丁新華　汪洋洲　賈尊尊等

關鍵詞 亞洲玉米螟； 歐洲玉米螟； 近緣種； 種群分化； 寄主

中圖分類號： Ｓ４５１ 文獻標識碼： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２２８６

玉米螟俗稱玉米鉆心蟲，屬鱗翅目Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ草螟科Ｃｒａｍｂｉｄａｅ稈野螟屬Ostrinia，是世界范圍內(nèi)玉米上的主要害蟲，每年給全球玉米生產(chǎn)造成巨大損失，同時也是造成中國玉米減產(chǎn)的第一大害蟲［１３］。玉米螟在世界范圍內(nèi)主要分為歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis（Hubner）和亞洲玉米螟O.furnacalis（Ｇｕｅｎéｅ），其中歐洲玉米螟主要分布于歐洲、北非、西亞、中亞和北美洲［４５］，亞洲玉米螟則主要分布在亞洲東部和南部、澳大利亞和西太平洋的一些島嶼上［６］。中國是目前世界已知的唯一同時分布有亞洲玉米螟和歐洲玉米螟的國家，其中亞洲玉米螟在中國廣泛分布且為絕對優(yōu)勢種，歐洲玉米螟目前已知僅分布于中國新疆的伊犁河谷地區(qū)［７］。

兩種玉米螟同時也是研究生物進化、雜交和同域物種形成的理想模式生物［８９］，其中歐洲玉米螟由于種群間在生態(tài)和性特征上存在差異，已成為研究生態(tài)多樣性和早期物種形成機制的模式生物［１０］。此外，同域發(fā)生區(qū)對種群進化研究也十分重要，已成為研究物種進化的熱點之一［１１１３］。綜上可見，同域發(fā)生的亞洲玉米螟和歐洲玉米螟可為研究近緣種種間競爭、物種進化、雜交等提供極為難得的材料。

新疆伊犁河谷地區(qū)地處我國最西部，與中亞的哈薩克斯坦接壤，并被青藏高原、塔克拉瑪干沙漠和天山山脈阻隔。２０世紀８０年代新疆伊犁河谷地區(qū)還是純系歐洲玉米螟分布區(qū)，亞洲玉米螟還沒有入侵到此地，且歐洲玉米螟也沒有入侵到亞洲東部，直到１９８８年之前該區(qū)域僅報道有歐洲玉米螟分布［１４１６］。但在近幾十年里，亞洲玉米螟已入侵到這一區(qū)域，目前這一區(qū)域已成為世界上唯一一處已知的亞洲玉米螟和歐洲玉米螟同域混生區(qū)，且亞洲玉米螟作為外來種在玉米上已經(jīng)成功取代歐洲玉米螟，成為混生區(qū)玉米上的優(yōu)勢種類，研究還發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟可以和歐洲玉米螟進行基因交流，并在自然界中發(fā)現(xiàn)了它們的大量雜交個體，且基因流偏向從亞洲玉米螟種群滲透到歐洲玉米螟種群［７］。

盡管新疆伊犁混生區(qū)玉米螟種群中歐洲玉米螟在玉米上的種群數(shù)量已顯著下降，然而在混生區(qū)內(nèi)其他寄主植物上歐洲玉米螟種群數(shù)量是否下降尚不清楚，且該混生區(qū)內(nèi)玉米螟的主要野外寄主種類以及這兩種近緣種在主要寄主植物上的群落組成及混生比例也尚不清楚，為此，本文在田間寄主植物系統(tǒng)調(diào)查的基礎上，利用線粒體細胞色素ｃ氧化酶Ⅰ（ｍｔＣＯⅠ）基因測序和種特異性氣味受體４（ＯＲ４）基因限制性酶切法對混生區(qū)內(nèi)４個縣市８個采樣地５種主要寄主上的９８６個玉米螟樣本進行種類鑒定分析，以期系統(tǒng)摸清新疆伊犁同域混生區(qū)內(nèi)玉米螟的主要野外寄主種類，明確亞洲玉米螟和歐洲玉米螟的空間組成分布現(xiàn)狀及不同寄主群落混生情況，為后續(xù)同域環(huán)境近緣種種間競爭、生物進化、雜交等研究提供基礎數(shù)據(jù)。

１材料與方法

１．１寄主種類調(diào)查

筆者所在研究團隊于２０１８年－２０１９年連續(xù)２年每年５月初至９月底對已有文獻報道過是玉米螟寄主且在新疆伊犁河谷混生區(qū)內(nèi)有廣泛分布的植物開展玉米螟發(fā)生為害調(diào)查，共８科２１屬２３種，同時還對這些寄主植物尤其是分布在玉米田周邊可能是玉米螟野生寄主的雜草或其他植物開展系統(tǒng)調(diào)查。具體方法為：對每種主要寄主／可能寄主隨機設置調(diào)查地，并重復３次，每調(diào)查樣地均采用５點取樣方法，每點２０株，每隔７ｄ調(diào)查１次，如若發(fā)現(xiàn)有玉米螟發(fā)生，則繼續(xù)統(tǒng)計卵、幼蟲、蛹等各蟲期的數(shù)量和被害株率等指標。

１．２樣本采集

本研究對混生區(qū)內(nèi)玉米螟田間樣本的采集分兩次完成，第一批次樣本采集于２０１９年８月３日至１６日，為混生區(qū)內(nèi)玉米上采集的第２代玉米螟卵塊，共獲得９６１個卵塊。隨后在實驗室內(nèi)進行單卵塊飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為（２８±１）℃，光周期Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ，ＲＨ（７５±５）％，并對其中成功孵化的６０２個卵塊進行抽樣鑒定，每個卵塊隨機抽取單頭低齡玉米螟幼蟲進行ＤＮＡ 提取和物種鑒定（表１）。第二批次樣本采集于２０１９年９月１３日至１０月７日，為混生區(qū)內(nèi)５種主要寄主植物上采集的第２代玉米螟幼蟲，共獲得１２２５頭樣本。記錄采樣相關信息，將采集到的幼蟲單頭放入管帽扎有透氣孔的１．５ｍＬ離心管內(nèi)臨時保存，帶回實驗室后置于－８０℃超低溫冰箱中保存。隨后從各采樣地每種寄主上隨機抽取一定數(shù)量的玉米螟幼蟲進行ＤＮＡ 提取和物種鑒定，共計３８４頭幼蟲樣本（表２）。綜上，總計獲得來自混生區(qū)內(nèi)４個縣市８個采樣地５種寄主上的９８６個疑似玉米螟樣本。

１．３DNA提取

玉米螟ＤＮＡ 的提取參考Ｆｒｏｈｌｉｃｈ等的方法略作修改［１７］。取單頭玉米螟幼蟲放入１．５ｍＬＥｐｐｅｎ-ｄｏｒｆ管內(nèi)，吸?。保唉蹋?裂解液［每升裂解液含５μＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ（ｐＨ＝８．０），１μＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０），５μＬＮＰ４０，５．３μＬ２５０．０ｍｇ／ｍＬＰｒｏ-ｔｅｉｎＫ＋ ，９８３．７μＬｄｄＨ２Ｏ］滴在蟲體上，使用滅菌的小號研磨棒將玉米螟充分研磨均勻；用１０μＬ裂解液清洗研磨棒并將清洗液移入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，最后再加入４０μＬ裂解液（總體積約６０μＬ）；將勻漿液在ＰＣＲ儀中溫育（６５℃１５ｍｉｎ，９５℃１０ｍｉｎ），溫育后的產(chǎn)物在－２０℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

１．４PCR擴增

ＰＣＲ反應總體系為５０μＬ，其中ＤＮＡ 模板２．４μＬ，上、下游引物（線粒體COI基因，ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＧＵ０９３５２２．１。上游：５′-ＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣ-ＧＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡ-３′；下游：５′-ＴＡＡＡＣＴＴＣＴＧ-ＧＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡ-３′）各２ μＬ，TaqＰＣＲｍｉｘ２５μＬ，其余使用超純水補足。ＰＣＲ 反應程序為９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５２℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５個循環(huán)；７２℃ １０ｍｉｎ；４℃ 保存。ＰＣＲ 產(chǎn)物用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果在ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒＨＰ凝膠成像系統(tǒng)中檢查。將ＰＣＲ產(chǎn)物送至深圳華大基因公司，對９８６個玉米螟樣品的單鏈進行測序（ＡＢＩ３７３０Ｘｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。

１．５物種鑒定

對樣品的mtCOⅠ基因序列進行比對，并結(jié)合氣味受體４（ＯＲ４）基因限制性內(nèi)切酶酶切的結(jié)果鑒定亞洲玉米螟和歐洲玉米螟雜合體組成情況［７］。首先，將COⅠ序列在ＢＯＬＤ數(shù)據(jù)庫在線比對確認玉米螟種類［１８］，并將相關序列提交至ＧｅｎＢａｎｋ，其中９４２ 個亞洲玉米螟序列ＧｅｎＢａｎｋ 登錄號為ＯＮ４２８４６９～ ＯＮ４２８４７６、ＯＮ４２８６８０～ ＯＮ４２８９００、ＯＮ４５３５３２～ ＯＮ４５３６１４、ＯＮ４５３６１６～ ＯＮ４５３６４５、ＯＮ４５８７６１～ ＯＮ４５８８００、ＯＮ４５８８０２～ ＯＮ４５８８５８、ＯＮ４６０５９７～ ＯＮ４６０６４６、ＯＮ４６０９５４～ ＯＮ４６１００３、ＯＮ４６１２５７～ ＯＮ４６１３６７、ＯＮ４６１３７７～ ＯＮ４６１４７２、ＯＮ４６２１８５～ ＯＮ４６２２５８、ＯＮ４６８５２３～ ＯＮ４６８５２７、ＯＮ４６８５３１～ＯＮ４６８５６０、ＯＮ４６８５６３～ＯＮ４６８６４５；４４個歐洲玉米螟序列ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＯＮ４６２３６８～ＯＮ４６２４１１。

OR４基因獲取及酶切：ＰＣＲ反應總體系為５０μＬ，其中ＤＮＡ 模板２．４μＬ，上、下游引物（ＯｓｔＯＲ４-Ｆ１：５′-ＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＣＴ-３′；ＯｓｔＯＲ４-Ｒ１：５′-ＴＴＧＴＣＧＧＡＡＡＧＧＴＡＡＴＲＴＡＧＣＣ-３′）各２ μＬ，TaqＰＣＲｍｉｘ２５μＬ，使用超純水補足至５０μＬ。ＰＣＲ反應程序：９４℃ ５ ｍｉｎ；９４℃ ３０ｓ，５７℃ ３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５個循環(huán)；７２℃ １０ｍｉｎ，４℃ 保存。ＰＣＲ產(chǎn)物用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產(chǎn)物用TaqⅠ進行酶切，酶切體系包括ＰＣＲ產(chǎn)物１０μＬ （０．１～０．５μｇ的ＤＮＡ），ｎｕｃｌｅａｓｅ-ｆｒｅｅｗａｔｅｒ１８μＬ，１０×TaqⅠＢｕｆｆｅｒ２μＬ，TaqⅠ１～２μＬ?；靹蚝笤冢叮怠鏈卦。薄保叮瑁瘶悠酚茫常キ傊悄z在８０Ｖ下電泳６０ｍｉｎ，然后在凝膠成像系統(tǒng)中檢查結(jié)果。

１．６數(shù)據(jù)分析

采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ２０１０和ＳＰＳＳ２３．０統(tǒng)計軟件對混生區(qū)內(nèi)不同調(diào)查地點亞洲玉米螟或歐洲玉米螟卵塊／幼蟲混生比例間的差異水平進行單因素方差分析（ＯｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ），如果差異顯著再進行Ｄｕｎｃａｎ’ｓＨＳＤ 多重比較，顯著性水平設定為α＝０．０５。

２結(jié)果與分析

２．１新疆伊犁同域混生區(qū)玉米螟主要寄主植物種類調(diào)查

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆伊犁混生區(qū)內(nèi)玉米螟的寄主植物主要是玉米Zea ma ys L、高粱Sorghum bicotor（L.）Ｍｏｅｎｃｈ、稗Echinochloacrus-galli（L.）Ｂｅａｕｖ．、狗尾草Setaria viridis（L.）Ｂｅａｕｖ．和苘麻Abutilon theo phrasti Medicus ，偶見蒼耳Xanthium strumarium L.、大麻Cannabis sativa L、反枝莧Amaranthus rdroflerus L.等，其中，玉米為該混生區(qū)玉米螟最主要的寄主，受害最嚴重，平均蟲量為３０～２４０頭／百稈，嚴重時高達５６０頭／百稈。其次為高粱，平均蟲量為１０～４０頭／百稈。在混生區(qū)調(diào)查地可見玉米螟在稗草上普遍發(fā)生，平均被害株率可達１０％～２０％。狗尾草、苘麻等雜草也常見玉米螟不同程度地發(fā)生，被害株率除在極少數(shù)區(qū)域可達１％～５％以外，大多低于１％。此外，混生區(qū)內(nèi)也偶見蒼耳、大麻、反枝莧上有少量玉米螟幼蟲，豇豆、茄子有極少量玉米螟卵塊分布但未見幼蟲發(fā)生。

２．２新疆伊犁同域混生區(qū)玉米植株上兩種玉米螟卵組成和分布情況

在明確混生區(qū)主要寄主植物種類的基礎上，首先對混生區(qū)內(nèi)主要寄主植物玉米植株上兩種玉米螟卵的組成及混生情況進行研究，從玉米植株上采集的第２代玉米螟卵塊中有３５９個卵塊因被赤眼蜂寄生、卵塊干燥死亡、無效卵等原因未能孵化，對成功孵化的６０２個卵塊進行單卵塊飼養(yǎng)并依次抽取低齡幼蟲進行COⅠ片段測序，并在ＢＯＬＤ 數(shù)據(jù)庫搜索比對，結(jié)果顯示，５７５個卵塊樣本被鑒定為亞洲玉米螟，相似性為９９．０２％～１００％；２７個卵塊樣本則被鑒定為歐洲玉米螟，相似性為９９．２４％～１００％。從地理分布來看，亞洲玉米螟已在混生區(qū)內(nèi)所有調(diào)查縣市的玉米上廣泛分布，且在各調(diào)查地混生比例存在顯著差異（犘＜０．０５），為８６．４４％～１００％不等；歐洲玉米螟分布范圍已經(jīng)極為有限，僅分布于緊鄰哈薩克斯坦的霍爾果斯市以及位于伊犁河谷最東部、西天山腹地新源縣這２個縣市的少數(shù)區(qū)域，且所占比例較低，為０～１３．５６％不等。所有調(diào)查地中，新源縣塔勒德鎮(zhèn)歐洲玉米螟比例最高，達１３．５６％，其次依次為新源縣阿勒瑪勒鎮(zhèn)（１１．２５％）、霍爾果斯市伊車鄉(xiāng)（９．５５％）、新源縣阿熱勒托別鎮(zhèn)（０．６４％）。新源縣吐爾根鄉(xiāng)和霍城縣均未發(fā)現(xiàn)有歐洲玉米螟分布。

２．３新疆伊犁同域混生區(qū)不同寄主植物上玉米螟幼蟲的種類組成和分布情況

為進一步摸清混生區(qū)內(nèi)各主要寄主植物上分布的玉米螟種類組成及混生情況，筆者采集了混生區(qū)內(nèi)５種主要寄主植物上的第２代玉米螟幼蟲，共獲得１２２５頭樣本，并隨機抽取一定數(shù)量的樣本進行mtCOⅠ基因片段測序，并在ＢＯＬＤ 數(shù)據(jù)庫中在線比對，結(jié)果顯示，３６７個幼蟲樣本被鑒定為亞洲玉米螟，相似性為９９．１１％～１００％；１７個幼蟲樣本被鑒定為歐洲玉米螟，相似性為１００％。從不同寄主分布來看，亞洲玉米螟比歐洲玉米螟有更廣泛的寄主范圍和更強的競爭力，具體表現(xiàn)為亞洲玉米螟在混生區(qū)內(nèi)可取食玉米、高粱、稗草、狗尾草、苘麻等所有主要寄主植物，其在上述５種寄主上的混生比例依次為７３．３３％ ～１００％、１００％、８８．８９％ ～１００％、９５．００％～１００％、１００％。歐洲玉米螟則主要集中分布在玉米上，混生比例為０～２６．６７％，偶爾取食稗草和狗尾草，混生比例依次為０～１１．１１％、０～５．００％不等。綜合來看，目前亞洲玉米螟已在混生區(qū)內(nèi)所有主要寄主植物上成功取代歐洲玉米螟，并成為新疆伊犁同域混生區(qū)內(nèi)的絕對優(yōu)勢種。

２．４新疆伊犁同域混生區(qū)兩種近緣種玉米螟雜交個體組成情況

我們在玉米mtCOⅠ基因測序比對的基礎上，采用OR４基因限制性內(nèi)切酶鑒定法對上述５種主要寄主植物上的３８４頭玉米螟幼蟲樣本進行酶切鑒定。結(jié)果（圖１）顯示，３６７頭幼蟲樣本酶切結(jié)果為兩條帶，即存在TaqⅠ酶切位點（ＴＣＧＡ），被鑒定為亞洲玉米螟；１７頭幼蟲樣本酶切結(jié)果為１條帶，即不存在TaqⅠ酶切位點（ＴＣＧＡ），被鑒定為歐洲玉米螟。綜合mtCOⅠ和OR４基因的聯(lián)合鑒定結(jié)果，上述所有玉米螟樣本兩種鑒定方法的結(jié)果均保持一致。這表明，本研究中混生區(qū)內(nèi)５個研究地５種寄主植物上分布的３８４頭玉米螟樣本均為純合體，即純合亞洲玉米螟和純合歐洲玉米螟，未發(fā)現(xiàn)有雜合體存在。

３結(jié)論與討論

歐洲玉米螟是一種多食性鱗翅目昆蟲，原產(chǎn)于歐洲和西亞［１９］，其幼蟲可以取食２００多種單子葉和雙子葉寄主植物［１０］，有證據(jù)表明，其在地方栽培玉米和其他寄主植物上呈現(xiàn)一定程度的專化性［２０］。如Ｍａｌａｕｓａ等［９，２１］研究發(fā)現(xiàn)，法國北部取食玉米和啤酒花艾蒿的歐洲玉米螟種群分化為２種寄主型，而其他地區(qū)未發(fā)現(xiàn)明顯的寄主?；?。實驗室選擇性試驗表明，歐洲玉米螟初孵幼蟲可能更喜歡替代宿主雜草而不是玉米［２２］，但在玉米上的存活率最高［２３２４］。在波蘭和其他歐洲國家，歐洲玉米螟主要在北艾Artemisia vulgaris、啤酒花Humulus lupu-lus、大麻Cannabis sativa和玉米上被發(fā)現(xiàn)［２］。本研究發(fā)現(xiàn)，目前新疆伊犁混生區(qū)內(nèi)歐洲玉米螟主要取食并分布在玉米上，偶見取食稗草、狗尾草，其在上述３種當?shù)刂饕闹髦参锷系幕焐壤来螢椋啊玻叮叮罚?、０～１１．１１％、０～５．００％。這與Ｍｅｇａｎ等通過利用穩(wěn)定同位素（δＣ）發(fā)現(xiàn)北美地區(qū)歐洲玉米螟主要取食Ｃ４植物（主要是玉米）的研究結(jié)果基本一致［２０］，但與Ｐｉｗｃｚｙńｓｋｉ等的研究結(jié)果不同［２］。從地理分布來看，新疆伊犁混生區(qū)內(nèi)歐洲玉米螟分布范圍極為有限，目前主要分布在伊犁河谷最西部，與中亞哈薩克斯坦毗鄰的霍爾果斯市以及位于伊犁河谷最東部，西天山腹地新源縣等少數(shù)區(qū)域，所占比例僅為０～２６．６７％不等。

亞洲玉米螟被認為是中國廣布的優(yōu)勢種，我國已明確的亞洲玉米螟寄主植物也有７０余種，可為害玉米、高粱、谷子、水稻等重要糧食作物以及棉、麻等經(jīng)濟作物和多種菊科類雜草［２５２６］。本研究發(fā)現(xiàn)，亞洲玉米螟在新疆伊犁混生區(qū)所有調(diào)查縣市的采樣地均廣泛分布，所占比例為７３．３３％～１００％，從寄主分布來看，混生區(qū)內(nèi)玉米、高粱、稗草、狗尾草、苘麻等５種寄主植物上的玉米螟種類也均主要是亞洲玉米螟，比例依次為７３．３３％～１００％、１００％、８８．８９％～１００％、９５．００％～１００％、１００％。目前，亞洲玉米螟已在混生區(qū)內(nèi)主要寄主植物上成功取代了歐洲玉米螟，成為新疆伊犁同域混生區(qū)內(nèi)的絕對優(yōu)勢種，且廣泛分布于各混生區(qū)內(nèi)。這一研究結(jié)果與王克勤等［２７］、楊哲等［２８］對我國東北地區(qū)亞洲玉米螟寄主?；苑治龅闹饕Y(jié)果基本相符。田間試驗發(fā)現(xiàn)酸模葉蓼Persicaria lapathifolia是亞洲玉米螟最適宜寄主植物，其次為玉米、谷子、薏苡Coix lacryma-jobi［２５，２８］。混生區(qū)內(nèi)亞洲玉米螟比歐洲玉米螟具有更廣泛寄主范圍的原因可能是由于亞洲玉米螟在玉米引入中國之前就以谷子和雜草為寄主，在中國進化的歷史比較悠久，因而比歐洲玉米螟具有更強的競爭力。

此外，筆者利用mtCOⅠ基因測序結(jié)合氣味受體４（OR４）基因酶切鑒定對混生區(qū)內(nèi)不同調(diào)查地玉米、高粱、稗草、狗尾草、苘麻等５種寄主植物上亞洲玉米螟和歐洲玉米螟的雜合體組成情況進行分析，所有３８４個玉米螟樣本均為純合亞洲玉米螟或純合歐洲玉米螟，未發(fā)現(xiàn)有雜合體存在。這一結(jié)果與Ｗａｎｇ等［７］的研究結(jié)果存在差異，推測造成這一差異的原因可能有兩個，一方面Ｗａｎｇ等［７］主要是采用６４ 個高通量ＳＮＰ遺傳位點標記和一個種特異性氣味受體犗犚４ 基因證明了自然界中亞洲玉米螟和歐洲玉米螟雜交個體的存在，而本文采用的犿狋犆犗Ⅰ基因測序結(jié)合氣味受體犗犚４基因酶切鑒定的方法可能不能準確地發(fā)現(xiàn)雜合體的存在。另一方面，也有可能是由于在亞洲玉米螟加速取代歐洲玉米螟過程中受遺傳漂變的影響導致雜合體比例快速降低，其具體原因有待日后進一步深入研究。本文通過全面摸清當前新疆伊犁這一世界上唯一已知亞洲玉米螟和歐洲玉米螟同域混生區(qū)域內(nèi)玉米螟種群競爭替代以及主要寄主種類，系統(tǒng)明確亞、歐兩種玉米螟在主要寄主植物上的分布情況，為后續(xù)同域環(huán)境近緣種種間競爭替代和生物進化等研究提供科學依據(jù)。