姜 雯, 孫 博, 祝顯強(qiáng), 吳松權(quán), 全雪麗

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)為豆科黃芪屬多年生草本植物。黃芪在我國(guó)主要分布在內(nèi)蒙古、吉林、山西、甘肅、寧夏等省區(qū)[1]。黃芪中主要含有多糖、皂苷和黃酮3大類活性成分,具有增強(qiáng)免疫功能[2]、抗氧化、抗壓、保肝等多種功效,針對(duì)高血壓、臟器缺血[3]、腎病、糖尿病[4]均有較高的療效,臨床治療價(jià)值顯著。膜莢黃芪作為一種藥食同源植物,以野生為主,但由于近年來(lái)過(guò)度采挖,致使野生膜莢黃芪資源幾近枯竭,不能滿足人們的需求[5]。

植物細(xì)胞培養(yǎng)具有巨大的產(chǎn)生特定次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力[6],次生代謝產(chǎn)物是植物對(duì)抗外界脅迫的重要手段[7]。不定根培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)技術(shù)之一,可人為調(diào)控植物的生長(zhǎng)環(huán)境,避免病蟲害的侵襲,縮短栽培植物的生長(zhǎng)周期,且具有良好的遺傳穩(wěn)定性,所合成的有效化學(xué)成分可用于生產(chǎn)護(hù)膚品、藥物、食品添加劑等[8]。影響次生代謝產(chǎn)物含量的因素很多,如激素的種類配比和濃度[9],田文等[10]在東北刺人參不定根中添加SA提高了黃酮類和蒽醌類產(chǎn)物的積累;高彥云等[11]發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)體系中0.05 mmol/L正己醛能促進(jìn)黃芪不定根合成皂苷類物質(zhì)等。

芒柄花苷為黃芪中黃酮類化合物的代表性成分,具有促進(jìn)皮膚生長(zhǎng)、清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、維持血中NO濃度和保護(hù)缺血再灌注損傷、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性[12]。茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)常作為誘導(dǎo)子來(lái)提高藥用植物不定根中次生代謝物的含量。為提高膜莢黃芪不定根中芒柄花苷的含量,該研究以膜莢黃芪不定根為材料,研究了MeJA和SA對(duì)芒柄花苷積累的影響,為規(guī)模化生產(chǎn)芒柄花苷提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

參照J(rèn)in等[13]的方法,選擇生長(zhǎng)健壯的膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)不定根接至B5液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)32 d后進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 MeJA處理

在無(wú)菌環(huán)境下向培養(yǎng)40 d的黃芪不定根中分別加入0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L的MeJA,暗室振蕩培養(yǎng)5 d后進(jìn)行取樣;選擇最佳濃度的MeJA加到培養(yǎng)至0、8、16、24、32、40 d的黃芪不定根中,暗室振蕩培養(yǎng),第45天時(shí)統(tǒng)一取樣;依據(jù)結(jié)果在不定根繼代培養(yǎng)的最佳天數(shù)時(shí)加入0.2 mmol/L MeJA處理,分別培養(yǎng)2、4、6、8、10 d后取樣。

1.2.2 SA處理

同1.2.1.

1.2.3 協(xié)同處理

依據(jù)上述結(jié)果,在MeJA處理的最佳條件下分別加入0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L的SA,暗室振蕩培養(yǎng)5 d后取樣。以上試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù),將取出的樣品烘干后用于干重、芒柄花苷含量及產(chǎn)量的測(cè)定。

1.3 檢測(cè)方法

不定根干重測(cè)定:樣品采收后,用自來(lái)水反復(fù)沖洗3次,去除不定根表面殘留的培養(yǎng)液糖分后,用吸水紙將多余水分吸干并在50 ℃烘干箱中干燥48 h,待重量穩(wěn)定后測(cè)量干重。

參照李子羊等[14]的方法提取芒柄花苷,根據(jù)HPLC分析出的數(shù)據(jù)帶入芒柄花苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出芒柄花苷含量,產(chǎn)量公式如下:

芒柄花苷產(chǎn)量/(mg·瓶-1)=干重/(g·瓶-1)×芒柄花苷含量/(mg·g-1)

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS 20.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用Duncan新復(fù)極差法(P<0.05)進(jìn)行多重比較,利用Graphpad Prism 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA處理對(duì)芒柄花苷積累的影響

2.1.1 MeJA濃度對(duì)芒柄花苷積累的影響

添加5個(gè)濃度MeJA觀察其對(duì)芒柄花苷積累的影響(圖1),僅在0.4 mmol/L時(shí)顯著降低了不定根的干重,與對(duì)照相比減少了40%(圖1-A);過(guò)低的MeJA濃度(0.05 mmol/L)對(duì)芒柄花苷的含量沒有顯著影響,隨著濃度升高,在濃度為0.2 mmol/L時(shí)芒柄花苷含量達(dá)到最高,為0.308 mg/g,是對(duì)照含量的314%,之后增加MeJA濃度,芒柄花苷的含量有所下降,但仍然顯著高于對(duì)照(圖1-B)。MeJA濃度對(duì)芒柄花苷產(chǎn)量的影響與含量的變化相同,呈先升高后下降趨勢(shì),當(dāng)MeJA濃度為0.2 mmol/L時(shí),芒柄花苷的產(chǎn)量達(dá)到最高(圖1-C),為0.159 mg/瓶。

圖1 MeJA濃度對(duì)芒柄花苷積累的影響

2.1.2 MeJA添加時(shí)期對(duì)芒柄花苷積累的影響

不定根生長(zhǎng)至0、8、16、24、32、40 d時(shí)分別加入0.2 mmol/L MeJA。MeJA抑制了不定根的生長(zhǎng),并且這種抑制作用隨不定根生長(zhǎng)時(shí)期的增加逐漸減弱,至32 d時(shí)完全減弱,基本與對(duì)照持平(圖2-A);不定根生長(zhǎng)的任一時(shí)期外施MeJA對(duì)芒柄花苷的積累均有顯著的促進(jìn)作用,且隨著生長(zhǎng)時(shí)期的增加芒柄花苷的含量呈先上升后下降趨勢(shì),當(dāng)不定根生長(zhǎng)到第32天時(shí),添加芒柄花苷的含量達(dá)到最高(圖2-B),為0.429 mg/g;在黃芪不定根生長(zhǎng)的中后期施加MeJA能有效提高芒柄花苷產(chǎn)量,在第32天施加MeJA誘導(dǎo)的芒柄花苷產(chǎn)量達(dá)到最高(圖2-C),為0.225 mg/瓶。

圖2 MeJA添加時(shí)期對(duì)芒柄花苷積累的影響

2.1.3 MeJA處理時(shí)間對(duì)芒柄花苷積累的影響

與對(duì)照組相比,MeJA處理2、4、6、8、10 d時(shí)均顯著提高了芒柄花苷含量(圖3)。芒柄花苷含量隨處理時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)處理時(shí)間為6 d時(shí),芒柄花苷含量達(dá)到最高,為0.595 mg/g,比對(duì)照增加了540%。

2.2 SA處理對(duì)芒柄花苷積累的影響

5種濃度的SA處理對(duì)干重(圖4-A)、芒柄花苷含量(圖4-B)均無(wú)顯著差異,說(shuō)明SA處理對(duì)芒柄花苷的積累無(wú)作用。

圖4 不同濃度SA對(duì)芒柄花苷積累的影響

2.3 SA與MeJA協(xié)同處理對(duì)芒柄花苷積累的影響

在培養(yǎng)32 d的不定根中加入0.2 mmol/L MeJA和0～0.4 mmol/L SA時(shí),只有中濃度(0.1～0.3 mmol/L)SA才能促進(jìn)芒柄花苷的積累,并且SA濃度在0.1和0.2 mmol/L時(shí)芒柄花苷的含量達(dá)到最高(圖5),為0.812 mg/g,與對(duì)照(MeJA單獨(dú)處理)相比芒柄花苷含量增加了39%。

圖5 SA對(duì)MeJA誘導(dǎo)的芒柄花苷積累的影響

3 討論與結(jié)論

膜莢黃芪不定根培養(yǎng)是獲取芒柄花苷的可行途徑之一,但是其含量較低[15]。MeJA不僅誘導(dǎo)了黃芩苷的含量[16],還使總異黃酮含量增加[17]。由MeJA濃度對(duì)芒柄花苷積累的影響(圖1-B)可知,MeJA也具有顯著提高芒柄花苷含量的作用,其中,添加0.2 mmol/L MeJA時(shí)黃芪不定根中芒柄花苷的含量最多,而過(guò)高濃度的MeJA會(huì)影響芒柄花苷的積累,這可能是與高濃度的MeJA引起了氧化脅迫,抑制細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)[18]。有研究表明,在龍眼胚性懸浮細(xì)胞添加0.05 mmol/L MeJA時(shí)柯里拉京含量達(dá)到最高[19];在香菇菌板添加0.01 mmol/L MeJA時(shí)多糖積累量達(dá)到最高[20],說(shuō)明不同次生代謝產(chǎn)物積累所需的MeJA濃度有所不同。

MeJA誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物積累量也受到材料本身狀態(tài)和誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的影響。晏小霞等[21]的研究結(jié)果表明,姜黃素在姜黃種植190 d噴施MeJA時(shí)的積累達(dá)到最高;類黃酮和胡蘿卜素在莧菜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)第4天時(shí)添加MeJA,其含量達(dá)到最高[22]。此外,管桐等[23]報(bào)道,MeJA處理3 d后紅景天苷的含量和生產(chǎn)量達(dá)到最大值;采用土培法種植顛茄實(shí)生苗時(shí),MeJA處理28 d后莨菪堿和東莨菪堿含量達(dá)到最高[24]。說(shuō)明MeJA的添加時(shí)期和處理時(shí)間對(duì)次生代謝物的積累產(chǎn)生重要影響。該研究結(jié)果表明,利用0.2 mmol/L MeJA處理黃芪不定根時(shí),芒柄花苷積累達(dá)到最佳時(shí)的添加時(shí)期和處理時(shí)間分別為培養(yǎng)32 d(圖2)和處理6 d(圖3)。

SA對(duì)黃芪不定根中芒柄花苷的積累無(wú)顯著直接促進(jìn)作用(圖4)。但中濃度的SA(0.1～0.3 mmol/L)卻促進(jìn)了MeJA誘導(dǎo)的芒柄花苷積累的影響(圖5)。類似地,一定濃度的SA也分別促進(jìn)了MeJA誘導(dǎo)的假馬齒莧芽苦艾素A的積累[25]和MeJA誘導(dǎo)的顛茄莨菪堿與東莨菪堿的積累[26]?？梢酝茰y(cè)SA通過(guò)與MeJA協(xié)同作用提高了黃芪不定根中芒柄花苷的積累,該試驗(yàn)的最佳處理為培養(yǎng)32 d的不定根中加入0.2 mmol/L MeJA+0.1 mmol/L SA后處理6 d,芒柄花苷的含量與未處理的對(duì)照相比含量提高了726%。