鄭忻 曲妮妮 王麗娜 王國力 李思佳 秦一冰 姜玉潔 馬金娜

(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)一科/肺病一科,遼寧 沈陽 110032;2遼寧中醫(yī)藥大學(xué))

調(diào)查表明,慢性阻塞性肺疾病發(fā)病率每年以10%趨勢(shì)上漲,目前已經(jīng)成為全球排名第四位危害性疾病,慢性阻塞性肺疾病發(fā)病原因呈現(xiàn)多樣性,包括環(huán)境原因和自身原因〔1〕。慢性阻塞性肺疾病患者時(shí)常咳嗽、出現(xiàn)呼吸不順、胸口悶、易喘息等情況,會(huì)造成患者體內(nèi)肺組織的改變,甚至波及氣道,使肺泡受到損傷,從而加快平滑肌細(xì)胞(ASMCs)功能的紊亂和失調(diào),肺功能明顯降低〔2〕。而Janus激酶/轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號(hào)傳輸路徑與慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生密切有關(guān),慢性阻塞性肺疾病患者JAK/STAT信號(hào)傳遞路徑異?；钴S,STAT信號(hào)通路通過激酶反應(yīng)增加活性使自己磷酸化,特定靶基因受到磷酸化的STAT影響,開始轉(zhuǎn)錄功能,并誘導(dǎo)相關(guān)蛋白,影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡,抑制這一通路將成為治療慢性阻塞性肺病的新靶點(diǎn)〔3,4〕。加味二陳湯首次出現(xiàn)在《太平惠民和劑局方》中,具有中和理氣的作用,在改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能方面效果明顯〔5〕,但其作用機(jī)制尚不明確,本研究探討加味二陳湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及ASMCs的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)藥物 加味二陳湯中含麻黃6 g、半夏、姜10 g、葶藶子10 g、茯苓15 g、地龍10 g、陳皮10 g、黨參10 g、白術(shù)10 g、苦杏仁10 g、山藥10 g、干姜5 g、甘草6 g,所有中藥購自安徽援康中藥材種苗生產(chǎn)有限公司,敲碎,上述藥物加4 800 ml蒸餾水浸泡20 min后常規(guī)煎煮1.5 h。過濾藥液,濾渣再煎煮1次,合并兩次濾液,濃縮至0.5、1.0、2.0 g/ml,貯存于4 ℃冰箱備用。根據(jù)人體給藥比例換算大鼠給藥比例〔6〕,將加味二陳湯分為5、10、20 g/kg 3個(gè)劑量給大鼠灌胃。

1.2動(dòng)物 50只SPF級(jí)雄性大鼠(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體質(zhì)量(255±16.26)g,6月齡,購自遼寧省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證編號(hào):SCXK(遼)2018-0001,飼養(yǎng)溫度為22～26 ℃,相對(duì)濕度40%～60%,黑白晝夜交替(均12 h),動(dòng)物自由飲水與進(jìn)食。本試驗(yàn)經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)審核(批件號(hào):2019007)。

1.3試劑 Trizol試劑(浙江AMEKO公司,批號(hào):15140-122 ),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào):K1622),STAT3抗體(艾美捷科技有限公司,批號(hào):PAB7090),JAK3抗體(武漢恒意賽生物科技有限公司,批號(hào):ELK4794),RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(上海優(yōu)予生物科技有限公司,批號(hào):HS0612-2),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):C0105),胎牛血清(FBS,美國GIBCO公司,批號(hào):LOT#2036224C)。

1.4儀器 M276407 肺功能測(cè)定儀(北京中西華大科技有限公司),QTOWER2.2 PCR儀(西安歐拓機(jī)電設(shè)備有限公司),Chemi DocTMTouch imaging systerm凝膠圖像分析儀(成都百樂科技有限公司),BY/TD-3A離心機(jī)(北京海富達(dá)科技有限公司),RM2245石蠟切片機(jī)(德國萊卡公司);BX53型生物顯微鏡(奧林巴斯公司);1510酶標(biāo)儀(賽默飛世爾有限公司)。

1.5方法

1.5.1動(dòng)物建模 50只大鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組,采用氣管內(nèi)注入2次脂多糖(LPS)誘導(dǎo)+煙熏4 w建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型〔5〕,大鼠麻醉后仰臥固定并將1 μg/ml LPS 200 μl滴注入氣管中,注意防止窒息,持續(xù)給予2 w,同時(shí)準(zhǔn)備熏箱將大鼠放入,熏香煙煙霧8支/次,每天2次,連續(xù)4 w,正常對(duì)照組不需建立慢性阻塞性肺疾病模型,僅給予生理鹽水灌胃,連續(xù)2 w。

1.5.2肺功能檢測(cè) 灌胃2 w后麻醉大鼠,將器官分離置入Y型管,兩端分別與流速、壓力傳感器連接,再連接至小動(dòng)物呼吸機(jī)上,維持平靜呼吸3 min并連接Maclab數(shù)據(jù)分析系統(tǒng),3 min后給予一定氣量充氣模仿深呼吸,利用微機(jī)處理計(jì)算大鼠肺功能指標(biāo)包含用力呼氣量/用力肺活量(FEV0.3/FVC)、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)及呼吸指數(shù)(RI)。

1.5.3ASMCs細(xì)胞收集 肺功能測(cè)定完畢后,處理大鼠分離葉支氣管,剪成1 mm×1 mm消化后加入DMEM液,用200目過濾網(wǎng)過濾,離心,保留沉淀細(xì)胞,用100 U/ml青霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,精細(xì)分離處理得到大鼠氣道平滑肌塊,切碎后置入37 ℃培養(yǎng)箱中加入500 μl DMEM高糖+20% FBS的培養(yǎng)基,培養(yǎng)4 h,收集4～6代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。小鼠平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(actin),免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定為ASMCs。

1.5.4HE染色 取肺組織標(biāo)本采用標(biāo)本刀切成4 mm的標(biāo)本,采用甲醛固定60 min,進(jìn)行脫水,浸蠟,制片,厚度為3～4 μm,蘇木素和伊紅染色液復(fù)染分別為6～8 min和10 s,與顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)。按照Mikaw方法〔7〕對(duì)肺組織病理進(jìn)行半定量評(píng)分,具體可分為4類:肺泡結(jié)構(gòu)、肺上皮細(xì)胞、管腔情況及炎性細(xì)胞浸潤,其中0分為無病變、1分為輕度病變、2分為中度病變、3分為重度病變,各項(xiàng)評(píng)分之和為肺組織病理得分。隨機(jī)抽取各組北航醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)截取圖片,測(cè)量其平滑肌的厚度,求其均值。

1.5.5RT-PCR檢測(cè)ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA表達(dá) ASMCs細(xì)胞總RNA采用Trizol法來提取,總RNA提取反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,按全說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn),用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對(duì)JAK3、STAT3 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),qPCR引物由生工生物公司合成,內(nèi)參采用GAPDH,60 ℃,10 min、95 ℃、72 ℃,各 30 s、95 ℃,5 min,循環(huán)40次,以ImageJ等軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,用相對(duì)定量2-ΔΔCt計(jì)算目的基因JAK3、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列為:JAK3正向:5′-CTCCTTCCGAGC-CGTCAT-3′,反向:5′-CTCCCGCTGAGTCCT-3′;STAT3正向:5′-GCGGC-AGTTTCTGGCCCCTT-3′,反向:5′-CGGGCCACAATCCGGGCAAT-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)正向:5′-GGGAAACTGTGG-CGTGAT-3′,反向:5′-GAGTGGG TGTCGCTGTTGA-3′。

1.5.6Western印跡檢測(cè)ASMCs中JAK3、STAT3蛋白表達(dá) ASMCs細(xì)胞加入100 μg的胰蛋白酶裂解30 min,10 000 r/min 4 ℃離心5 min,取上清液,用5×上樣緩沖液混合于PBS稀釋蛋白樣品中,按照4∶1的比例進(jìn)行,然后在沸水浴中煮沸5 min,采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20 μg,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。緩沖液配制好后要放入4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷,然后全部轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再把脫脂奶粉加入,全程封閉時(shí)長為1 h,然后加入一抗(稀釋比例1∶500,購自沈陽萬類生物科技有限公司)后,TTBS漂洗3 次,每次10 min;4 ℃過夜,加入辣根根過氧化物酶標(biāo)記二抗(稀釋比例1∶2 500,購自沈陽萬類生物科技有限公司),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,加于膜上,使用Image-Pro Plus v6軟件分析JAK3、STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1加味二陳湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的影響 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組肺功能顯著降低,FEV0.3/FVC、Cdyn值明顯降低,RI值明顯升高(P<0.001);加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組肺功能均明顯優(yōu)于模型對(duì)照組,且加味二陳湯20 g/kg組肺功能改善最顯著(均P<0.05)。見表1。

表1 加味二陳湯對(duì)慢性阻塞性肺病大鼠肺功能、氣道平滑肌和ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

2.2加味二陳湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道平滑肌的影響 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組氣道平滑肌厚度顯著提高(P<0.001);與模型對(duì)照組比較,加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組氣道平滑肌厚度均明顯降低,且加味二陳湯20 g/kg組大鼠氣道平滑肌厚度降低最顯著(P<0.05),提示慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道壁顯著增厚。見表1。

2.3加味二陳湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.001);與模型對(duì)照組比較,加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低,且加味二陳湯20 g/kg組ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)降低更顯著(P<0.05)。見表1、圖1。

1～5:正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組圖1 加味二陳湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠ASMCs中JAK3、STAT3 蛋白表達(dá)的影響

2.4加味二陳湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織病理學(xué)觀察 正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)完整,無毛細(xì)血管出血、水腫、炎性細(xì)胞出現(xiàn)；模型對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)不完整,大小不均,肺組織間有輕微毛細(xì)血管充血,肺間質(zhì)輕微水腫,肺泡腔也存在炎性細(xì)胞;而加味二陳湯20 g/kg組肺泡結(jié)構(gòu)、毛細(xì)血管充血程度、肺間質(zhì)水腫程度及炎性細(xì)胞浸潤明顯少于加味二陳湯5 g/kg組和加味二陳湯10 g/kg組。見圖2。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組肺組織病理半定量評(píng)分為〔(1.17±0.23)分、(2.39±0.57)分、(1.91±0.52)分、(1.68±0.44)分、(1.36±0.31)分〕。與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組肺組織病理半定量評(píng)分明顯升高(P<0.001);與模型對(duì)照組相比,加味二陳湯5 g/kg組、加味二陳湯10 g/kg組、加味二陳湯20 g/kg組肺組織病理半定量評(píng)分均明顯降低(均P<0.05),且呈藥物依賴性。

圖2 各組肺組織病理學(xué)(HE染色,×200)

3 討 論

慢性阻塞性肺疾病是以氣流限制為特征的肺疾病,臨床上存在不完全可逆的進(jìn)行性發(fā)展,對(duì)患者的生存質(zhì)量及日常勞動(dòng)造成巨大的影響,增加患者及家屬的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究表明,我國慢性阻塞性肺疾病患者逐年增多,2015年我國有33萬人患有慢性阻塞性肺疾病且因其死亡,已經(jīng)成為危害我國國民身體健康的嚴(yán)重病癥之一〔8〕。慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病原較為多樣且影響因素較多,有環(huán)境原因和自身原因,外在因素有長時(shí)間吸煙等,自身因素可能與家族遺傳有關(guān)系,因此采取有效方法治療慢性阻塞性肺疾病顯得至關(guān)重要〔9〕。

本研究說明,加味二陳湯可改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及氣道平滑肌厚度。FEV0.3/FVC是評(píng)價(jià)肺功能的重要指標(biāo),慢性阻塞性肺疾病存在肺組織病理學(xué)改變,因氣流阻塞、小呼吸指數(shù)增高、Cdyn下降,降低肺功能,RI是能夠反映肺通氣和氧交換功能,可作為評(píng)價(jià)呼吸功能減低的一個(gè)指數(shù),參與慢性阻塞性肺疾病的進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn),慢性阻塞性肺疾病大鼠平滑肌細(xì)胞增長較快,平滑肌增厚能夠影響慢性阻塞性肺疾病大鼠的氣道重塑,且與大鼠肺功能及Cdyn水平有顯著的關(guān)系〔10〕。李才元等〔11〕研究加味二陳湯能夠有效抑制體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞活性及有絲分裂反應(yīng),在慢性阻塞性肺疾病大鼠使用加味二陳湯進(jìn)行治療可以有效控制氣管重塑,降低呼吸指數(shù),改善FEV0.3/FVC水平。有研究通過體外建立哮喘小鼠模型,給予加味二陳湯干預(yù),結(jié)果顯示小鼠氣道厚度、平滑肌面積等均有所改善,肺功能顯著提升,其通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1及組蛋白去乙?；?基因表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)抑制哮喘小鼠的氣道重塑的作用機(jī)制,且FEV0.3/FVC、呼吸阻抗及氣道重塑之間相輔相成,關(guān)系密切,說明加味二陳湯對(duì)于哮喘小鼠氣道重塑及肺功能改善有重要作用〔12,13〕。

相關(guān)研究證實(shí),加味二陳湯通過氣道上皮細(xì)胞、ASMCs、局部炎癥細(xì)胞對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者發(fā)揮治療作用,對(duì)氣道具有良好的局部抗炎癥作用,減輕患者氣道黏膜炎癥反應(yīng),改善平滑肌厚度,提高患者肺功能〔14〕。加味二陳湯中白術(shù),可入脾經(jīng),發(fā)揮補(bǔ)脾、益陰的作用,亦能固精,白術(shù)可提高人的抗病能力,并可擴(kuò)張血管促進(jìn)血液循環(huán),對(duì)急性或慢性炎癥有顯著的改善作用,而湯中地龍、黨參是擴(kuò)張血管,促進(jìn)血液循環(huán)的良藥提高機(jī)體免疫的良藥〔15〕。甘草首次出現(xiàn)在《神農(nóng)本草經(jīng)》中,書中記載了甘草的諸多藥用機(jī)制,如滋潤肺腑、清火氣、解毒,現(xiàn)代研究也證明甘草可防治肺炎、調(diào)節(jié)免疫等作用〔16〕。這與本研究相符。研究發(fā)現(xiàn),慢性阻塞性肺疾病會(huì)造成患者體內(nèi)肺組織的改變,甚至波及氣道使肺泡受到損傷,可以加快氣道〔17,18〕。JAK/STAT是機(jī)體內(nèi)的一條重要通路,JAKs、STATs與平滑肌細(xì)胞的凋亡增殖分化有密切的關(guān)系,同時(shí)在不同細(xì)胞因子的刺激下異?；罨?發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)生作用〔19〕。目前發(fā)現(xiàn)JAK主要有JAK1、JAK2、JAK3等,STAT是 JAKs的作用底物,有STAT1、STAT2、STAT3等多種表現(xiàn)形式。研究表明,慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生發(fā)展和JAK/STAT信號(hào)通路的異?；罨嘘P(guān),慢性阻塞性肺疾病發(fā)生時(shí)JAK/STAT通路被激活,STAT的成分發(fā)生磷酸化,JAK/STAT通路殘端亞基附著形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄,與其他信號(hào)通路共同作用參與疾病發(fā)展〔20〕。STAT3蛋白是一種異?；钴S的轉(zhuǎn)錄因子,通過與JAK3激酶反應(yīng)增加活性使自己磷酸化,特定靶基因受到磷酸化的STAT3影響,開始轉(zhuǎn)錄功能,同時(shí)促進(jìn)ASMCs增殖,加快氣道重塑反應(yīng)〔21,22〕。氣道病變過程中JAK/STAT信號(hào)在ASMCs增殖中有重要作用,在機(jī)體細(xì)胞免疫、氣道反應(yīng)中發(fā)揮重要職能,而加味二陳湯治療時(shí)能明顯提升慢性阻塞性肺疾病患者的肺功能,能長期抑制氣道平滑肌的收縮,對(duì)氣道擴(kuò)張作用持久〔23〕。余仙娟等〔24〕通過建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型,給予保肺定喘干預(yù)后,結(jié)果表明保肺定喘湯可通過降低JAK、STAT1、STAT3表達(dá)水平來抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺血管重構(gòu),提高大鼠肺功能,降低呼吸指數(shù)〔24〕。JAK/STAT信號(hào)通路參與、調(diào)控多種組織、細(xì)胞、器官的生長發(fā)育,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,加味二陳湯中含有甘草、白術(shù)等多種中藥,對(duì)慢性阻塞性肺疾病有很好的治療效果,其作用機(jī)制可能與JAK-STAT信號(hào)通路活性受到抑制有關(guān)〔25,26〕。

綜上,加味二陳湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠有明顯治療作用,能顯著提高大鼠肺功能,其作用機(jī)制可能與抑制ASMCs中JAK/STAT信號(hào)活性有關(guān)。后期將通過給予JAK/STAT抑制劑進(jìn)一步對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠進(jìn)行干預(yù),探究加味二陳湯、JAK/STAT及慢性阻塞性肺疾病三者的作用機(jī)制。