張曉靜, 林培彬, 歐文倩

弗里德賴(lài)希共濟(jì)失調(diào)(friedreich ataxia,FRDA)是由編碼Frataxin (FXN)蛋白的基因出現(xiàn)隱性突變引起的神經(jīng)退行性疾病[1,2],為最常見(jiàn)的遺傳性共濟(jì)失調(diào)。FRDA的病理改變首先發(fā)生在背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)伴隨感覺(jué)神經(jīng)元丟失,其次是脊髓、后柱、錐體和脊髓小腦束軸索變性和神經(jīng)元丟失[3]。Frataxin基因第一個(gè)內(nèi)含子中三聯(lián)體GAA擴(kuò)增導(dǎo)致Frataxin蛋白水平降低[4,5]。Frataxin是一種參與鐵硫簇和血紅素生物合成的線粒體蛋白[6]。研究表明,Frataxin表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致DRG和小腦齒狀核神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激、線粒體鐵積累和相應(yīng)的細(xì)胞死亡[7]。迄今為止,FRDA尚無(wú)有效治療方法,很重要的原因就是缺乏合適的FRDA動(dòng)物模型且其發(fā)病機(jī)制不清楚。根據(jù)GAA三核苷酸序列重復(fù)數(shù)目不同,目前主要有3種轉(zhuǎn)基因FRDA小鼠模型,包括YG8R、YG22R和YG8sR[8]。研究發(fā)現(xiàn),3種轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性都會(huì)逐漸下降,但YG8R小鼠的損傷程度最為顯著[9]。然而,先前的研究,一方面由于FRDA轉(zhuǎn)基因小鼠需長(zhǎng)時(shí)間飼養(yǎng),導(dǎo)致對(duì)模型小鼠FXN的神經(jīng)表型分析不夠徹底,包括從未測(cè)試FRDA小鼠的步態(tài)異常變化;另一方面對(duì)FRDA小鼠不同時(shí)間不同行為學(xué)差異并不清楚。因此,本研究將以YG8R小鼠為研究對(duì)象,進(jìn)一步分析不同時(shí)間YG8R小鼠的運(yùn)動(dòng)行為學(xué)及病理差異,為進(jìn)一步明確YG8R小鼠的給藥時(shí)間及藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑、耗材和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

TRIzol試劑、SYBR Green I核酸凝膠染料、Random primer、High Capacity RNA-to-cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛公司;多聚甲醛購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠;異氟烷購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司;PBS粉末、乙醇、氯仿、異丙醇、Nuclease-free H2O購(gòu)自Sigma公司;引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成;Anti-NeuN抗體購(gòu)自abcam公司;過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自CST公司;免疫組化試劑購(gòu)自上海碧云天生物公司。

B6.Cg-Fxntm1MknTg YG8Pook/J (Strain #:012253)轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自Jackson Laboratories公司;所有小鼠均按照暨南大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)管理規(guī)程飼養(yǎng),房間溫度(23±2) ℃,濕度為50%～70%,房間12 h光照/12 h黑暗交替,小鼠自由進(jìn)食和飲水,所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前至少適應(yīng)5 d,實(shí)驗(yàn)分為兩組,野生對(duì)照組(WT組)和YG8R組,每組均含雌性小鼠8只,雄性小鼠8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體重記錄 利用大小鼠體重稱(chēng)量天平(上海玉研科學(xué)儀器有限公司),每月稱(chēng)量記錄一次各組小鼠體重(g)。

1.2.2 加速轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估小鼠的協(xié)調(diào)平衡能力。將小鼠放在旋轉(zhuǎn)棒(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)上,旋轉(zhuǎn)速度從4 r/min逐漸增加到40 r/min,記錄4 min內(nèi)每只小鼠從棒上掉落的時(shí)間。重復(fù)測(cè)量3次,每次間隔10 min,取3次結(jié)果的平均值作為該小鼠的在棒時(shí)間,每2個(gè)月檢測(cè)一次。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估小鼠的自發(fā)行為活動(dòng)量及運(yùn)動(dòng)軌跡。將小鼠置于礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)中,啟動(dòng)自主攝影系統(tǒng)記錄小鼠在箱內(nèi)的活動(dòng),每只小鼠連續(xù)記錄5 min,軟件分析小鼠運(yùn)動(dòng)總距離。重復(fù)測(cè)量3次,每次實(shí)驗(yàn)間隔10 min,取3次結(jié)果的平均值作為評(píng)估值,每2個(gè)月檢測(cè)一次。

1.2.4 四肢抓力實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估小鼠的四肢肌肉力量。將小鼠置于抓力板(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)中央臺(tái),輕輕拉動(dòng)小鼠尾部,記錄小鼠抓力最大值。重復(fù)3次,每次間隔5 min,取3次結(jié)果的平均值作為評(píng)估值,每2個(gè)月檢測(cè)一次。

1.2.5 步態(tài)檢測(cè) MSI DigiGait動(dòng)物步態(tài)成像分析系統(tǒng)(MOUSE SPECIFICS公司)是一個(gè)完整的定量評(píng)估鼠類(lèi)模型中動(dòng)物腳步和步態(tài)的工具。將小鼠放于傳送帶上,儀器速度設(shè)置為20 r/min,記錄5 s,分析小鼠的步態(tài)長(zhǎng)度、步寬、觸地和擺動(dòng)時(shí)間。

1.2.6 免疫組化染色 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),切取脊髓組織,4%多聚甲醛固定后,利用全自動(dòng)脫水機(jī)(德國(guó)徠卡公司)進(jìn)行脫水,石蠟包埋后,切片,厚度5 μm,二甲苯脫蠟復(fù)水后,經(jīng)檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)后,5%BSA封閉,加入一抗稀釋液稀釋的抗Neuro N抗體(1∶1000稀釋),4 ℃冰箱放置過(guò)夜,第二天PBS清洗后加入二抗,最后將組織片放入蘇木素染液中,染色2 min,PBS清洗,經(jīng)酒精脫水和二甲苯透明后,加入中性樹(shù)膠封片,干燥后,利用熒光顯微鏡分別在100X和200X拍照。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用Trizol試劑從小鼠DRG和小腦中提取總的RNA,根據(jù)High Capacity RNA-to-cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)制備cDNA。使用Applied Biosystems實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(賽默飛公司)和SYBR Green探針檢測(cè)人類(lèi)轉(zhuǎn)基因FXN mRNA表達(dá)水平。FXN正向引物:5’-TTGAAGACCTTGCAGACAAG-3’和 FXN反向引物:5’-AGCCAGATTTGCTTGTTTGG-3’,GAPDH正向引物:5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’,GAPDH反向引物:5’-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3’。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 YG8R小鼠體重未發(fā)生顯著變化 每間隔1個(gè)月稱(chēng)量一次小鼠體重,不同時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠體重?zé)o顯著差異(見(jiàn)圖1)。

2.2 YG8R小鼠在棒時(shí)間顯著下降 每2個(gè)月測(cè)量一次小鼠的在棒時(shí)間(見(jiàn)圖2),從第4個(gè)月開(kāi)始,與WT組相比,YG8R小鼠的在棒時(shí)間明顯下降(P<0.05)。

圖2 各組小鼠在棒時(shí)間比較。與WT組相比*P<0.05

2.3 YG8R小鼠運(yùn)動(dòng)距離顯著下降 每2個(gè)月測(cè)量一次小鼠的自主運(yùn)動(dòng)距離,對(duì)自主運(yùn)動(dòng)軌跡(見(jiàn)圖3A)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(見(jiàn)圖3B),從第4個(gè)月開(kāi)始,與WT組相比,YG8R小鼠的運(yùn)動(dòng)距離明顯下降(P<0.05)。

A:自主運(yùn)動(dòng)軌跡;B:運(yùn)動(dòng)總距離(% of WT)。與WT組相比*P<0.05和***P<0.001。

2.4 YG8R小鼠抓力顯著下降 每2個(gè)月測(cè)量一次小鼠的前肢抓力(見(jiàn)圖4)。從第4個(gè)月開(kāi)始,與WT組相比,YG8R小鼠的抓力明顯下降(P<0.05)。

與WT組相比*P<0.05和****P<0.0001。

2.5 YG8R小鼠步態(tài)異常 在第6個(gè)月,檢測(cè)各組小鼠步態(tài)情況(見(jiàn)圖5)。與WT組相比,YG8R小鼠左后肢和右后肢步長(zhǎng)距離顯著下降(P<0.05),YG8R小鼠兩前肢和兩后肢步寬顯著增加(P<0.01),右后肢的擺動(dòng)時(shí)間顯著下降(P<0.01),左后肢及右后肢觸地時(shí)間顯著增加(P<0.05)。

與WT組相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001。

2.6 YG8R小鼠脊髓神經(jīng)元數(shù)量及脊髓中Frataxin mRNA水平下降 免疫組化檢測(cè)脊髓神經(jīng)元損傷情況(見(jiàn)圖6A、圖6B)。YG8R小鼠脊髓中神經(jīng)元數(shù)量顯著降低(P<0.01);利用qRT-PCR檢測(cè)FRDA小鼠GAA重復(fù)擴(kuò)增對(duì)脊髓和DRG中FXN表達(dá)的影響(見(jiàn)圖6C),與WT組相比,YG8R小鼠脊髓和DRG中FXN mRNA水平均顯著降低(P<0.0001)。

與WT組相比**P<0.01和****P<0.0001。

3 討 論

目前臨床前研究主要使用具有不同重復(fù)次數(shù)GAA三聯(lián)體擴(kuò)增的人類(lèi)FXN轉(zhuǎn)基因小鼠,其中YG8R小鼠的損傷程度更為顯著。然而,現(xiàn)有研究缺乏對(duì)YG8R小鼠不同時(shí)間運(yùn)動(dòng)及病理改變的研究。嚙齒類(lèi)動(dòng)物在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間長(zhǎng)度是衡量耐力、平衡協(xié)調(diào)、身體狀況和運(yùn)動(dòng)情況的評(píng)價(jià)指標(biāo),轉(zhuǎn)棒檢測(cè)對(duì)評(píng)價(jià)小腦功能障礙特別敏感[10]。開(kāi)放場(chǎng)檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)測(cè)試,用于確定嚙齒動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的一般活動(dòng)水平、總體運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和探索習(xí)慣[11]。

研究發(fā)現(xiàn),從4～12個(gè)月,YG8R小鼠的體重顯著增加,在棒協(xié)調(diào)能力顯著降低,平均速度及運(yùn)動(dòng)總距離顯著降低,同時(shí)YG8R小鼠的抓力明顯下降[8]。這與我們的研究相一致,我們推測(cè)體重增加可能是YG8R小鼠運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)的重要原因之一;同時(shí)不同腦區(qū)Frataxin表達(dá)差異導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)不同運(yùn)動(dòng)差異表型。一般來(lái)說(shuō),步態(tài)是由運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、基底神經(jīng)節(jié)、丘腦、中腦、髓質(zhì)、腦橋、小腦和脊髓中央模式發(fā)生器之間的復(fù)雜通訊控制的[12,13]。步態(tài)異常與額葉皮質(zhì)、基底節(jié)、海馬、小腦和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的損傷特別相關(guān)[14]。足跡分析結(jié)果顯示,與B6和Y47R對(duì)照相比,FRDA小鼠的步態(tài)模式不均勻,步幅長(zhǎng)度顯著降低[8]。

我們的研究發(fā)現(xiàn),在第6個(gè)月,與WT小鼠相比,YG8R小鼠的左后肢和右后肢步長(zhǎng)距離顯著下降,YG8R小鼠兩前肢和兩后肢步寬顯著增加,右后肢的擺動(dòng)時(shí)間顯著下降,左后肢及右后肢觸地時(shí)間顯著增加。這將進(jìn)一步提供一種新的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)手段,能夠檢測(cè)FRDA小鼠中Frataxin水平降低的表型后果,使它們能夠接受新的治療策略。

綜上,考慮到可以進(jìn)行的不同功能研究,我們建議將步態(tài)測(cè)試作為評(píng)估這些FRDA小鼠協(xié)調(diào)能力的有價(jià)值測(cè)試,其操作簡(jiǎn)單,可提供良好的重現(xiàn)性和顯著的統(tǒng)計(jì),通過(guò)評(píng)價(jià)小鼠步態(tài)異常為將來(lái)臨床針對(duì)性治療FRDA提供幫助。

研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),Frataxin表達(dá)減少使細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激、線粒體鐵積累,導(dǎo)致DRG和小腦齒狀核神經(jīng)元細(xì)胞死亡,進(jìn)而出現(xiàn)進(jìn)行性共濟(jì)失調(diào)、肌肉無(wú)力和感覺(jué)障礙等癥狀[8,15～17]。與內(nèi)源性小鼠水平相比,YG22R和YG8R FRDA小鼠表達(dá)的人類(lèi)Frataxin水平相對(duì)降低。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn),在YG8R小鼠的脊髓中神經(jīng)元數(shù)量顯著降低;與WT組小鼠相比,YG8R小鼠脊髓和DRG中Frataxin mRNA水平均明顯下降,這與相關(guān)研究報(bào)道相一致。因此,我們認(rèn)為導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)障礙的更重要原因是脊髓及DRG中Frataxin表達(dá)降低,導(dǎo)致線粒體功能障礙、氧化損傷和鐵積累,進(jìn)一步導(dǎo)致脊髓和小腦的齒狀核神經(jīng)元死亡。綜上,FRDA小鼠模型中已確定的運(yùn)動(dòng)功能缺陷可能是由于Frataxin水平降低,從而誘導(dǎo)了類(lèi)似FRDA的運(yùn)動(dòng)障礙。

總之,本研究進(jìn)一步明確了FRDA小鼠的運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)缺陷是由不穩(wěn)定的GAA重復(fù)序列引起的,導(dǎo)致Frataxin水平降低,這為增加Frataxin療法帶來(lái)了新的希望。研究還進(jìn)一步證實(shí)了YG8R小鼠作為基于GAA重復(fù)的理想FRDA小鼠模型,適用于研究多種不同的治療策略,其中包括可能使用鐵螯合劑和抗氧化劑,優(yōu)先針對(duì)線粒體,以及旨在上調(diào)Frataxin表達(dá)的新型藥物。