余慧林,王建豐,劉 義,劉玉堯,蔣 薇,孟承穎,王 歡,胡德林

膿毒癥是由于機體對感染的反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的多器官功能衰竭[1]。燒傷患者由于皮膚屏障功能被破壞,以革蘭陰性菌為主的病原體更易入侵機體造成感染引發(fā)膿毒癥[2]。大部分革蘭陰性菌的致病力與其細(xì)胞壁最外層的脂多糖相關(guān)。目前膿毒癥的病理生理機制尚不明確,而內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能障礙在膿毒癥的多器官損傷和死亡中起著重要作用[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白(VE-cadherin)的水平與膿毒癥病情嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性[4]。內(nèi)皮屏障功能的破壞往往伴隨著VE-cadherin酪氨酸磷酸化的增加和細(xì)胞連接處聚合肌動蛋白絲(F-actin)聚合的減少[5]。目前膿毒癥的治療主要是通過連續(xù)血液濾過清除炎癥細(xì)胞因子,減輕炎癥反應(yīng),從而改善預(yù)后,尚無針對分子水平的治療。該研究旨在通過檢測連續(xù)血液濾過治療前后炎癥細(xì)胞因子及內(nèi)皮通透性相關(guān)基因表達(dá)變化,探討膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 膿毒癥患者血清收集及連續(xù)血液濾過處理根據(jù)膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn),收集5例行連續(xù)血液濾過治療前后的膿毒癥患者血清,并進(jìn)行無菌處理,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?yīng)用 ELISA 法檢測濾過前后血清中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、Ras同源基因家族成員A (Ras homologue A, RhoA)、白細(xì)胞介素1(interleukin-1,IL-1)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長檢測各樣品吸光度(optical density,OD)值,所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2 主要試劑和儀器DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司,RNA提取試劑盒購于Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo Fisher公司,Real-time PCR試劑盒購于TaKaRa 公司,DEPC水、一抗稀釋液購于碧云天生物技術(shù)研究所,蛋白提取及定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司,Western blot聚丙烯酰胺凝膠試劑盒購于上海雅酶生物醫(yī)藥有限公司,廣譜彩虹預(yù)染蛋白 Marker、ECL超敏發(fā)光試劑盒購于Thermo Fisher 公司,VE-cadherin 抗體、F-actin 抗體購于 Abcam 公司,山羊抗小鼠 IgG(HRP)、山羊抗兔 IgG(HRP)購于 Bioworld 公司,酶標(biāo)儀Multiskan GO 1510購于美國Thermo Fisher 公司,細(xì)胞培養(yǎng)箱 MCO-18AC 購于日本松下公司,普通 PCR 儀器2720購于美國ABI公司,-80 ℃超低溫冰箱 8950086A 購于美國 Thermo Fisher公司,熒光定量 PCR 儀 7500購于美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇凍存的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),于DMEM 完全培養(yǎng)基中吹打混勻,放入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度為 80%時,根據(jù)實驗設(shè)計進(jìn)行后續(xù)實驗。應(yīng)用 10%的濾過前后血清干預(yù)HUVEC 24 h,檢測膿毒癥血清對 HUVEC通透性的影響;同時,應(yīng)用Real-time PCR、Western blot 和免疫熒光法分別檢測其對VE-cadherin 和 F-actin mRNA 及蛋白表達(dá)的影響。

1.3.2構(gòu)建 TLR4 低表達(dá)株 根據(jù)TLR4(NM_138557)基因序列設(shè)計、合成 3 條干擾序列,干擾序列片段如下,TLR4-RNAi-I:5′-TATTCAAAGATACA-CCAGCGG-3′;TLR4-RNAi-Ⅱ:5′-ATATTAAGGTAG-AGAGGTGGC-3′;TLR4-RNAi-Ⅲ:5′- AAATTCTCCC-AGAACCAAACG-3′。并將其構(gòu)建至質(zhì)粒載體(GV298)上。Lipofectamine 3000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,檢測分析各序列的干擾效率。選取干擾效率最高的序列(shRNA-Ⅰ),應(yīng)用濃度為 1.0 μg/ml嘌呤霉素篩選6周,構(gòu)建 TLR4 低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(TLR4-shRNA)。檢測TLR4低表達(dá)對VE-cadherin、F-actin 和RhoA 表達(dá)的影響及其對血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。

1.3.3Real-time PCR檢測VE-cadherin、F-actin 和TLR4 mRNA表達(dá)變化 遵照Real-time PCR試劑盒說明書,以cDNA為模板,采用 SYBRGreen 染料法進(jìn)行實時熒光定量 PCR,檢測各目的基因的表達(dá),見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.3.4Western blot法檢測VE-cadherin 和 F-actin、TLR4、RhoA蛋白表達(dá)變化 RIPA 裂解液(強)提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA 法測量樣品在 562 nm波長附近的吸光度值,測定蛋白濃度,調(diào)整合適后進(jìn)行蛋白變性處理(100 ℃,5 min)。根據(jù)待檢測蛋白分子量制備合適濃度的分離膠(GAPDH,10%;TLR4,7.5%;RhoA,15%;VE-cadherin,8%;F-actin,10%),經(jīng) SDS-PAGE 電泳分離后,分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育[TLR4 (1 ∶400),RhoA(1 ∶500),VE-cadherin(1 ∶500),F-actin(1 ∶400)]、二抗孵育(1 ∶10 000)及 ECL發(fā)光、顯影,以 GAPDH 為內(nèi)參,進(jìn)行灰度掃描及相對表達(dá)量分析。

1.3.5單層細(xì)胞通透性實驗 制備單細(xì)胞懸液,細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml,然后將100 μl的HUVEC接種于Transwell小室,待單層內(nèi)皮細(xì)胞層形成,測定跨上皮電阻(trans-epithelial electrical resistance,TER)至穩(wěn)定后,無牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。雙層小室的頂室加入FITC-albumin(溶于D-Hank液),底室加入D-Hank液。繼續(xù)培養(yǎng)45 min,吸取雙層小室的頂室和底室液體,應(yīng)用熒光分光光度計,設(shè)定激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm,檢測各樣品熒光強度值,分析細(xì)胞通透性系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 血液濾過前后血清中相關(guān)細(xì)胞因子含量變化ELISA法檢測結(jié)果顯示:與濾過前相比,濾過后血清中 TLR4、RhoA、IL-1、IL-6 和 TNF-α含量均降低(t=4.722,P<0.01;t=4.168,P<0.01;t=6.623,P<0.01;t=8.141,P<0.01;t=6.372,P<0.01)。見圖1。

圖1 濾過前后血清中細(xì)胞因子含量變化與同一指標(biāo)濾過前比較:**P<0.01

2.2 濾過前后血清干預(yù)對細(xì)胞通透性的影響細(xì)胞通透性檢測分析結(jié)果表明,與正常組相比,濾過前血清干預(yù)組熒光強度明顯增強,單層細(xì)胞通透性系數(shù)明顯升高(t=6.999,P<0.01);與濾過前血清干預(yù)組相比,濾過后血清干預(yù)組細(xì)胞通透性明顯降低(t=5.195,P<0.01)。見圖2。

圖2 濾過前后血清干預(yù)對血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響與正常組比較:**P<0.01;與濾過前比較:##P<0.01

2.3 濾過前后血清干預(yù)對 VE-cadherin 和 F-actin 表達(dá)的影響分析結(jié)果表明,與正常組相比,濾過前血清干預(yù)組 VE-cadherin 和 F-actin mRNA 表達(dá)水平均降低(t=9.996,P<0.01;t=9.524,P<0.01),同時其蛋白表達(dá)也明顯降低(t=6.849,P<0.01;t=12.340,P<0.01)。與濾過前干預(yù)組相比,濾過后血清干預(yù)組 VE-cadherin 和 F-actin mRNA表達(dá)水平均升高(t=3.237,P<0.01;t=4.605,P<0.01),見圖3。同時其蛋白表達(dá)也明顯升高(t=4.744,P<0.01;t=2.667,P<0.01),見圖4。

圖3 濾過前后血清干預(yù)對VE-cadherin和 F-actin mRNA 表達(dá)的影響與正常組比較:**P<0.01;與濾過前比較:##P<0.01

圖4 濾過前后血清干預(yù)對 VE-cadherin 和 F-actin 蛋白表達(dá)的影響

2.4 濾過前后血清干預(yù)對TLR4 mRNA 表達(dá)的影響與正常組相比,濾過前血清干預(yù)組 TLR4 mRNA 表達(dá)顯著升高(t=12.110,P<0.01);與濾過前血清干預(yù)組相比,濾過后血清干預(yù)組 TLR4 mRNA 表達(dá)顯著降低(t=8.825,P<0.01)。見圖5。

圖5 濾過前后血清干預(yù)對 TLR4 mRNA 表達(dá)的影響與正常組比較:**P<0.01;與濾過前比較:##P<0.01

2.5 濾過前后血清干預(yù)對 TLR4 和 RhoA 蛋白表達(dá)的影響與正常組相比,濾過前血清干預(yù)組 TLR4 和 RhoA 蛋白表達(dá)升高(t=8.117,P<0.01;t=6.037,P<0.01);與濾過前血清干預(yù)組相比,濾過后血清干預(yù)組 TLR4 mRNA 表達(dá)降低(t=6.909,P<0.01;t=3.266,P<0.01)。見圖6。

圖6 濾過前后血清干預(yù)對 TLR4 和 RhoA 蛋白表達(dá)的影響

2.6 TLR4 低表達(dá)對 RhoA 及 VE-cadherin 和 F-actin 表達(dá)的影響Real-time PCR 分析結(jié)果表明,TLR4 低表達(dá)可明顯促進(jìn) VE-cadherin 和 F-actin的 mRNA 表達(dá),與正常組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.590,P<0.01;t=13.050,P<0.01)。同時,Western blot結(jié)果也表明,TLR4 低表達(dá)可抑制 RhoA 蛋白的表達(dá)(t=4.289,P<0.01),促進(jìn) VE-cadherin 和 F-actin 蛋白的表達(dá)(t=13.278,P<0.01;t=3.781,P<0.01)。見圖7。

圖7 TLR4 低表達(dá)對 RhoA、VE-cadherin 和 F-actin 表達(dá)的影響

3 討論

連續(xù)血液濾過治療對于清除炎癥因子,改善膿毒癥患者預(yù)后方面有著積極作用,但其在膿毒癥病理生理過程中發(fā)揮作用的機制尚不明確。該研究中,經(jīng)連續(xù)血液濾過治療后,膿毒癥患者血清中 TLR4、RhoA、IL-1、IL-6和TNF-α含量均顯著降低,表明該療法能夠有效清除炎癥因子。使用經(jīng)連續(xù)血液濾過治療前后的膿毒癥血清干預(yù)HUVEC,結(jié)果顯示濾過后血清干預(yù)組VE-cadherin、F-actin mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高,細(xì)胞通透性明顯降低。提示通過連續(xù)血液濾過治療可以保護(hù)血管內(nèi)皮組成相關(guān)基因VE-cadherin 和 F-actin的表達(dá),通過保護(hù)其結(jié)構(gòu)功能,改善血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),進(jìn)而穩(wěn)定血管內(nèi)皮通透性。內(nèi)皮細(xì)胞高通透性是膿毒癥病理生理過程中的重要一環(huán),這對于改善膿毒癥預(yù)后有著重要意義。同時在該研究中還伴隨著TLR4 和 RhoA 表達(dá)的顯著降低。

RhoA是屬于GTPases的Rho亞家族。研究[6]表明RhoA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組,降低緊密連接蛋白的表達(dá),引起血管內(nèi)皮屏障功能障礙。Rho蛋白是細(xì)胞骨架、細(xì)胞形態(tài)和運輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,能夠在多種信號通路發(fā)揮作用。Amado-Azevedo et al[7]發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中,RhoA通過以Rho GTPase依賴性方式參與了增加黏附連接和細(xì)胞基質(zhì)黏附的動力學(xué)來促進(jìn)細(xì)胞回縮和間隙形成的過程。Rho家族的小GTPases在肌動蛋白細(xì)胞骨架動力學(xué)的控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。Rho GTPase及其下游效應(yīng)物Rho激酶(Rho associated kinase,ROCK)介導(dǎo)的Rho/ROCK信號通路已被證明參與細(xì)胞黏附、運動和收縮,參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮通透性[9]。研究[10]顯示經(jīng)脂多糖處理可降低肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白和VE-cadherin的表達(dá)水平,RhoA激活劑的應(yīng)用能使連接蛋白表達(dá)減少,引起內(nèi)皮屏障功能受損,RhoA是脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙信號通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。

脂多糖作為一種典型的病原體相關(guān)分子模式,可以被天然免疫系統(tǒng)中模式識別受體識別,模式識別受體能使它們將自身組織和外來病原微生物區(qū)分開,從而針對入侵的病原體產(chǎn)生防御性炎癥反應(yīng)[11]。這些受體中就包括Toll樣受體,其在膿毒癥中能夠驅(qū)動內(nèi)皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、趨化因子和促凝因子,并表達(dá)促黏附分子,引起內(nèi)皮通透性增加致間質(zhì)滲漏,最終導(dǎo)致微循環(huán)血流受損、組織灌注不足和危及生命的器官衰竭[12]。TLR4是Toll樣受體家族成員,參與先天免疫并通過識別脂多糖介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TLR4的過度激活觸發(fā)各種炎癥因子的產(chǎn)生,在炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用[13]。

該研究進(jìn)一步構(gòu)建了TLR4 低表達(dá)細(xì)胞株,結(jié)果顯示TLR4低表達(dá)可明顯促進(jìn)VE-cadherin 和 F-actin的 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),同時可抑制 RhoA 蛋白的表達(dá),內(nèi)皮通透性隨之降低。TLR4/RhoA 信號通路能夠影響細(xì)胞通透性相關(guān)基因VE-cadherin 和 F-actin的表達(dá)在膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,而經(jīng)過連續(xù)血液濾過治療能夠有效降低血液中 TLR4、RhoA 等細(xì)胞因子含量,從而影響膿毒癥形成過程中的信號通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo),通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞 VE-cadherin 和 F-actin 等結(jié)構(gòu)以協(xié)助血管內(nèi)皮功能的穩(wěn)定,同時能夠清除過多的IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子以減輕對免疫功能的破壞,從而改善膿毒癥患者預(yù)后,為膿毒癥的治療提供了新思路。