度等，也可用來在血管生成萌發(fā)的復雜場景中，探索內皮細胞中尖端細胞表型運動的分子機制。同樣可以通過轉基因供體小鼠或者通過慢病毒、CRISPR-Cas9技術處理視網(wǎng)膜以進行基因層面的研究。由于視網(wǎng)膜取出后生理環(huán)境的改變或物理干擾及損傷，通常會導致血管系統(tǒng)退化或細胞死亡增加，因此并不適宜長時間培養(yǎng)觀察[2,15]。

小鼠尿囊膜實驗是將尿囊膜從小鼠胚胎分離后，培養(yǎng)至體外以研究血管生成能力的一種實驗方式。與視網(wǎng)膜外植體培養(yǎng)實驗有所不同的是，血管生成始于遠端尿囊，對哺乳動物的胎盤血管化起重要作用，該實驗為研究原始血管叢的重塑、血管生成的萌芽以及壁細胞募集導致的毛細血管網(wǎng)絡的成熟等特性提供了強有力的工具。但該實驗中，尿囊膜培養(yǎng)存活時間較短，并且需要實驗人員具有扎實的處理胚胎小鼠的經(jīng)驗[16]。

主動脈環(huán)實驗源于二十世紀八十年代，目前被廣泛用于研究血管生成基本機制和測試促/抗血管生成化合物的效果。該實驗是將大/小鼠的主動脈取出后剪為血管環(huán)，植入基質膠或三維水凝膠中，在體外模擬血管生成，對血管生成萌發(fā)、分支等進行評價。與其他血管生成實驗或模型相比，主動脈環(huán)實驗的天然內皮細胞在培養(yǎng)過程中更接近于體內生理狀態(tài)，保留了其原有生理特性。但其與視網(wǎng)膜外植體培養(yǎng)相似，可能會因外部原因造成損傷。另外，在進行免疫組織化學染色時，凝膠厚度對于抗體的穿透性至關重要，需謹慎選擇[17]。

角膜血管生成實驗由Folkman團隊提出，利用兔角膜的解剖學特征建立了體內血管生成系統(tǒng)。原理是將腫瘤細胞或組織樣本、血管生成誘導因子等引入角膜產(chǎn)生的微囊中，用裂隙燈立體顯微鏡進行一定時間的觀察并采集圖像，以評估血管生成能力。此后，該實驗進一步拓展至嚙齒動物（小鼠和大鼠）上，相較于兔子而言，成本較低且可結合基因工程鼠模型來研究特定的分子相關性。但由于體型較小，操作難度有所提升，而在兔子中，實驗更易操作[18-19]。

雞胚絨毛尿囊膜實驗長久以來一直是研究哺乳動物的經(jīng)典模型，目前也被廣泛用于血管生成研究。其實驗方案已有眾多變化，但基本原理大致相同[20]。經(jīng)典實驗方式是將孵化的雞蛋上制作一個窗口，通過該窗口將待測成分放置于雞胚尿囊膜上，重新封窗之后定期檢查并測量結果。在評估血管生成時，其量化標準是高度可變的，要獲得統(tǒng)計學意義需要多個樣本。目前，已開發(fā)出多種用于血管評估的方法，包括注射熒光示蹤劑、MRI、血管鑄型和PET成像等[21]。此外，已發(fā)展出人造蛋殼，結合特殊的微流控小室，使血管評估和動力學研究更加便捷可靠[22]。

1.3 血管功能實驗

基質膠栓實驗是在動物皮下空間注射由基質膠混合藥物或測試因子形成栓子，使血管生長至栓子內一段時間后取出進行分析[23]。由于基質膠的光學半透明性和高滲透性，該實驗非常適合與各種熒光標記技術結合和3D圖像的生成，可用于小管形成、血管滲透性等各類血管生成能力評估。其在血管生成實驗中相對用途廣、成本低、操作簡便，大多數(shù)實驗室均可實現(xiàn)。但仍需注意動物的選擇、基質膠的處理等。與基質膠栓實驗相似的還有海綿植入實驗[24]、圓盤血管生成系統(tǒng)[25]及海綿-基質膠實驗，都是將不同類型的材料混合待測因子植入實驗動物體內來獲取結果。

血管化微器官平臺（vascularized micro-organ platform, VMO）是一種利用微流控技術在三維基質中形成可灌流血管網(wǎng)絡的技術。多采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成一種具有多通道的透明實驗平臺，利用微流控技術形成高壓和低壓微血流通道，利用其壓力差在血管生成或發(fā)育中驅動物質流通凝膠基質，誘導血管生成。與其他實驗不同的是，VMO中內皮細胞暴露于流體力與剪切力下，其同樣也是誘導血管生成的因素[26]。VMO可以在整個血管形成過程中進行成像和定量特定的參數(shù)，如血管網(wǎng)絡長度、分支和吻合支等，可進行實時測量，另外也可根據(jù)灌流不同分子量的葡聚糖來測定血管滲透性[27-29]。

內皮細胞共培養(yǎng)球體是將腫瘤細胞與內皮細胞共培養(yǎng)的一種模擬體內環(huán)境的研究方法。對分析內皮細胞與腫瘤間質或實質之間相互作用、血管生成能力等研究都具有寶貴的價值。該方法操作性、靈活性極強，可結合其他血管生成研究方法進行組合研究。球體的產(chǎn)生方式有很多種，如懸滴法、磁懸浮法、懸浮培養(yǎng)法等。在進行實驗時，細胞的選擇和培養(yǎng)基的選用十分重要，不同細胞的配對組合對結果的產(chǎn)生具有決定性的作用，而選用的培養(yǎng)基需要能夠為每種類型的細胞提供足夠的營養(yǎng)，又不會過度刺激細胞產(chǎn)生增殖[30-31]。

動物腫瘤模型在腫瘤研究中已經(jīng)廣泛普及，擁有眾多類型，在腫瘤血管生成中也具有相當多的選擇。目前，常見模型包括轉基因腫瘤小鼠模型、斑馬魚模型、爪蟾蝌蚪模型等。其中，小鼠模型是目前實驗室中較為常見的實驗模型，其成瘤方法及檢測手段較為成熟，如人源腫瘤異種移植模型、基因工程小鼠模型和自發(fā)及誘發(fā)性腫瘤模型。斑馬魚和爪蟾蝌蚪模型在腫瘤血管生成研究中同樣具有相當突出的優(yōu)點，源于其透明特性，利用轉基因熒光報告系統(tǒng)標記血管后，可輕松實現(xiàn)體內血管的可視化和評估[32-34]。

動物模型對于評估血管生成能力是必不可少的一環(huán)，其為研究腫瘤血管生成提供更接近人體內的生理環(huán)境，結合活體成像技術[35-37]，特異性標記技術等[38]，可對血管生成能力進行有效的評估。

2 結語與展望

腫瘤的血管生成相關分子機制對腫瘤治療、藥物研發(fā)都具有十分重要的意義。目前來看，血管生成相關實驗雖有十足進展，但仍然無法完美地模擬出體內的生理環(huán)境，使其在不同條件下的實驗結果具有易變性。在研究時，單一實驗無法對血管生成能力進行全面的評估，需要結合多種實驗來進行綜合評定。相信隨著高新技術的發(fā)展，未來血管生成的研究環(huán)境會更趨近于體內環(huán)境，實驗方式會變得更加智能化、標準化、自動化，得到更加準確、可靠的信息，其實驗手段也會更加簡便、可靠。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。