余畋余,劉道利,汪朝暉,胡霜久,劉 斌

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組病因未明的累及全腸道的慢性非特異性炎癥疾病,主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。IBD主要病理特征為腸黏膜的損傷[1],現(xiàn)主流研究觀點認(rèn)為其致病因素為免疫功能紊亂和上皮細(xì)胞屏障受損[2-3]。肥大細(xì)胞(mast cell, MC)是源自骨髓前體細(xì)胞的先天免疫細(xì)胞,在干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)的影響下成熟,并最終在腸道上皮內(nèi)間隙中定居。作為前哨免疫細(xì)胞群的一員,MC是抵抗攻擊的一線防御細(xì)胞,與腸道炎癥活動密切相關(guān)[4]。然而,MC在炎癥性腸病過程中的作用和調(diào)節(jié)機制仍未有報道。該研究通過右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)的IBD模型,構(gòu)建野生型小鼠(以下簡稱WT小鼠)、MC缺陷小鼠(以下簡稱C-kit小鼠)和MC重建小鼠相關(guān)炎癥癌癥序列演變模型,探究MC在IBD過程中的作用和調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 WT型小鼠:雌性C57BL/6小鼠,6～8周齡,20～24 g,購于北京Vital River實驗動物中心,飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)SPF級動物房。C-kit小鼠: 6～8周齡雌性C57BL/6 KitW-sh/W-sh小鼠購于美國Jax實驗室,繁殖于同濟(jì)大學(xué)SPF級動物房。MC重建小鼠[4-5]:雌性5周齡C57BL/6 KitW-sh/W-sh小鼠,通過腹腔注射體外培養(yǎng)的WT小鼠來源的骨髓來源的MC(約5×106個)。5周后可獲得MC重建小鼠,使用腸道甲苯胺藍(lán)染色切片觀察重建效率。

1.1.2主要試劑和儀器 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium,DSS)購自美國MP Biomedicals公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;BB515 Rat Anti-CD11b、PE Rat Anti-mouse F4/80、Alexa Fluor 647 Rat Anti-mouse CD206、PE-Cy7 Rat Anti-mouse CD86、Fixation/Permeabilizati Kit破膜染色劑、APC-Cy7通道死活細(xì)胞染料均購自美國BD Science公司;Percp/cy5.5 Anti-mouse CD45、PE-Cy7 Rat Anti-mouse CD117、FITC Rat Anti-mouse FcεRI均購自美國Biolegend公司;Ki67抗體購自美國Abcam公司;小鼠mRNA引物購自上海生工生物工程有限公司;TRIzol用于提取總RNA,購自Invitrogen公司;Light Cycler RNA Master SYBR Green試劑盒購自瑞士Roche公司,使用購自Roche公司的LightCycler儀器進(jìn)行進(jìn)一步分析;單核細(xì)胞分離試劑盒購自德國Miltenyibiotec公司。

1.1.3小鼠mRNA引物 表1中所涉及的引物均為IBD期間參與炎癥形成的關(guān)鍵細(xì)胞因子。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2 方法

1.2.1小鼠IBD模型構(gòu)建 配制濃度為2.5%的DSS(分子量36 000～50 000)水溶液。小鼠連續(xù)飼喂DSS水溶液7 d,隨后更換為正常水連續(xù)飼喂7 d。每天觀察小鼠的炎癥特征,包括腹瀉、便血、體質(zhì)量和存活率的變化,綜合這類特征計算活動疾病指數(shù)(disease activity index,DAI)。具體公式如下:體質(zhì)量下降百分率(體質(zhì)量不變?yōu)?,1～5為1分,5～10為2分,10～15為3分,大于15為4分)、大便黏稠度(正常為0,松散的大便為2分,腹瀉為4分)和大便出血(正常0分,隱血陽性為2分,顯性出血為4分),3項結(jié)果的總分除以3即得到DAI值。即DAI=(體質(zhì)量指數(shù)+大便形狀+出血情況)/3。

1.2.2組織HE、甲苯胺藍(lán)染色和免疫組化染色 在前期的研究[5]中已具體描述。

1.2.3實時定量PCR檢測小鼠結(jié)腸mRNA 使用TRIzol方法提取RNA,并使用RNeasy柱對其進(jìn)行純化。通過PCR儀以及特異性引物對基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測。擴(kuò)增完成后,進(jìn)行DNA解鏈曲線分析以確認(rèn)單個擴(kuò)增子的存在。GAPDH是用于標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)錄水平的內(nèi)部參考基因。每個基因轉(zhuǎn)錄水平的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法分析。

1.2.4結(jié)腸固有層單核細(xì)胞分離及MC流式分析 按照單核細(xì)胞分離試劑盒制造商的說明從小鼠結(jié)腸中分離單核細(xì)胞。然后使用前文方法[4-5]標(biāo)記單核細(xì)胞中的MC。使用BD FACSCanto儀器進(jìn)行采集,使用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5M1和M2型巨噬細(xì)胞染色和流式分析 M1型巨噬細(xì)胞染色:將BB515 Rat Anti-CD11b、PE Rat Anti-mouse F4/80、PE-Cy7 Rat Anti-mouse CD86、Percp/cy5.5 Anti-mouse CD45抗體加入樣品中,4 ℃條件下孵育30 min。M2型巨噬細(xì)胞染色:先將BB515 Rat Anti-CD11b、PE Rat Anti-mouse F4/80、Percp/cy5.5 Anti-mouse CD45抗體加入樣品中,4 ℃條件下孵育30 min染表面Marker。使用固定破膜液進(jìn)行表面Marker固定及破膜作用后,加入抗體Alexa Fluor 647 Rat Anti-mouse CD206,4 ℃條件下孵育30 min,進(jìn)行胞內(nèi)染色。1×PBS洗滌后使用FACSCanto II儀器上機和FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 MC在DSS誘導(dǎo)的腸炎恢復(fù)期浸潤增加在DSS水溶液誘導(dǎo)的腸炎小鼠模型中,第3～7天為炎癥的活動期,第10～14天為炎癥的恢復(fù)期。如圖1A所示,對不同時間節(jié)點的結(jié)腸進(jìn)行實時定量PCR分析,與MC遷移和分化緊密相關(guān)的因子Scf的mRNA表達(dá)水平隨著時間節(jié)點變化,可見炎癥活動期結(jié)束的第7天ScfmRNA表達(dá)最高,且恢復(fù)期一直維持在較高的表達(dá)水平?？梢娔c上皮損傷后腸道在炎癥期逐漸分泌了大量Scf因子。另一種與MC遷移及浸潤有關(guān)的因子Mmp-9的表達(dá)也在恢復(fù)期上調(diào)。為了進(jìn)一步探索MC是否受到分泌的Scf和Mmp-9因子的影響,用流式細(xì)胞術(shù)檢測了不同時間點的MC在單核細(xì)胞中的占比(圖1B),可見在恢復(fù)期MC比例升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FDay10=79.75,P<0.001)(FDay12=13.00,P<0.001)。此外,一種反映MC數(shù)量和功能的類胰蛋白酶基因Mcpt7的表達(dá)也在恢復(fù)期上升(圖1C)。同時,在第3、7天炎癥期,Mmp-9、Scf和Mcpt7的表達(dá)量與第0天比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。最后,本研究使用甲苯胺藍(lán)對不同時間節(jié)點的結(jié)腸進(jìn)行染色,結(jié)果顯示炎癥活動期的MC較少,恢復(fù)期可見MC大量浸潤于腸組織中(圖1D)。

2.2 DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中MC缺陷鼠結(jié)腸黏膜損傷較重且黏膜修復(fù)受限用WT小鼠和C-kit小鼠構(gòu)建腸炎模型。較WT組而言,C-kit組體質(zhì)量損失較大(圖2A)。小鼠生存曲線表明C-kit組腸道炎癥較重,生存率較低(圖2B)。小鼠DAI指數(shù)通過綜合評估小鼠便血(圖2C)、腹瀉、體質(zhì)量減輕等體征獲得?？梢奀-kit組不同時間節(jié)點DAI指數(shù)均低于WT組(圖2D)。結(jié)腸受炎癥程度的影響會縮短,長度越短則代表腸道炎癥越重。C-kit組結(jié)腸長度整體較WT組縮短更多(圖2E),WT組和C-kit組結(jié)腸長度分別為(10.3±1.17)cm和(7.9±0.91)cm,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.06,P<0.01)。HE染色反映腸道黏膜的結(jié)構(gòu)完整性。如圖2F所示,WT組絨毛可見,結(jié)構(gòu)較完整,腸道恢復(fù)較好。然而,C-kit組未見完整的絨毛結(jié)構(gòu),組織破壞嚴(yán)重,腸道恢復(fù)較差。Ki67免疫組化染色反映組織的增生和修復(fù)能力(圖2G),WT組和C-kit組Ki67(+)細(xì)胞百分比分別為(64.2±5.89)%和(27.2±10.23)%, Ki67(+)細(xì)胞百分比WT組較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.017,P<0.001)。

圖2 WT組和C-kit組第14天的腸炎損傷和恢復(fù)對比

2.3 MC缺陷鼠重建MC后炎癥減輕且恢復(fù)了修復(fù)能力利用WT小鼠、MC小鼠和MC重建小鼠構(gòu)建腸炎模型。MC重建組體質(zhì)量損失介于WT組和C-kit組之間(圖3A)。MC重建組結(jié)腸長度為(8.04±0.59)cm,與WT組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,與C-kit組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.526,P<0.05),MC重建組結(jié)腸長度大于C-kit組(圖3B)。MC的重建一定程度上抑制了腸道炎癥。NC組和MC重建組Ki67(+)細(xì)胞百分比分別為(6.4±2.07)%和(49.4±8.32)%。MC重建組Ki67(+)細(xì)胞百分比低于WT組(F=1.997,P<0.05),高于C-kit組(F=1.511,P<0.01),見圖3C、3D。

圖3 MC缺陷鼠重建MC后第14天的炎癥和黏膜恢復(fù)情況

2.4 在IBD過程中MC通過極化M1/M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮抑炎和促進(jìn)黏膜修復(fù)的作用對結(jié)果2.2項中兩組小鼠的結(jié)腸組織提取單核細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記和分析。C-kit組(0.53±0.02)的M1型巨噬細(xì)胞比例高于WT組(0.48±0.02),C-kit組(0.10±0.01)的M2型巨噬細(xì)胞比例低于WT組(0.20±0.03)。統(tǒng)計學(xué)分析C-kit組巨噬細(xì)胞M1/M2的比率較WT組增高(圖4A),柱狀圖反映了兩組小鼠M1/M2型巨噬細(xì)胞比例,使用非配對t檢驗進(jìn)行分析(t=5.584),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.183,P<0.01)。為探究這種比率差異對IBD過程的影響,用實時定量PCR檢測了兩組小鼠結(jié)腸組織中包含與M2巨噬細(xì)胞功能密切相關(guān)的抑炎因子基因和M1巨噬細(xì)胞功能相關(guān)的促炎因子基因(圖4B)。分析其中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的多個基因,包括Il4、Il10、Il13、Ccl5、Cxcl9、Gata3、Inos等?；騃nos是反映炎癥程度指標(biāo),WT組(0.62±0.43)相對表達(dá)低于C-kit組(2.25±0.94),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?；騃l4、Il10、Il13、Gata3是參與抑制炎癥發(fā)展和促進(jìn)組織重塑過程的指標(biāo),與M2巨噬細(xì)胞功能關(guān)系極為密切,WT組表達(dá)均高于C-kit組(圖4C)。WT組基因Il4、Il10、Il13、Gata3的表達(dá)依次為(2.18±1.24)、(1.78±0.63)、(1.15±0.13)和(1.22±0.10),C-kit組依次為(0.46±0.35)、(0.81±0.41)、(0.34±0.26)和(0.47±0.44),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

圖4 MC對巨噬細(xì)胞極化和腸組織環(huán)境的影響

3 討論

本研究表明腸上皮受損后腸道可分泌Scf和Mmp-9誘導(dǎo)MC向炎癥腸組織遷移和浸潤。Scf和Mmp-9的表達(dá)上調(diào)可能是為炎癥恢復(fù)期MC的聚集提供有利環(huán)境,以便于MC在炎癥恢復(fù)期活化和發(fā)揮特定功能。在小鼠IBD模型中,MC缺陷小鼠的腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重,腸道炎癥較重且黏膜修復(fù)能力較差。然而,當(dāng)在MC缺陷小鼠體內(nèi)重建MC后,發(fā)現(xiàn)腸黏膜再生修復(fù)功能得以恢復(fù),腸道炎癥也得以減輕。這證實MC對于IBD的免疫調(diào)節(jié)和黏膜修復(fù)是至關(guān)重要且必不可少的。本研究用流式細(xì)胞術(shù)分析了炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要的巨噬細(xì)胞,活化的巨噬細(xì)胞有兩種亞型,即促炎M1型和抑炎M2型巨噬細(xì)胞[6]。M1型巨噬細(xì)胞在炎癥過程中扮演著促炎的角色,其主要分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,Tnf-α)、Il6、Il12和Il1β;M2型巨噬細(xì)胞在炎癥過程中則扮演著抑炎的角色,其主要分泌Il4和Il10等因子,弱化免疫反應(yīng)進(jìn)而抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展,促進(jìn)傷口愈合[7]?；罨木奘杉?xì)胞既能調(diào)節(jié)組織損傷也能促進(jìn)修復(fù)[8]。結(jié)果顯示W(wǎng)T野生型小鼠組的結(jié)腸內(nèi)巨噬細(xì)胞M1/M2比率低于MC缺陷小鼠組。同時,類似M2型巨噬細(xì)胞,MC自身活化后也可以分泌Il4,除此之外,還可分泌Il13,共同起到抗炎作用[9]。顯然,MC一定程度上富集了抗感染作用的M2型巨噬細(xì)胞,降低了促炎作用的M1型巨噬細(xì)胞,這種極化巨噬細(xì)胞的作用有利于腸炎恢復(fù)期的黏膜愈合和組織修復(fù)。32種抑炎和促炎因子基因的檢測進(jìn)一步證實了上述結(jié)論。

本研究仍存在一定局限性,小鼠腸組織環(huán)境中炎性多細(xì)胞因子的實時定量熒光PCR檢測反映了mRNA基因水平的差異性,基因調(diào)控下游蛋白水平的差異性仍需在后續(xù)的研究中進(jìn)一步補充。此外,MC可以分泌多種趨化因子,如Ccl3、Ccl4、Ccl5、Cxcl9等[10]。但筆者發(fā)現(xiàn)MC缺陷以后,這些趨化因子基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯降低,說明MC并非唯一影響IBD過程的免疫細(xì)胞,將在后續(xù)工作中進(jìn)一步剖析IBD過程中免疫細(xì)胞浸潤和串?dāng)_的相關(guān)機制。

本研究闡述了MC是通過極化巨噬細(xì)胞在IBD過程中發(fā)揮抗炎和促進(jìn)黏膜修復(fù)作用的,它為MC參與IBD調(diào)控提供了可靠的理論依據(jù)。如果臨床研究進(jìn)一步證實此理論的可靠性,未來MC數(shù)目和活性可能作為評價IBD患者結(jié)腸黏膜愈合功能的一項可靠指標(biāo)。Il13、Gata3、Il4、Il10、Inos等指標(biāo)也可能作為評價IBD患者腸道自愈功能的輔助指標(biāo)。