李瑩瑩, 何夢玲, 姚尹伊, 黃煥超, 嚴(yán)寒靜, 張宏意

(廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院, 廣州 510006)

藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth.] 為唇形科刺蕊草屬的多年生草本,以干燥地上部分入藥,主要含百秋李醇、廣藿香酮等成分,具芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑等功效[1]。廣藿香廣泛用作中成藥原料,是藿香正氣水、抗病毒口服液等三十余種中成藥的主要成分。此外,廣藿香也是化妝品、定香劑和殺蟲劑等多種其他輕化工產(chǎn)品的重要原料[2]。目前藥用植物栽培中重金屬污染問題較為普遍,其中鎘污染問題尤為嚴(yán)重。鎘是土壤中分布最為廣泛且毒性較強(qiáng)的重金屬之一[3],當(dāng)土壤中的鎘被植物吸收并超過一定閾值時(shí),可引起植物產(chǎn)生應(yīng)激的生理生化反應(yīng),植物細(xì)胞膜系統(tǒng)被氧化破壞,植物生長受制,甚至可導(dǎo)致植物死亡。如種子萌發(fā)、植物生長、以及植物光合效率受到抑制、改變植物對土壤離子的吸收速率等。此外,在重金屬鎘脅迫下,植物次生代謝產(chǎn)物的合成以及相關(guān)基因的表達(dá)也會發(fā)生相應(yīng)的改變[4-6]。

依據(jù)商務(wù)部于2001年頒發(fā)的《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(WM/T2—2004)中有關(guān)藥用植物的重金屬限量標(biāo)準(zhǔn),張俊清[7]檢測了海南廣藿香中重金屬含量,發(fā)現(xiàn)海南萬寧、東方及瓊海三產(chǎn)區(qū)的廣藿香樣品中Cu、Pb、Cd存在不同程度的含量超標(biāo)。黃偉展等[8]測定了10個(gè)產(chǎn)區(qū)廣藿香藥材及其生境土壤中的重金屬含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)鎘是廣藿香土壤生境中主要的重金屬污染物之一。目前土壤重金屬污染日益嚴(yán)峻,會對植物的正常生長發(fā)育帶來影響。如延緩種子萌發(fā),抑制植物根、莖的伸長等[9]。同時(shí),重金屬脅迫還會改變植物體內(nèi)糖和蛋白質(zhì)的代謝,增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,對植物造成極大的損害[10-11]。此外,若藥用植物種植在重金屬超標(biāo)的土壤中,可能會使重金屬富集在植株體內(nèi),并通過食物鏈最終損害人類和動(dòng)物健康[12-13]。

在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上,現(xiàn)通過在土壤中添加6種不同濃度鎘溶液的方法脅迫廣藿香,并于處理后1、10、20、30 d 共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測其9個(gè)生理指標(biāo)的含量,對鎘脅迫下廣藿香的生理響應(yīng)特征進(jìn)行研究。以此為基礎(chǔ)深入研究廣藿香吸收以及轉(zhuǎn)運(yùn)Cd的關(guān)鍵基因提供研究基礎(chǔ),并為篩選培育鎘吸收少、富集少的品種提供理論依據(jù),同時(shí)為研究耐Cd廣藿香及其他中藥材品種的培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

供試材料為廣藿香幼苗,經(jīng)廣東藥科大學(xué)何夢玲副教授鑒定為唇形科植物廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.,實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于廣東藥科大學(xué)大學(xué)城校區(qū)中藥學(xué)院。選取生長兩個(gè)月且狀態(tài)近似的廣藿香幼苗,種植于混合土壤(黃泥土、營養(yǎng)土)中,在土壤中混入0、25、50、100、150、200 mg/kg的CdCl2水溶液,陰干后作為栽培土壤使用,每組10個(gè)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 株高、鮮重的測定

處理第1、10、20、30天后,用電子秤稱量每個(gè)樣品的鮮重;用卷尺測定每個(gè)處理組的株高,規(guī)定土上部分的高度即為株高。

1.2.2 抗氧化酶活性的測定

處理第1、10、20、30天后,用隨機(jī)混取法采集形態(tài)學(xué)上端第二、三對葉片作為研究材料,在液氮速凍后,置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑法[14]和過氧化物酶(peroxidase,POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[14],取保存的葉片組織于預(yù)冷的研缽,按照樣品:磷酸緩沖液(pH 7.5)1∶4的比例進(jìn)行研磨,制成勻漿后,轉(zhuǎn)入離心管中,4 ℃、12 000 r/min下離心20 min,上清液即為酶粗提液。

1.2.3 可溶性蛋白、丙二醛及過氧化氫含量的測定

可溶性蛋白(total protein,TP)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[14];丙二醛含量(malondialdehyde,MDA)測定采用硫代巴比妥酸法[14];過氧化氫(H2O2)含量測定采用分光光度法[14]。

1.2.4 葉綠素含量的測定

處理第1、10、20、30天后,采集廣藿香植株第二對葉片,按照樣品的質(zhì)量m與95%乙醇體積V的比例為m∶V= 1∶50,避光處理24 h后,在649 nm和665 nm的波長下測定溶液的吸光度值A(chǔ)649和A665[13]。葉綠素C含量計(jì)算公式為

C=(17.16A649+6.63A665)V/(100m)

(1)

式(1)中:C為葉綠素濃度,nmol/mg prot;V為溶液體積,L;m為樣品質(zhì)量,g。

1.3 廣藿香指標(biāo)性成分含量的測定

處理第1、10、20、30天后,采收每個(gè)處理組的樣品,室溫陰干后,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫,美國,7890 B-7000 D)聯(lián)用的方法對廣藿香樣品中百秋李醇、廣藿香酮含量進(jìn)行測定,測定參照羅可可[15]的方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23.0 2019 (IBM Inc.,美國)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用OriginPro 2019 b對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 Cd脅迫對廣藿香植株農(nóng)藝性狀的影響

鎘脅迫下廣藿香株高的變化如圖1所示。所有組別的植株株高均有增長,但處理組與對照組相比較,增長率降低。其中對照組株高增長量達(dá)9.51%,處理組(25、50、150 mg/kg組別)株高增長率分別為8.98%、6.93%、7.76%,處理組(100、200 mg/kg組別)株高增長率為4.15%、2.31%。與對照組株高具有顯著性差異。Cd對植物有較高的毒性。廣藿香植株的株高都有增長,但處理組增長量遠(yuǎn)小于對照組,說明鎘脅迫會抑制植株的生長發(fā)育,且隨著鎘脅迫濃度的增大,抑制效果更明顯。研究發(fā)現(xiàn)重金屬離子能通過阻止初生分生組織中的細(xì)胞分裂來影響植物形態(tài)的變化[16]。

同一處理時(shí)間不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05);樣品數(shù)n=3

鎘脅迫下廣藿香鮮重的變化如圖2所示。對照組鮮重始終呈上升趨勢,50、100 mg/kg的Cd脅迫的處理組植株鮮重雖然在處理初期有升高趨勢,但所有處理組鮮重最后均呈下降趨勢。鎘脅迫1 d后,各組的鮮重沒有顯著性差異,脅迫30 d后,對照組、25、50 mg/kg處理組與100、150、200 mg/kg處理組植株鮮重具有顯著性差異。Sahoo等[17]的研究結(jié)果表明,受到重金屬脅迫后,植物會減少對水分和養(yǎng)分的吸收,從而影響蒸騰作用、光合作用、呼吸作用等生理過程,最終抑制植物生長。對照組鮮重隨脅迫時(shí)間的延長逐漸升高,所有處理組的植株隨著鎘脅迫時(shí)間的延長,其鮮重均呈下降趨勢,其中高濃度處理組(150、200 mg/kg)30 d后鮮重降低至初始鮮重的40.14%、50.60%;而低濃度處理組(50、100 mg/kg)在處理初期,廣藿香植株的鮮重有一定程度的增長,說明低濃度的重金屬脅迫有一定程度的生長促進(jìn)作用;這與何雪等[18]在鎘對馬鈴薯植株生長影響的研究結(jié)果一致。Farzadar等[19]發(fā)現(xiàn),洋甘菊將重金屬Cd吸收至地上部分后,可能會導(dǎo)致地上器官中生長因子的減少,這可能也是廣藿香在脅迫后期鮮重降低的原因。

同一處理時(shí)間不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05);樣品數(shù)n=3

2.2 Cd脅迫對廣藿香抗氧化酶活性的影響

鎘脅迫下廣藿香葉片抗氧化酶活性變化如圖3和圖4所示。其中SOD酶活性變化見圖3,POD酶活性變化見圖4。可以看出,對照組SOD酶活性整體呈上升趨勢,除高濃度200 mg/kg Cd脅迫下SOD酶活力為下降趨勢外,其他處理組SOD酶活力均先升高后降低。對照組POD酶活力略有下降,但整體呈平穩(wěn)趨勢,低濃度25 mg/kg鎘脅迫的處理組POD酶活力在試驗(yàn)期間整體呈升高趨勢,其他處理組均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。鎘脅迫過程中,不同濃度處理組的廣藿香抗氧化酶活性均有上升的時(shí)間段,低濃度處理組促進(jìn)作用沒有高濃度處理組反應(yīng)迅速,同時(shí)高濃度處理組的鎘脅迫的抑制作用也會更明顯。

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05);樣品數(shù)n=4

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05);樣品數(shù)n=4

2.3 Cd脅迫對廣藿香可溶性蛋白、丙二醛以及過氧化氫含量的影響

鎘脅迫下廣藿香植株的可溶性蛋白含量變化見圖5,MDA含量變化見圖6,H2O2含量變化如圖7所示。對照組可溶性蛋白含量前20 d呈上升趨勢,20～30 d時(shí)下降。25 mg/kg Cd處理組可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢,50、100、200 mg/kg Cd脅迫下可溶性蛋白含量呈下降趨勢,但整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中各個(gè)組別各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品并沒有產(chǎn)生顯著性差異。所有組別的葉片MDA含量隨著脅迫時(shí)間的延長總體呈上升趨勢,處理10 d后,150、200 mg/kg處理組MDA含量與對照組有顯著性差異,處理30 d后,150、200 mg/kg處理組MDA含量與對照組有顯著性差異。H2O2含量變化趨勢整體與MDA含量變化趨勢相近。對照組H2O2含量隨時(shí)間的延長有較小程度的增長,其他各組H2O2含量均呈明顯的上升趨勢。對照組葉片在第一天時(shí)H2O2含量較高,在初期,鎘濃度越高H2O2含量越少,隨著脅迫時(shí)間的延長,200 mg/kg處理組在第30天時(shí)H2O2含量最高,增幅最大。

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05);樣品數(shù)n=4

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05);樣品數(shù)n=4

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05);樣品數(shù)n=4

2.4 Cd脅迫對廣藿香植株葉綠素含量的影響

鎘脅迫下廣藿香植株的葉綠素含量變化情況見圖8。25 mg/kg重金屬Cd脅迫下廣藿香葉綠素含量在第10天時(shí)降低,后又升高;50、200 mg/kg重金屬Cd脅迫下廣藿香葉綠素含量在第10天時(shí)升高,后又降低。100、150 mg/kg重金屬Cd脅迫下廣藿香葉綠素含量隨著脅迫時(shí)間的延長持續(xù)降低。鎘脅迫處理30 d后,對照組葉綠素含量與100、150、200 mg/kg處理組廣藿香植株的葉綠素含量產(chǎn)生了顯著性差異。

同一處理濃度不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05);樣品數(shù)n=4

重金屬脅迫會影響葉綠素含量。有研究認(rèn)為重金屬進(jìn)入植物組織后,會直接干擾葉綠素的生物合成,重金屬離子會使葉綠素酶的活性升高,從而造成葉綠素分解速度加快[32]。葉綠素生長代謝基礎(chǔ)是光合作用,其含量直接影響植物正常的新陳代謝效率[33-34]。植物葉綠素含量降低,光合作用的效率也會受到抑制[35-36]。隨著脅迫時(shí)間的延長和脅迫濃度的增加,廣藿香葉綠素含量的增長受到明顯的抑制作用,這與Cd2+脅迫對桑樹光合作用的影響結(jié)果基本保持一致[37]。

2.5 Cd脅迫對廣藿香植株指標(biāo)性成分含量的影響

由表1可知,不同濃度鎘脅迫后,百秋李醇含量呈上升趨勢,廣藿香酮含量呈下降趨勢。處理第1天時(shí),對照組與25、100、150、200 mg/kg處理組百秋李醇含量均有顯著性差異,處理第30天后,對照組與25、100 mg/kg處理組百秋李醇含量仍具有顯著性差異,但是與150、200 mg/kg的處理組不再具有顯著性差異。處理30 d后,對照組廣藿香酮含量減少了40.46%,其他處理組廣藿香酮含量分別減少了18.01%、39.93%、29.72%、57.58%、44.69%,有鎘脅迫濃度越高廣藿香酮減少量越大的趨勢。25 mg/kg處理組廣藿香酮含量與對照組具有顯著性差異。

表1 不同鎘濃度處理時(shí)間下廣藿香植株指標(biāo)性成分含量的變化(n=3)

重金屬Cd脅迫下可能會造成廣藿香植株體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物合成以及相關(guān)基因的表達(dá)都會發(fā)生相應(yīng)的改變[38]。廣藿香植株受到重金屬脅迫后,百秋李醇含量雖然有所增加,但與對照組相比增長量明顯減少,推測是Cd不同程度地抑制了合成途徑中次生代謝產(chǎn)物的合成。所有處理組別廣藿香酮含量都減少,因?yàn)榘偾锢畲己蛷V藿香酮合成中有共同的基因參與[39],因此廣藿香酮含量的減少既有在生長過程中,由于百秋李醇的增加而減少,也有受到Cd脅迫影響下的減少。目前關(guān)于重金屬脅迫下藥用植物有效成分含量的變化研究較少,重金屬脅迫下廣藿香有效成分含量變化的原因尚有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

運(yùn)用具有藥用價(jià)值的廣藿香作為原材料,探討了其在鎘脅迫下形態(tài)和生理指標(biāo)的變化,更加深入研究了其藥用有效成分的含量變化,為中成藥研究奠定了理論基礎(chǔ)。

(1)鎘對廣藿香株高具有顯著(P<0.05)抑制作用;在Cd脅迫25、50、100 mg/kg處理組,對廣藿香鮮重具有先促進(jìn)再抑制的作用,在Cd脅迫150、200 mg/kg處理組下對廣藿香鮮重具有顯著(P<0.05)抑制作用。

(2)鎘對廣藿香脅迫初期會激發(fā)廣藿香本身的抗逆能力,SOD酶活力在鎘25、50 、150 mg/kg作用下和POD酶活力在鎘25、100、150、200 mg/kg作用下,在1～10 d,均有不同程度的上升,在10～30 d,均有不同程度下降的趨勢,隨著脅迫濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長,抗氧化酶系統(tǒng)受到抑制,無法完全解決重金屬脅迫帶來的傷害,植株自身的生長會受到抑制,抗氧化酶活性會降低。

(3)25 mg/kg Cd處理組對廣藿香中可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢,其他處理組Cd脅迫下可溶性蛋白含量呈下降趨勢;MDA含量隨著脅迫時(shí)間的延長總體呈上升趨勢,處理30 d后,150、200 mg/kg處理組MDA含量與對照組有顯著性差異;隨著鎘脅迫時(shí)間的延長,200 mg/kg處理組在第30天時(shí)H2O2含量最高,增幅最大。

(4)鎘對廣藿香葉綠素含量具有顯著(P<0.05)減少作用,鎘脅迫處理30 d后,對照組葉綠素含量與100、150、200 mg/kg處理組廣藿香植株的葉綠素含量減少量最大。

(5)鎘對廣藿香的次生代謝產(chǎn)物也會受到影響,百秋李醇含量呈上升趨勢,但與對照組相比增量明顯減少。廣藿香酮含量呈下降趨勢。處理30 d后,對照組廣藿香酮含量減少了40.46%,其他處理組廣藿香酮含量分別減少了18.01%、39.93%、29.72%、57.58%、44.69%,有鎘脅迫濃度越高廣藿香酮減少量越大的趨勢。

綜上所述,鎘脅迫會對廣藿香生理狀態(tài)造成影響,且在低濃度、短時(shí)間鎘脅迫下,廣藿香生理狀態(tài)被激活,高濃度、長時(shí)間的鎘脅迫下,廣藿香生理狀態(tài)受到抑制。