崔曉慧　鐘震　姚薇等

關鍵詞 木霉； 納米銅； 合成優(yōu)化； 尖鐮孢； 抑菌作用

中圖分類號： Ｓ４３６．５ 文獻標識碼： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２１８８

納米技術作為一門多學科交叉的創(chuàng)新技術和最具發(fā)展前景的新興技術，已經在電子、醫(yī)藥、國防和農業(yè)等領域被廣泛應用。金屬納米粒子因其高表面積／體積、高導熱（電）性和高催化性能等優(yōu)異的物理和化學性質而備受關注［１］。過去幾十年，關于金屬納米粒子制備方法（物理法、化學法和生物法）一直是研究熱點，其中生物法因其方法簡便、生產成本低和環(huán)境友好而被廣泛關注［２３］。目前植物［４］和微生物［５］及其提取物可作為封端劑和還原劑用于納米材料的生物合成。與植物和細菌相比，絲狀真菌能夠產生可還原金屬離子和穩(wěn)定金屬納米粒子的有機物質，使納米粒子具有更好的生物相容性［６］。木霉Trichoderma是重要的植物病害生防菌，同時也用來生產工業(yè)酶和抗生素［７］，在工農業(yè)中發(fā)揮著重要的作用。木霉容易在實驗室和工廠內大規(guī)模培養(yǎng)，對培養(yǎng)條件要求不高、生產成本低，因此被廣泛用來生產金屬納米粒子［８１２］。納米粒子合成的速率取決于金屬離子的濃度、還原劑的類型、ｐＨ、溫度和反應時間［１３１５］。納米銅粒子（Ｃｕ-ＮＰｓ）合成過程中，Ｃｕ（Ⅱ）被微生物代謝產生的各種還原性物質還原為Ｃｕ（０）。納米銅粒子與空氣接觸容易在其表層形成ＣｕＯ-ＮＰｓ或ＣｕＯ-ＮＰｓ［１６１７］，而微生物代謝產生的大分子物質可以作為封端劑或穩(wěn)定劑，防止粒子聚集，增加粒子的穩(wěn)定性［１８］，在一定程度上能夠避免Ｃｕ-ＮＰｓ氧化為ＣｕＯ-ＮＰｓ或ＣｕＯ-ＮＰｓ［１６］。生物合成的納米銅相比于其他金屬納米粒子（納米銀或納米金）生產成本低且具有獨特性能。此外，雖然銅氧化物納米粒子在熱力學上比納米銅粒子更穩(wěn)定，但其可能會影響納米粒子的其他性能，故其應用受到一定限制［１９］。納米銅對莖點霉Phoma destructiva、鏈格孢Alternaria alternata、彎孢菌Curvularia lunata和尖鐮孢Fusarium oxysporum都具有良好的抗菌活性，能夠抑制其菌絲的生長［２０］。另外，高表面積的納米材料能夠有效地保留養(yǎng)分，可以不斷為植物提供養(yǎng)分，同時也可以改善化學農藥的溶解性和分散性，提高農藥的有效性［２１２２］。因此納米銅具有較高的抗菌活性［２３］，可以抑制真菌［２０］和細菌的［２４］生長，濃度越高，殺菌效果越好。

近年來，隨著我國設施栽培的發(fā)展，甜瓜種植面積不斷擴大，由尖鐮孢引起的甜瓜枯萎病發(fā)生日趨加重，發(fā)病率高達５０％～７０％［２５］，造成甜瓜產量和品質下降［２６］。目前農業(yè)上仍采用化學農藥防治枯萎病，但化學農藥容易造成瓜果品質下降、污染環(huán)境和病原菌產生抗藥性［２７］。因此，環(huán)境友好型且不易使病原菌產生抗藥性的生物殺菌劑是未來生防制劑的發(fā)展方向。本研究以木霉發(fā)酵液為還原劑和穩(wěn)定劑合成Ｃｕ-ＮＰｓ，通過ＵＶ-ｖｉｓ光譜表征探究不同合成條件對木霉合成Ｃｕ-ＮＰｓ的影響，以期明確木霉合成Ｃｕ-ＮＰｓ的最適條件。同時研究Ｃｕ-ＮＰｓ對尖鐮孢的抑菌活性和對甜瓜枯萎病的防效，為開發(fā)農用新型藥劑及木霉和納米銅綜合防控甜瓜枯萎病奠定理論基礎。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試驗菌種

長枝木霉Trichoderma longibrachiatum分離于柞樹根系，保存于沈陽農業(yè)大學生物科學技術學院實驗室。尖鐮孢Fusarium oxysporum分離于發(fā)病甜瓜根系，保存于沈陽農業(yè)大學植物保護學院植物免疫研究所。甜瓜種子‘紅城５號’購買于苗壯農資公司。

１．１．２培養(yǎng)基

ＰＤＡ培養(yǎng)基：土豆２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，瓊脂１５～２０ｇ，蒸餾水１０００ｍＬ。ＰＤＢ培養(yǎng)基：ＰＤＡ 培養(yǎng)基中不加入瓊脂。

１．２試驗方法

１．２．１納米銅的生物合成

木霉在ＰＤＡ 培養(yǎng)基上活化后，在菌落邊緣打取菌餅轉入ＰＤＢ培養(yǎng)基，于轉速１２０ｒ／ｍｉｎ，２８℃下培養(yǎng)３～４ｄ，使用無菌Ｗｈａｔｍａｎ１號濾紙過濾并收集發(fā)酵液。每１００ｍＬ發(fā)酵液加５００μＬＣｕＳＯ，避光條件下靜置反應２４ｈ，?。常恚谭磻河谧贤饪梢姽夥止夤舛扔嬛羞M行全波長（２００～８００ｎｍ）掃描，綜合分析Ｃｕ-ＮＰｓ合成的條件。然后１００００ｒ／ｍｉｎ，離心３０ｍｉｎ收集Ｃｕ-ＮＰｓ，無菌水洗滌２次，７５％乙醇洗滌１次，自然陰干，稱重后備用。

１．２．２納米銅合成條件的優(yōu)化

１．２．２．１底物ＣｕＳＯ 濃度對合成納米銅的影響

設置１００ｍＬ反應液中ＣｕＳＯ 的終濃度分別為５．０、１０．０、１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ，于３５℃，ｐＨ＝７，避光條件下靜置反應２４ｈ，分析反應液中ＣｕＳＯ 濃度對Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影響。

１．２．２．２ ｐＨ 對合成納米銅的影響

根據(jù)１．２．２．１的試驗結果，ＣｕＳＯ 濃度設置為１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ，反應液的ｐＨ 用１ｍｏｌ／Ｌ ＨＳＯ 和１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ 分別調整為５、７、９、１１，于３５℃，避光條件下靜置反應２４ｈ，分析ｐＨ 對ＣｕＮＰｓ合成的影響。

１．２．２．３溫度對合成納米銅的影響

根據(jù)１．２．２．１和１．２．２．２的試驗結果，將反應液ｐＨ 設為７，ＣｕＳＯ４ 濃度設為１５．０ｍｍｏｌ／Ｌ，分別于３５、４５、５５、６５℃，避光條件下靜置反應２４ｈ，分析溫度對Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影響。

１．２．３納米銅粒子的表征分析

透射電子顯微鏡（ＴＥＭ）觀察：將納米銅水溶液加到覆有碳膜的銅網上，室溫干燥，使用透射電子顯微鏡（ＨＴ７７００，日本）在１００．０ｋＶ 下觀察金屬納米粒子的形狀和尺寸。

Ｘ射線衍射（ＸＲＤ）觀察：在４０ｋＶ 的電壓下，以ＣｕＫα１為輻射源，在２θ角為２０°～９０°范圍內掃描，用Ｘ射線衍射儀（ＸＰｅｒｔＰｒｏ ＭＰＤ，荷蘭）分析合成的納米銅粒子的晶體結構。

傅立葉紅外光譜儀（ＦＴＩＲ）檢測：納米銅粒子以干燥粉末形式與ＫＢｒ混合，壓片后暴露于紅外，波數(shù)范圍從４００～４０００ｃｍ－１對其進行傅里葉變換紅外光譜（ＦＴＩＲ，Ｎｉｃｏｌｅｔｎｅｘｕｓ４１０，美國）表征檢測。

１．２．４納米銅對尖鐮孢的抑制作用

將納米銅用無菌水配制成１００００ｍｇ／Ｌ的金屬納米粒子溶液，經過超聲充分溶解后，加入到ＰＤＡ培養(yǎng)基中，使最終濃度為２００ｍｇ／Ｌ。接入尖鐮孢菌餅，２８℃倒置培養(yǎng)７ｄ，測量菌落直徑，每處理３個重復。用血球計數(shù)法計數(shù)每皿中尖鐮孢的產孢量［２８］，每處理３個重復。

１．２．５Ｃｕ-ＮＰｓ對甜瓜枯萎病的防效

利用蘸根法接種尖鐮孢，當甜瓜幼苗高度約８～１０ｃｍ 時，將甜瓜根部劃傷浸于濃度約為１×１０６個／ｍＬ的孢子懸浮液中，１５ｍｉｎ后轉移至質量濃度為０、５０、１００ｍｇ／Ｌ和２００ｍｇ／Ｌ的Ｃｕ-ＮＰｓ水溶液中２８℃下培養(yǎng)，５ｄ后觀察并記錄感病情況。另設無菌水浸泡根部劃傷的甜瓜幼苗，并一直在水中培養(yǎng)為空白對照。每處理２０株幼苗，３次重復。按照曲明星等［２９］的方法計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

１．３數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用Ｅｘｃｅｌ２０１６進行初步整理、分析，用ＳＰＳＳ２１．０進行單因素方差分析（Ｏｎｅ-ｗａｙＡＮＯ-ＶＡ），用Ｄｕｎｃａｎ氏新復極差法進行多重比較，犘＜０．０５（０．０１）表示差異（極）顯著。

２結果與分析

２．１納米銅合成條件的優(yōu)化

木霉發(fā)酵液與ＣｕＳＯ 溶液混合后，銅離子被還原為納米銅粒子將會發(fā)生顏色變化，溶液顏色由橙黃色變?yōu)樽鼐G色，紫外可見光譜分析結果顯示，不同反應條件下獲得的Ｃｕ-ＮＰｓ的最大吸光度出現(xiàn)在３２５～４２５ｎｍ 之間（圖１），說明Ｃｕ-ＮＰｓ能夠在不同反應條件下合成，其最大吸收峰出現(xiàn)的位置不同，說明Ｃｕ-ＮＰｓ粒子的大小不同。一般認為吸收峰藍移，納米粒子粒徑變?。郏常埃?。納米粒子的粒徑越小其抗菌活性越大［１３］。納米粒子吸收峰越高說明合成的納米粒子的量越大［３１］。因此，我們在分析Ｃｕ-ＮＰｓ合成條件中將綜合這些指標來確定其較優(yōu)的合成條件。

底物ＣｕＳＯ濃度對木霉發(fā)酵液合成ＣｕＮＰｓ的影響見圖１ａ。３種濃度下都可合成ＣｕＮＰｓ，但隨著底物濃度增加峰值逐漸增高，說明Ｃｕ-ＮＰｓ的合成量增加。在底物濃度為１５ｍｍｏｌ／Ｌ時，吸收峰發(fā)生藍移，說明Ｃｕ-ＮＰｓ的粒徑變小，因此，１５ｍｍｏｌ／Ｌ是合成納米銅的最適濃度。溫度對Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影響見圖１ｂ。當溫度較高時會影響Ｃｕ-ＮＰｓ的合成。３５℃時，紫外吸收峰的峰值較高，且Ｃｕ-ＮＰｓ的特征吸收峰發(fā)生藍移，合成的Ｃｕ-ＮＰｓ粒徑較小，因此，３５℃是生物合成納米銅的最適溫度。溶液ｐＨ對Ｃｕ-ＮＰｓ合成的影響見圖１ｃ。強酸或強堿條件都不利于納米銅粒子的合成。中性條件下形成的峰較窄，ｐＨ９時形成的峰較寬，形成窄峰說明粒徑較為均一且粒徑較小，形成寬峰說明粒徑分布不均且粒徑較大，故ｐＨ７為納米銅合成的最適ｐＨ 條件。

２．２納米銅粒子的表征分析

為進一步明確合成的納米銅的形狀和大小，利用ＴＥＭ 對合成的Ｃｕ-ＮＰｓ進行表征分析（圖２）。結果表明，合成的納米銅多為球形或偽球形，分散性較好。優(yōu)化前Ｃｕ-ＮＰｓ的平均粒徑約７．８５ｎｍ，優(yōu)化后的平均粒徑約２．４５ｎｍ，說明優(yōu)化后Ｃｕ-ＮＰｓ粒徑變小。

Ｘ射線衍射（ＸＲＤ）分析Ｃｕ-ＮＰｓ的結晶特性表明，２θ角在２０°～８０°之間出現(xiàn)３個強特征衍射峰，對應的２θ值分別為４３．４１°、５０．６５°、７４．６０°，與銅Ｘ 射線衍射卡（ＰＤＦ＃０４ ０８３６）標準圖譜吻合，分別對應著（１１１）（２００）（２２０）３個晶面，表明Ｃｕ-ＮＰｓ結構是面心立方結構（圖３）。

ＦＴＩＲ分析能夠說明在Ｃｕ-ＮＰｓ合成和穩(wěn)定化中有生物大分子的參與。ＣｕＮＰｓ的ＦＴＩＲ分析（圖３）表明，在３３７９．７０、１６０５．２８、１４０４．３１、１０７８．８３、６１４．７４ｃｍ處出現(xiàn)紅外光譜吸收帶，其中３３７９．７０ｃｍ吸收峰為酚類和醇類的ＯＨ 的伸縮振動，１６０５．２８ｃｍ是由Ｃ＝Ｏ 化合物的羰基伸縮振動引起的特征峰，１４０４．３１ｃｍ是Ｃ-Ｎ 伸縮振動，１０７８．８３ｃｍ處是Ｃ-Ｏ 伸縮振動，６１４．７４ｃｍ是Ｃ-Ｃ 伸縮振動。由此可推測，木霉的某些代謝物在納米銅粒子合成過程中起還原作用，同時也可能起到穩(wěn)定納米銅粒子的作用。

２．３納米銅對尖鐮孢的抑制作用

長枝木霉合成的Ｃｕ-ＮＰｓ對尖鐮孢有明顯的抑制作用。由圖４可以看出Ｃｕ-ＮＰｓ影響了尖鐮孢菌落的生長，雖然菌落的直徑沒有顯著改變，但菌絲稀疏，菌落厚度較薄，產生的分生孢子少。對產孢量計數(shù)發(fā)現(xiàn)，Ｃｕ-ＮＰｓ顯著抑制尖鐮孢產孢，對照組產孢量為１．８８×１０個／ｍＬ，而Ｃｕ-ＮＰｓ處理的產孢量僅為為８．７３×１０個／ｍＬ。由此可以看出，Ｃｕ-ＮＰｓ能夠抑制尖鐮孢菌絲的生長，降低了菌絲量和產孢量。

２．４納米銅對甜瓜枯萎病的防效

接種尖鐮孢后，使用不同濃度的Ｃｕ-ＮＰｓ處理甜瓜苗，調查甜瓜幼苗的發(fā)病情況（表１）。結果表明，Ｃｕ-ＮＰｓ能夠降低甜瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)。Ｃｕ-ＮＰｓ的濃度在５０ｍｇ／Ｌ時，甜瓜的發(fā)病率為８６．６７％，病情指數(shù)為６３．３３，隨著Ｃｕ-ＮＰｓ濃度的增加，發(fā)病率和病情指數(shù)逐漸降低，當濃度為２００ｍｇ／Ｌ時，發(fā)病率降低為５３．３３％，病情指數(shù)降低為３３．３３。由此說明，Ｃｕ-ＮＰｓ能夠有效緩解甜瓜枯萎病的發(fā)病程度。

３結論與討論

納米技術在保障糧食安全生產中發(fā)揮著關鍵作用。納米材料可以用于肥料促進作物生長，提高產量；用于殺蟲（菌）劑實現(xiàn)病蟲害管理；用于傳感器監(jiān)測土壤質量和植物健康［３２］。納米材料合成過程中涉及多種化學品和雜質，可能會帶入到農業(yè)生產資料中，從而對農業(yè)系統(tǒng)造成負面影響［３３］，因此，選擇低成本、環(huán)境友好的生物合成方法是必要的，也是未來納米技術發(fā)展的方向［３４］。本研究選用絲狀真菌—長枝木霉生物合成納米銅，發(fā)現(xiàn)長枝木霉能夠有效合成納米銅，合成的Ｃｕ-ＮＰｓ在３２５～４２５ｎｍ處出現(xiàn)特征吸收峰［３５］，較優(yōu)的合成條件是ＣｕＳＯ 濃度為１５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７、溫度３５℃。合成的Ｃｕ-ＮＰｓ多呈球形或偽球形，為面心立方結構，平均粒徑為２．４５ｎｍ，其表面有多種官能團。納米銅合成后反應液的顏色由橙黃色轉變?yōu)樽鼐G色，顏色的變化是由于納米粒子溶液中的自由電子被激發(fā)，通過與光波共振的Ｃｕ-ＮＰｓ電子振動組合形成表面等離子體共振吸收（ＳＰＲ）帶［３６］，從而證實了納米銅的合成［３７］。優(yōu)化后合成的Ｃｕ-ＮＰｓ粒子經ＸＲＤ 分析有（１１１）（２００）（２２０）３個晶面，這與Ｖｉｅｔ等［３８］的研究結果一致。ＦＴＩＲ分析表明，木霉代謝產物中游離胺或半胱氨酸等基團與ＮＰｓ結合，起到穩(wěn)定納米粒子的作用［３９］。

納米銅的生物合成受到多種因素的影響，其中ＣｕＳＯ 濃度、反應溫度和ｐＨ 是人們常研究的關鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，隨著銅離子濃度增大，金屬納米粒子的合成量逐漸增大，超過一定濃度反而下降［４０］，我們的研究結果基本與之相同，較高濃度的ＣｕＳＯ有利于納米銅的合成，１５ｍｍｏｌ／Ｌ比較適合納米銅合成。ｐＨ 能夠影響金屬納米粒子的形狀和大小，納米銅的合成中，中性條件更有利于其合成［４１］，我們的研究結果與其一致。合成溫度影響ＣｕＮＰｓ質量和產量，在一定溫度范圍內，溫度升高能夠提高納米銅的合成量，但溫度過高反而降低合成量，這可能是溫度過高，生物大分子的活性降低或被降解造成的［４０］。我們研究發(fā)現(xiàn)，３５℃是合成納米銅的最佳溫度，與Ｅｌ-Ｓａａｄｏｎｙ等［４０］的研究結果一致。因此，底物濃度，溶液ｐＨ 和合成溫度均影響納米粒子的合成，且導致合成的納米粒子粒徑不同。另外，在優(yōu)化納米銅合成條件的過程中，也要考慮合成納米銅的抗菌活性，通過綜合評價納米銅產量及其抗菌活性來選擇合成方法。有研究表明，納米銅和納米銅前體［琥珀酸銅（Ⅱ）］的抗菌活性是有差異的［４２］，因此有可能合成Ｃｕ-ＮＰｓ和Ｃｕ-ＯＮＰｓ的混合物具有更高的抗菌活性，當然這些還需進一步設計試驗來驗證。

已有研究表明，納米銅對莖點霉、鏈格孢、彎孢菌和尖鐮孢等植物病原真菌都具有抗菌活性［２０］，能夠抑制這些真菌的生長，我們的研究結果與其基本一致，納米銅能夠抑制尖鐮孢菌絲生長，導致菌落稀疏、菌絲纖細，造成產孢量顯著減少。Ｒｕｂｉｎａ等［４３］的研究發(fā)現(xiàn)，納米銅對絲核菌犚．狊狅犾犪狀犻也產生同樣的效果，產孢量明顯減少。納米銅對甜瓜枯萎病的防效表明，納米銅能夠降低甜瓜枯萎病的發(fā)生和病情指數(shù)，說明納米銅可用于植物真菌病害的防治，但由于目前還缺乏系統(tǒng)性研究，造成納米銅還未真正在病害防治中應用。因此，在系統(tǒng)研究提高納米銅抗真菌活性的同時，應加強其在病害防治上的研究，以加速其在農業(yè)病害防治上的應用，同時還應該研究納米銅是否對甜瓜生長產生影響，分析納米銅的生物安全性。